Iter diagnostico PAZIENTE. Ipotesi diagnostica. Richiesta esami di laboratorio. Risultati esami di laboratorio. Conferma di ipotesi diagnostica
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- Fabiola Randazzo
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1 Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica A.A Introduzione alla biochimica clinica. Gli esami di laboratorio vengono effettuati allo scopo di ottenere informazioni sullo stato di salute dei pazienti o la presenza di eventuali malattie. Possono venire eseguiti in strutture altamente organizzate (laboratori centralizzati) situate all interno di ospedali e di centri di salute in cui operano medici, biologi, e tecnici specializzati. La richiesta di esami di laboratorio deve essere effettuata da parte del medico che segue il paziente e deve essere preceduta da una valutazione clinica accurata. In pratica durante il colloquio col paziente il medico raccoglie una serie di informazioni sullo stato di salute passato (anamnesi patologica remota) o attuale (anamnesi patologica prossima) e procede all esame obiettivo del malato eventualmente con l ausilio di metodiche strumentali. Iter diagnostico PAZIENTE Anamnesi, E.O. Esami strumentali Ipotesi diagnostica Richiesta esami di laboratorio Risultati esami di laboratorio Conferma di ipotesi diagnostica Solo a questo punto, dopo aver formulato un ipotesi diagnostica preliminare, si procede alla richiesta degli esami di laboratorio. Vengono quindi raccolti i campioni biologici da analizzare (sangue, urine, liquido cefalorachidiano, ecc.) e si inviano al laboratorio di analisi. Il medico del laboratorio comunica al collega clinico o direttamente al paziente i risultati degli esami richiesti, indicando per ciascun composto dosato i suoi valori di riferimento (intervallo di valori attesi nel caso di soggetto sano) e la possibilità di ulteriori approfondimenti diagnostici. Il documento che riporta i risultati degli esami effettuati si chiama referto. I risultati degli esami di laboratorio servono a preparare il referto, cioè una relazione scritta che deve contenere l'indicazione degli eventuali dati patologici; essendo un atto
2 medico, con valore anche legale, esso deve riportare sempre la data e la firma del responsabile. Il laboratorio normalmente è suddiviso in sezioni ciascuna delle quali si occupa del dosaggio di una sostanza particolare o di un campione biologico particolare. Esistono così le sezioni di chimica clinica, ematologia e coagulazione, enzimologia clinica, diagnostica immunologica, citodiagnostica e citogenetica, tossicologia clinica, dosaggio dei farmaci, allergologia, citofluorimetria ed esame urine. Esiste la possibilità di richiedere esami d'urgenza che devono essere effettuati entro pochi minuti dalla richiesta (es. per l infarto cardiaco). La necessità di effettuare un gran numero di esami ogni giorno ha portato allo sviluppo di apparecchiature automatiche e computerizzate quali gli autoanalizzatori, i citofluorimetri, i contaglobuli elettronici, ecc. che sono in dotazione di qualsiasi laboratorio centralizzato. Campioni biologici e caratteristiche generali degli analiti. I campione biologici che possono essere prelevati dal paziente per la determinazione dei composti di interesse diagnostico sono molteplici. Campione. É qualunque liquido o tessuto prelevato dal paziente sul quale il laboratorio esegue un dosaggio analitico Sangue Urina Liquido cefalorachidiano Liquido seminale Liquido amniotico Feci Escreato Succo gastrico / duodenale Sudore Biopsie Analita. É qualunque costituente del campione dosabile in laboratorio In biochimica clinica prende il nome di analìta qualsiasi sostanza, contenuta in un campione biologico, che può essere determinata qualitativamente o quantitativamente. In generale, «determinare quantitativamente» significa scegliere una grandezza campione, che si chiama unità di misura, e determinare quante volte l unità di misura è contenuta nella grandezza da misurare. Il numero che esprime la misura è il rapporto tra la grandezza in esame e l unità di misura scelta. La scelta delle unità di misura viene fatta a livello internazionale da organizzazioni tra cui la Federazione Internazionale di Chimica Clinica (IFCC). La concentrazione di una data sostanza in un liquido si esprime come massa della sostanza nell unità di
