INTRODUZIONE. cellule isolate dal loro ambiente e messe in condizioni di vivere all'interno di un sistema definito

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2 INTRODUZIONE Colture cellulari: Modelli in vitro cellule isolate dal loro ambiente e messe in condizioni di vivere all'interno di un sistema definito le cellule vengono poste a contatto di tutti i fattori e metaboliti necessari alla loro crescita

3 COLTURE CELLULARI Batteri Lieviti Colture di cellule vegetali Colture primarie di cellule animali Colture secondarie Linee cellulari

4 COLTURE CELLULARI Henrietta Lacks ( ) Involontariadonatricedicellule tumorali della cervice uterina Coltivate dal Dr George Otto Gey

5 COLTURE CELLULARI

6 COLTURE CELLULARI: CAMPI D APPLICAZIONE Esempi di indagine Studi funzionali e di regolazione Ambito Controllo crescita e metabolismo, analisi differenziamento Biologia cellulare Ingegneria tessutale (coltura e produzione in vitro di porzioni di tessuto) Produzione di cellule staminali Estrazione di acidi nucleici e proteine Studio di espressione genica e analisi di mutanti Diagnosi cliniche cariologiche (anche prenatali) Caratterizzazione di tumori Test di citotossicità (droghe, farmaci, inquinanti) Produzione di proteine ricombinanti (ingegneria genetica) Produzione di Ab monoclonali (ibridomi) Biologia molecolare Citogenetica Oncologia Farmacologia Biotecnologia e Immunologia

7 COLTURE CELLULARI Vantaggi Sistemi semplificatied altamente riproducibili; Consentono l analisi dei meccanismi cellulari e molecolari del fenomeno in esame; Controllo dell ambiente di crescita; Economicità e rapidità di risposta; Disponibilità di tipi cellulari; No problemi etici e legali (riduzione nel numero di animali sacrificati) Svantaggi Sistemi semplificatirispetto ad un organismo integrato; Condizioni di esposizionealle sostanze diverse da quelle in vivo; Difficoltà di correlarele concentrazioni con quelle in vivo; Le sostanze inoculate possono interagire con il terreno di coltura Costo elevato Instabilità genetica Expertise

8 TIPI DICOLTURE Sub-coltivazione

9 COLTURE PRIMARIE tessuto Tessuto sminuzzato per separare le singole cellule Sospensione cellulare Terreno di coltura Le cellule aderiscono alla piastra di coltura e crescono ricoprendone il fondo Cellule seminate in terreno di coltura Coltura primaria Tappeprincipali per ottenere una Le derivano direttamente da un tessuto od un organo per dissociazione meccanica o proteolitica (tripsina + EDTA) delle singole componenti cellulari

10 tessuto Tessuto sminuzzato per separare le singole cellule Sospensione cellulare Terreno di coltura Cellule seminate in terreno di coltura COLTURE PRIMARIE Le derivano direttamente da un tessuto od un organo per dissociazione meccanica o proteolitica (tripsina + EDTA) delle singole componenti cellulari Le cellule aderiscono alla piastra di coltura e crescono ricoprendone il fondo Coltura primaria Da queste si originano Le cellule vengono rimosse e seminate a minore densità in una seconda piastra Coltura secondaria che mantengono le caratteristiche delle cellule d origine e che possono subire al massimo alcune decine di passaggi

11 COLTURE PRIMARIE Mostrano proprietà differenziate corrispondenti alla loro origine Fibroblasti producono collagene Muscolari striate si fondono a formare fibre Muscolari cardiache si contraggono ritmicamente Nervose formano assoni e sinapsi Epiteliali formano un monostrato compatto e ordinato

12 COLTURE PRIMARIE le cellule isolate riflettono con maggiore probabilità le attività biochimiche delle cellule in vivo vita limitata, ripetuti isolamenti per progetti a lungo termine COLTURA PRIMARIA a BREVE termine COLTURA PRIMARIA a LUNGO termine < 10 duplicazioni duplicazioni

13 EVOLUZIONE DI UNA LINEA CELLULARE IN COLTURA Tra la semina e la ripresa della crescita c è un intervallo. Il grafico mostra l evoluzione del logaritmo del numero di cellule nel tempo La coltura primaria è caratterizzata da un tempo di duplicazione lento, che aumenta notevolmente nei successivi passaggi in coltura Nella terza fase si nota la senescenza, con tempi di duplicazione progressivamente più lunghi(sino alla morte), a meno che (porzione arancione) non intervenga una trasformazione, che produce una linea cellulare immortalizzata in grado di replicarsi indefinitamente

