SAFE - Scuola di Scienze Agrarie, Forestali, Alimentari ed Ambientali. School of Agriculture, forest, Food and Environmental sciences

Transcript

1 Protocollo SAFE Determinazione dell attività antiossidante Valutazione della resistenza allo stress ossidativo in presenza di perossido d idrogeno Soluzione di perossido d idrogeno 1,6 M. Esporre i campioni alle concentrazioni di H 2 O 2 da testare (partendo dalla soluzione 1,6 M) per 30 minuti alla temperatura ottimale di crescita. Inoculare in Weissella Medium Broth (WMB) 20 g/l di glucosio (previa diluizione di 10 volte in tampone potassio fosfato ph 7 per ridurre l effetto dell H 2 O 2 ) e incubare alla temperatura ottimale per 24 ore. H 2 O 2 302, , Nocivo se (codice Sigma 31642) ingerito. Provoca gravi lesioni Soluzione H 2 O 2 1,6 M , oculari. Provoca grave irritazione oculare SAFE_antiossidante RGI/EP 1

2 Valutazione della resistenza allo stress ossidativo in presenza di pyrogallolo Il pyrogallolo è un generatore di superossidi. Preparare una soluzione acquosa di pyrogallolo 400 mm. Esporre i campioni alle concentrazioni di pyrogallolo da testare (partendo dalla soluzione 400 M) per 30 minuti alla temperatura ottimale di crescita. Inoculare in Weissella Medium Broth (WMB) 20 g/l di glucosio (previa diluizione di 10 volte in tampone potassio fosfato ph 7 per ridurre l effetto dell H 2 O 2 ) e incubare alla temperatura ottimale per 24 ore. pyrogallolo (codice Sigma ) Soluzione pyrogallolo 400 mm 302, 312, 332, 341, , 312, 332, 341, , 280 Nocivo se ingerito. Nocivo per contatto cn la pelle. Nocivo se inalato. Sospettato di provocare alterazioni genetiche. Nocivo per gli organismi durata 273, 280 Nocivo se ingerito. Nocivo per contatto cn la pelle. Nocivo se inalato. Sospettato di provocare alterazioni genetiche. Nocivo per gli organismi durata SAFE_antiossidante RGI/EP 2

3 Valutazione della resistenza allo stress ossidativo in presenza menadione Il menadione è un generatore di superossidi. Preparare in etanolo puro una soluzione di menadione 50 mm. Addizionare in piastre Petri le diverse concentrazioni di menadione (partendo da quella 50 mm) al substrato Weissella Medium Agar (WMA) in rapporto 1:10, inoculare per spandimento il campione da testare e incubare per 48 ore alle condizioni ottimalo di crescita. menadione (codice Sigma M5625) etanolo (codice 02860) Soluzioni menadione 50 mm, 25 mm, 12,5 mm, 6,75 mm, 3,375 mm 302, 315, 319, , Nocivo se ingerito. Provoca irritazione cutanea. Provoca grave irritazione oculare. Può irritare le vie respiratorie Liquido e vapori facilmente infiammabili Il substrato WMA va preparato da ricetta: Triptone potassio diidrogeno fosfato estratto di lievito glucosio anidro sodio acetato sodio citrato 5 g 1 g 10 g 20 g 5 g 5 g SAFE_antiossidante RGI/EP 3

4 magnesio solfato eptaidrato* manganese solfato monoidrato* Tween 80 Agar Acqua 0,2 g 0,05 g 0,5 ml 12 g 1 L ph 6,8 * Il Magnesio Solfato Idrato e Manganese Solfato Idrato possono essere sostituiti da 10 ml della seguente diluizione: 2 g di Magnesio Solfato Idrato mg di Manganese Solfato Idrato in 100 ml di H2O distillata. Sterilizzare a 1 atm, 121 C per 15 minuti. WMA, gli ingredienti non sono pericolosi, tranne quelli elencati sotto manganese solfato 373, Può provocare idrato danni agli organi in caso di esposizione prolungata o ripetuta. Tossico per gli organismi SAFE_antiossidante RGI/EP 4

5 Valutazione della riduzione dei radicali liberi mediante il saggio del DPPH (2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl; Li et al., 2012) Il DPPH è un radicale azotato caratterizzato da una colorazione rosso porpora, che decolora quando viene ridotto in presenza di una molecola dotata di capacità antiossidante. Preparare in etanolo puro una soluzione di DPPH 0,2 mm. Addizionare 0,5 ml di biomassa lavata DO=1 con 1 ml di DPPH 0,2 mm, incubare 30 minuti al buio a temperatura ambiente, centrifugare per 10 minuti a 6000 rpm, recuperare il surnatante e misurare l assorbanza a 517 nm. DPPH (codice Sigma D9132) etanolo (codice 02860) Soluzione di DPPH 0,2 mm 317, , 280, Può provocare una reazione allergica cutanea. Può provocare sintomi allergici o asmatici o difficoltà respiratorie se inalato Liquido e vapori facilmente infiammabili SAFE_antiossidante RGI/EP 5

6 Valutazione della riduzione dei radicali ossidrili mediante il saggio della fenantrolina (Sun et al., 2013) Reagenti Miscelare 0,5 ml di fenantrolina 0,75 mm, 1 ml PB7,4, 0,5 ml di FeSO 4 0,75 mm, 0,5 ml di H 2 O 2 0,12 % e 0,5 ml biomassa lavata DO=1, incubare per 90 minuti a 37 C, centrifugare per 10 minuti a 6000 rpm, recuperare il surnatante e misurare l assorbanza a 536 nm. Fenantrolina (codice Sigma ) Soluzione fenantrolina 0,75 mm Tampone potassio fosfato 20 mm ph 7,4 (PB7,4) FeSO 4 Soluzione di FeSO 4 0,75 mm H 2 O 2 (codice Sigma 31642) 301, , , Tossico se 501 ingerito. Molto tossico per gli organismi , 501 Molto tossico per gli organismi 302, , Nocivo se ingerito. Provoca gravi lesioni oculari. Soluzione H 2 O 2 0,12% Miscela , 501 Molto tossico per gli organismi SAFE_antiossidante RGI/EP 6