3 volume: l unità di massa è il chilogrammo, l unità di volume è il litro (L), quindi l unità di concentrazione è il kg/l. Sono usati i sottomultipli: grammi per litro (g/l) e milligrammi per litro (mg/l). Caratteristiche dei test di laboratorio (test di screening e test di conferma). Gli esami di laboratorio possono essere distinti in test di screening e test di conferma. I primi servono per identificare potenziali malati o individui a rischio nell ambito di una data popolazione. Devono essere test molto sensibili, rapidi, poco costosi e in grado di poter essere applicati ad un gran numero di soggetti. Un test di conferma serve quando il test di screening è risultato positivo e si deve accertare l effettiva presenza nel soggetto testato della condizione patologica o del fattore di rischio. Deve essere un test ad elevata specificità. I test possono essere inoltre designati al monitoraggio della terapia farmacologica. E importante che gli esami di laboratorio non siano richiesti prima della formulazione di un ipotesi diagnostica, soprattutto ora che sono disponibili decine e decine di esami laboratoristici sofisticati. Questo modo di procedere è scorretto: la richiesta di un esame laboratoristico dovrebbe avvenire solo dopo che il medico ha raccolto i dati anamnesici ed eseguito l esame obiettivo del paziente. Fase preanalitica (modalità di prelievo e trasporto del campione, variabilità preanalitica). Oltre alla malattia esistono altri fattori che possono alterare i risultati di un esame di laboratorio. Nell interpretazione dei risultati è importante considerare tutta una serie di variabili che intervengono prima dell esecuzione del test in laboratorio e che sono note come variabili pre-analitiche. La variabilità preanalitica è dovuta a fattori esterni al paziente e occorre prendere tutte le misure necessarie per minimizzarne gli effetti, al fine di ottenere risultati accurati e riproducibili. Un discorso a parte merita la variabilità biologica che è dovuta a fattori inerenti al paziente e che possono essere più o meno controllabili. Tra i fattori che possono influenzare il risultato di un test di laboratorio vi sono la dieta e l eventuale assunzione di farmaci; nei giorni precedenti l esame occorre quindi avvertire il paziente di astenersi da modifiche drastiche del regime dietetico e di sospendere l assunzione di medicine se queste possono interferire in qualche modo con i risultati del test. Una dieta ricca di proteine e di basi puriniche ad esempio può far aumentare la concentrazione di acido urico, urea ( azotemia ) e ammoniaca rispetto a una dieta vegetariana. L età, il sesso e l appartenenza ad un determinato gruppo etnico possono influenzare alcuni parametri biochimici: la fosfatasi alcalina viene prodotta dal tessuto osseo in accrescimento e quindi tende ad avere valori più elevati nei bambini
4 mentre diminuisce dopo la pubertà. La creatinina e la creatina cinasi, marcatori del tessuto muscolare, tendono ad essere in media più elevati negli uomini, i quali hanno in genere una massa muscolare più sviluppata rispetto alle donne. Anche il momento della giornata in cui viene effettuato il prelievo è importante in quanto esistono delle variazioni cosiddette circadiane di alcuni analiti, cioè variazioni in base all alternanza giorno/notte, come il cortisolo ad esempio. Anche i valori glicemici ottenuti durante un test da carico orale tendono ad essere più elevati quando l esame viene effettuato nel pomeriggio rispetto a quando viene effettuato di mattina. Alcuni ormoni sono influenzati anche da un ritmo mensile, basti pensare agli ormoni ipofisari femminili (FSH, LH). Anche l abitudine cronica al fumo può influenzare alcuni valori, ad esempio dell esame emocromocitometrico: si ha un aumento dell emoglobina, della carbossiemoglobina, del numero e del volume dei globuli rossi, del numero di globuli bianchi, etc. Gli sforzi fisici, specie se prolungati, possono far aumentare l attività degli enzimi muscolari come creatina cinasi, lattato deidrogenasi e aspartato amintransferasi. Abbastanza rilevanti sono gli effetti legati alla posizione del soggetto (effetti posturali): il volume del sangue circolante col soggetto seduto è inferiore di circa 600 ml rispetto alla posizione supina. Infatti nel soggetto seduto dai capillari fuoriesce liquido privo di proteine; in posizione supina il liquido interstiziale viene richiamato nel compartimento vascolare e il volume aumenta. Queste variazioni avvengono in tempi compresi tra 5 e 20 minuti. Di conseguenza quando il prelievo viene effettuato col soggetto in posizione seduta si ha un aumento del 5-15% delle macromolecole (albumina!) e degli elementi cellulari. Ciò non si verifica ovviamente per le piccole molecole (glucosio!) che possono passare tranquillamente attraverso la parete vasale. Questi effetti posturali sono particolarmente accentuati nei pazienti edematosi. Dopo il prelievo entrano in gioco altre variabili che possono influenzare il risultato dell esame: l uso di un anticoagulante appropriato, la conservazione del campione e il suo trasporto al laboratorio. E importante evitare stress meccanici, p.es l applicazione di un laccio emostatico troppo stretto o troppo a lungo durante il prelievo, oppure l agitazione delle provette durante il trasporto del campione. Questo tipo di stress meccanici possono dar luogo ad emolisi, cioè alla rottura dei globuli rossi con fuoriuscita di emoglobina e di altre sostanze. Se il sangue deve essere conservato allo stato fluido è importante usare provette contenenti un appropriato anticoagulante (EDTA, citrato, eparina, NaF). Alcuni di questi anticoagulanti possono determinare importanti artefatti che sono riportati nella diapositiva.