14 TRASFORMAZIONE DELLE CELLULE IN COLTURA Il processo della trasformazione rende immortalile cellule in coltura LINEA CELLULARE Immortalizzazione acquisizione da parte della linea cellulare della capacità di proliferare indefinitamente

15 TRASFORMAZIONE DELLE CELLULE IN COLTURA

16 LINEE CELLULARI Derivano da colture secondarie IMMORTALIZATE ALTERAZIONI: NELLA MORFOLOGIA (perdita di antigeni specifici ) NELLA FISIOLOGIA (minori esigenze nutrizionali, perdita dell inibizione da contatto e della dipendenza dell ancoraggio) NEL CORREDO CROMOSOMICO (aneuploidia, poliploidia, eteroploidia etc)

17 LINEE CELLULARI Linee cellulari a vita finita Resistono in coltura un numero limitato di cicli cellulari; crescono in monostrato risentendo dell inibizione da contatto; fortemente dipendenti da fattori di crescita presenti nel siero. Linee cellulari continue (trasformate) hanno origine da mutazioni (spontanee o indotte con agenti chimici o biologici) a partire da colture primarie o da linee cellulari a vita finita; possono essere ottenute da tumori. Presentano minore dipendenza da fattori del siero e minore inibizione da contatto. Linee cellulari clonali sono linee cellulari derivanti da una singola cellula; servono per ottenere una popolazione il più possibile omogenea.

18 LINEA CELLULARE CONTINUA cellule più facili da coltivare, risposte riproducibili con risultati meno variabili delle colture primarie possono perdere alcune caratteristiche proprie delle cellule in vivo Le cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle cellule cancerose

19 Coltura Secondaria COLTURA PRIMARIA a BREVE termine COLTURA PRIMARIA a LUNGO termine < 10 duplicazioni duplicazioni Linea Cellulare Continua > duplicazioni

20 TIPI DI COLTURE CELLULARI Sulla base della loro origine le cellule in coltura possono crescere: - ADESE(cellule epiteliali, fibroblasti, ecc.) - IN SOSPENSIONE(cellule del sangue) Cellule adese Cellule in sospensione

21 DIPENDENZA DALL ANCORAGGIO Attacco indispensabile per la proliferazione

22 DIPENDENZA DALL ANCORAGGIO Le cellule aderiscono ad un substrato e crescono fino a confluenza La crescita cessa in risposta a segnali inibitori dell ambiente: Esaurimento fattori di crescita Contatto con cellule circostanti

23 INIBIZIONE DELLA CRESCITA

24 INIBIZIONE DELLA CRESCITA

25 INIBIZIONE DELLA CRESCITA BASSA DENSITA CELLULARE ALTA DENSITA CELLULARE

26 Coltura cellulare derivata da cellule separate da un tessuto

27 MANTENIMENTO DELLE CELLULE IN COLTURA -Disponibilità di un numero elevato di sostanze (zuccheri, aminoacidi, lipidi, vitamine, ioni ecc.) - Controllo e mantenimento dei parametri chimico-fisici dell'ambiente incui le cellule sitrovano: ph osmolarità concentrazione di anidride carbonica e ossigeno Temperatura substrato adeguato per il loro ancoraggio 1. contenitori di plastica opportunamente trattata(fiasche e piastre da coltura) 2. in presenza di specifici mezzi di coltura (detti anche terreni di coltura) liquidi che contengono disciolte le quantità appropriate delle sostanze necessarie 3. in incubatori che sono in grado di mantenere controllata la temperatura, la pressione parziale dell'anidride carbonica e l'umidità

28 PIASTRE DI COLTURA Sono generalmente in polistirene la loro superficie è chimicamente trattata per renderla idrofila e carica negativamente (per favorire i legami stabili con i fattori di adesione presenti nel siero) Piastre Petri Fiasca con tappo ventilato Superficie: cm 2 Piastre multipozzetto (multiwell: pozzetti)

29 CARATTERISTICHE CHIMICO-FISICHE DEI TERRENI E DELL AMBIENTE Ph Tampone Osmolarità Temperatura sistema tampone bicarbonato/acido carbonico 37 C in incubatore FASE GASSOSA 95% 5% O 2 CO 2 Natura del substrato Terreno di coltura Cellule adese Contenitori in plastica trattati Substrati biologici (collagene, fibronectina, ecc)

30 I TERRENI DICOLTURA I terreni base disponibili in commercio contengono tutti i componenti nutritivi necessari alla crescita delle cellule I più comuni terreni base di coltura: -MEM: Minimum Essential Medium -DMEM: Dulbecco s modification of MEM -RPMI: Roswell Park Memorial Institute Differiscono per la concentrazione di amminoacidi e sali e glucosio

31 COMPOSIZIONE DEI TERRENI DI COLTURA Aminoacidi Vitamine Sali Glucosio Rosso fenolo Indicatore di ph rosso-arancio ph neutro giallo ph acido violetto ph basico NaCl KCl NaH 2 PO 4 NaHCO 3 CaCl 2 MgCl 2 Arginina Cisteina Fenilalanina Glutammina Isoleucina Istidina Leucina Lisina Metionina Tirosina Treonina Triptofano Valina Biotina Vitamina B12 Folato Nicotinammide Pantotenato Piridossale Riboflavina Tianina Usato in concentrazioni tra 5 e 10 mm In concentrazione 1 µm Tutti nella forma L e solitamente in concentrazione tra 0.1 e 0.2 mm

32 COMPOSIZIONE DEI TERRENI DI COLTURA Da aggiungere.. Antibiotici Penicillina Sreptomicina Glutammina SIERO Aggiunti per impedire la crescita batterica Miscela complessa di proteine ed elementi fondamentali per la crescita in vitro della maggior parte delle cellule Fattori di crescita: PDGF, EGF, IGF Fattori di adesione: fibronectina, vitronectina Altri elementi: trasferrina, albumina, colesterolo, acidi grassi e glucorticoidi, elementi minerali Il siero di uso più comune è il siero fetale di bovino (FBS) utilizzato ad una concentrazione tra il 5 e il 20%

33 IL SIERO L uso del siero è controverso. Generalmente si preferisce il siero fetale in quanto contiene meno anticorpi. Vantaggi Protegge le membrane grazie al corretto grado di viscosità Introduce fattori di crescita ed ormoni Veicola lipidi, ferro e molecole organiche Favorisce interazione cellule-substrato Contiene inibitori della tripsina Svantaggi Possibile tossicità degli anticorpi Variabilità da lotto a lotto Inibitori metabolici Fattori di crescita che favoriscono i fibroblasti rispetto ad altri tipi cellulari (per le colture primarie)

34 TERRENI DEFINITI L uso di terreni privi di siero nasce dal desiderio di avere condizioni controllate, riproducibili e specifiche per il tipo cellulare in esame. Devono contenere: un inibitore della tripsina, fattori di adesione, ormoni, fattori di crescita, nutrienti e proteine. Vantaggi Maggiore riproducibilità Standardizzazione anche fra laboratori diversi Può favorire subpopolazioni specifiche (non solo fibroblasti) Agevola la purificazione di un prodotto Svantaggi Cellule più sensibili alle condizioni ambientali Crescita più lenta Alcuni additivi sono costosi e/o labili I terreni sono specifici per un tipo cellulare

35 Laboratorio di Coltura Cellulare o Spazio o area di lavoro o Abbigliamento da laboratorio o Reagenti o Vetreria e Plastica di laboratorio o Strumentazione: cappe a flusso laminare incubatori - centrifughe

36 IL LABORATORIO PER LE COLTURE CELLULARI cappa incubatore centrifuga

37 CONTAMINAZIONI DELLE COLTURE L ingresso indesiderato di microorganismi nel terreno di coltura è dannoso, in quanto questi competono con le cellule in coltura (che generalmente hanno ritmo di crescita inferiore) e possono secernere sostanze tossiche. Tipici contaminanti sono batteri, micoplasmi, lieviti, muffe. In caso di infezione batterica il terreno vira in fretta (acidifica) e intorbidisce. Le infezioni da micoplasmi sono più subdole, in quanto il microrganismo è meno visibile e richiede un paio di settimane per formare colonie visibili. Questo pericolo determina la prassi di aggiungere antibiotici al terreno (ad esempio: streptomicina-penicillina); va ricordato che sono stabili per pochi giorni a 37 C.

38 CONTAMINAZIONE DELLA COLTURA CELLULARE Microorganismi eucariotici unicellulari(funghi) Dimensioni fino a 40um Terreno torbido ma soprattutto viraggio del ph del terreno(vs basico) Singoli corpi sferici raggruppati a catenella, movimento lento

39 CONTAMINAZIONE DELLA COLTURA CELLULARE Gruppo ampio di microorganismi unicellulari. Contaminante più comune. Pochi µm di dimensioni, forma variabile (tonda, allungata, spiralizzata). Movimento molto rapido e proliferazione maggiore dei lieviti. Terreno torbido, alcune volte con unasottile pellicola in superficie. Viraggio del ph del terreno (vs acido)