5 Tappo rosso / giallo oro ADDITIVO FUNZIONAMENTO IMPIEGO Nessuno Il sangue coagula e il siero viene separato mediante centrifugazione Chimica clinica, sierologia, banche biologiche Nel fondo della provetta è presente un gel che separa il siero/plasma Tappo verde ADDITIVO FUNZIONAMENTO IMPIEGO Litio Eparina Il sangue viene reso incoagulabile dall eparina; il plasma viene separato dal gel che riempie il fondo della provetta Chimica clinica Tappo viola ADDITIVO FUNZIONAMENTO IMPIEGO EDTA Chela il calcio inattivando le reazioni dei fattori della coagulazione Emocromo. Il prelievo deve essere completo. Capovolgere delicatamente 8-10 volte per prevenire formazione di coaguli e aggregati piastrinici Tappo azzurro chiaro ADDITIVO FUNZIONAMENTO IMPIEGO Sodio citrato Forma sali di calcio Emocoagulazione (PT, PTT, INR). Prelievo completo
6 Accuratezza e precisione di un test diagnostico. L esame di laboratorio consiste in una serie di procedure analitiche che devono possedere caratteristiche di affidabilità, cioé devono garantire una certa sicurezza e plausibilità dei risultati ottenuti. Esistono dei concetti ben definiti, quelli di accuratezza e precisione, che servono a definire le caratteristiche di un esame di laboratorio qualsiasi. L accuratezza equivale al grado di concordanza tra il valore ottenuto durante un test ed il valore vero e dipende dal metodo di analisi impiegato. Naturalmente non si conosce il valore vero, che è un valore teorico, ma una buona approssimazione è data dal valore determinato mediante un metodo di riferimento proposto e standardizzato da organismi internazionali. Ogni metodo di analisi è tanto più accurato quanto più i valori con esso ottenuti si avvicinano ai valori del metodo di riferimento. La precisione è una misura della variabilità intrinseca del medoto di analisi e si valuta in base al grado di concordanza tra misure ripetute. E noto il paragone classico tra metodo analitico e funzionamento del tiro al bersaglio. Nella figura sottostante è rappresentato un metodo preciso ma inaccurato (i colpi sparati sono vicini tra di loro ma piuttosto lontani dal centro, che rappresenta il valore vero ), un metodo accurato ma impreciso (i colpi in media sono disposti intorno al centro ma sono troppo dispersi) e infine un metodo sia preciso che accurato. In laboratorio esistono delle procedure, note complessivamente come controllo di qualità, che servono a minimizzare inaccuratezza e imprecisione e che comportano l uso di sieri di controllo, cioè campioni appositamente predisposti con quantità note di vari componenti e sottoposti ad analisi contemporaneamente ai sieri dei pazienti.
7 Sensibilità, specificità e valore predittivo di un test diagnostico. Fase analitica e post-analitica. Dopo aver ottenuto un risultato di laboratorio, occorre interpretarlo. A tale scopo occorre tener conto di due caratteristiche fondamentali degli esami di laboratorio che sono la sensibilità e la specificità. La sensibilità indica la capacità di un test diagnostico di laboratorio di individuare le persone realmente affette da una certa malattia sul totale degli individui esaminati. Quanto maggiore è il numero di persone affette in cui si riscontra un risultato alterato tanto più si dice che l esame è sensibile. Un altro modo per esprimere il concetto di sensibilità è indicare la percentuale dei veri positivi sulla somma dei veri positivi e dei falsi negativi. Per veri positivi si intende il numero di malati che hanno un test positivo; viceversa, per falsi positivi si intendono quei soggetti che pur non essendo malati hanno un test positivo (nessun test è perfetto al 100%!). Analogamente i veri negativi sono quei soggetti che non essendo affetti dalla malattia hanno appunto il test negativo; falsi negativi sono i soggetti che hanno il test negativo pur essendo affetti dalla malattia. La sensibilità di un test di laboratorio è quindi: VP Sensibilità = VP + FN La sensibilità è quindi la capacità di un test di individuare tutti i malati evitando che qualcuno di questi sia definito come sano. In un test ideale la sensibilità è uguale ad 1, cioé non dovrebbero esserci falsi negativi. Al crescere del numero di FN la sensibilità assume un valore compreso tra 0 ed 1. La specificità è invece il rapporto tra i veri negativi cioé il numero dei soggetti non malati nei quali il test è negativo e il numero di tutti coloro che non sono affetti dalla malattia: VN Specificità = FP + VN La specificità è quindi la capacità di un test di individuare i veri sani: solo i pazienti malati danno valori positivi. All'aumentare del numero di FP la specificità (che idealmente è 1) diminuisce. Purtroppo un aumento della sensibilità si accompagna sempre ad una diminuzione della specificità: quindi un metodo molto sensibile sarà poco specifico e viceversa. Di fronte ad un test che risulta positivo per una certa malattia ci si chiede quale sia la probabilità che il paziente sia effettivamente affetto da quella malattia. A tale scopo viene in aiuto il valore predittivo positivo (VPP) che dà un idea del potere diagnostico del test in questione. Il VPP può essere espresso
8 come percentuale dei malati che ha il test positivo, vale a dire: VP Valore predittivo positivo = FP + VP Esiste anche il valore predittivo negativo, che corrisponde alla probabilità che, anche col test negativo, il paziente sia comunque affetto dalla malattia per diagnosticare la quale l'esame è stato eseguito. Il valore predittivo del test negativo è uguale alla percentuale dei soggetti sani col test negativo. Dato che i risultati di un esame di laboratorio, da soli, non sono assolutamente certi essi devono essere integrati con i dati clinici per aumentare la probabilità di formulare una diagnosi corretta. Se prima di prescrivere qualsiasi esame si conosce la probabilità che il paziente sia affetto da una certa malattia e conosce la sensibilità e la specificità dell'esame in questione potrà calcolare le probabilità a posteriori di avere quella malattia. La predittività di uno stesso esame varia a seconda della prevalenza della malattia nella popolazione. Intervalli e valori di riferimento. L interpretazione dei risultati di laboratorio è un caso speciale di decisione fatta per confronto con un valore decisionale, un valore precedente o un intervallo di riferimento. Nel caso del valore decisionale non c è un intervallo di valori, esistono invece valori soglia (cut-off) ovvero valori limite dei parametri misurati oltre ai quali tali parametri sono considerati anormali e comportano delle decisioni cliniche. Nel caso del criterio del valore precedente la decisione medica si prende per confronto con i risultati di un test eseguito in precedenza sul paziente. Nel caso dell intervallo di riferimento si definisce di un insieme di valori ottenuto dall osservazione o dalla misura di un particolare analita su individui di riferimento, vale a dire individui selezionati per confronto usando criteri ben definiti indicati da organismi internazionali. Devono essere soggetti sani, che non presentano patologie. Per ciascuno dei parametri presi in esame ciò che viene fornito al medico curante è un valore numerico che va confrontato con un intervallo di valori compresi tra un limite inferiore ed un limite superiore, entro cui si fa rientrare la normalità: al di fuori dei limiti fissati dall intervallo di riferimento il risultato è da considerare patologico. La cosiddetta normalità dei parametri di laboratorio è un concetto astratto: oggi si preferisce perciò il termine, già menzionato, di valori di riferimento, cioè valori relativi ad una popolazione di riferimento. I valori patologici sono quelli che eccedono l'intervallo di valori di riferimento e che sono riconosciuti come tali per la loro plausibilità clinica.
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