40 CONTAMINAZIONE DELLA COLTURA CELLULARE Batteri che mancano di una parete cellulare. I più piccoli organismi autoreplicanti (meno di 1 um) per le loro piccole dimensioni sono molto difficili da individuare nella coltura Segni di infezione da micoplasma(non visibili) persistononellacolturasenzacausaremortecellularema semplicemente alterando il normale metabolismo delle cellule. Diminuizione del normale range di proliferazione Ridotta densità di saturazione della coltura Agglutinazione nelle colture in sospensione

41 CONTAMINAZIONE DELLA Contaminazione della coltura cellulare COLTURA CELLULARE E consigliabile valutare la presenza di micoplasma nella coltura periodicamente con colorante fluorescente ( es. Hoechst 33258), ELISA, PCR, o analisi microbiologiche. MycoFluor Mycoplasma Detection Kit (Invitrogen)

42 STERILITÀ Alfinedimantenerelasterilità: 1. il laboratorio di biologia cellulare deve essere esclusivo 2. occorre lavorare sotto cappe a flusso laminare 3. bisogna utilizzare materiale monouso sterile Per la sterilizzazione dei materiali: Stufaasecco,150 Cper3ore perlavetreria Autoclave (calore umido), 1 atm, 121 C soluzioni saline per filtri, Filtrazione con filtri da 0.22 µm terreni di coltura, soluzioni organiche Raggi γ materialidiplastica

43 LA CAPPA Cappa a flusso laminare di classe II Le cappe a flusso laminare garantiscono la protezione del campione da contaminazioni non la protezione dell operatore e dell ambiente

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46 LINEE CELLULARI Cellule di Ca utero (HeLa) Cellule di Ca epatico (HepG2) Neuroni corticali di ratto Cellule staminali embrionali umane (H9)

47 MANTENIMENTO DELLE CELLULE IN COLTURA Controllare lo stato di salute della coltura ph (medium con indicatore) ph > 7.6

48 MANTENIMENTO DELLE CELLULE IN COLTURA Controllare lo stato di salute della coltura ph (medium con indicatore) Contaminazione funghi/batteri (torbidità microscopio) Contaminazione con micoplasma (con cadenza regolare) 1. Se la densità cellulare non è ancora alta, ma il terreno tende al giallo bisogna CAMBIARE IL TERRENO DICOLTURA 2. Se le cellule hanno raggiunto una densità di circa 80%, sono nella fase di crescita esponenziale e devono essere ripiastrate(split) ad una densità più bassa Non aspettare che siano confluenti o overconfluenti altrimenti sono in sofferenza e cominciano a staccarsi e morire

49 DISTACCO DELLE CELLULE IN ADESIONE Soluzione di EDTA e tripsina -EDTA: chela il Ca 2+ e il Mg 2+, indispensabili per l adesione -Tripsina: enzima proteolitico, derivato da pancreas porcino. Degrada le proteine della matrice che mantengono le cellule aderenti al substrato Efficienza di semina -Generalmente le cellule, al di sotto di una certa densità non crescono in modo efficiente -Regolagenerale: densità>10 4 cellule/cm 2

50 LA CRIOCONSERVAZIONE Le linee cellulari possono essere criopreservate in azoto liquido a -196 C per oltre 10 anni senza significativi Cambiamenti delle loro caratteristiche biologiche La velocità con cui il campione viene congelato è molto importante: il raffreddamento lento evita la formazione di ghiaccio; il raffeddamento rapido permette di non danneggiare la cellula per disidratazione Velocità IDEALE: -1 C/minuto Uso di agenti crioprotettivi (DMSO, PEG, glicerolo): proteggono la cellule dai danni indotti dalla formazione di cristalli di ghiaccio durante il congelamento Medium di congelamento: 50% medium di coltura al 40% FBS + 10% DMSO Le cellule aderenti vengono congelate a circa 1x10 6 cell/ml Le cellule in sospensione vengono congelate a circa 5x10 6 cell/ml

51 CONTA DELLE CELLULE Camera di Bürker Area: 1 mm 2 Vol: 0,1 mm 3

52 CONTA DELLE CELLULE Camera di Bürker Preparare la sospensione cellulare ed utilizzando una pipetta Pasteur trasferire una piccola quantità di sospensione cellulare in entrambe le camere del vetrino (con il coprioggetto montato!) --> la camera si riempirà per capillarita'.

53 CONTA DELLE CELLULE COME SI CONTANO LE CELLULE?

54 CONTA DELLE CELLULE COME SI CONTANO LE CELLULE?

55 CONTA DELLE CELLULE Il volume del quadrato grande + il coprioggettoè 0,1 mm 3 = 0,1 µl NrMEDIO di cellule in un quadrato x 10 = Nrcellper µl Nrcellper µl x 1000 = Nrcellule per ml Cellule per ml = Nrmedio cellule x10 4 xfattore di diluizione