circolare in ambito alimentare Alberto Barbiroli
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- Flavio Bartoli
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1 Principi ed applicazioni del dicroismo circolare in ambito alimentare Alberto Barbiroli
2 Origine del segnale CD
3 Luce polarizzata planarmente Il vettore campo elettrico oscilla su una linea
4 Sovrapposizione di due radiazioni elettromagnetiche Due radiazioni elettromagnetiche possono venire sommate con le regole del calcolo vettoriale.
5 Sovrapposizione di due radiazioni elettromagnetiche La luce polarizzata planarmente può essere scomposta in due componenti polarizzate circolarmente
6 Assorbanza Quando la luce attraversa un mezzo assorbente (es. che contiene un cromoforo) diminuisce la sua intensità...
7 Assorbanza...indipendentemente che si tratti di luce non polarizzata, polarizzata planarmente o polarizzata circolarmente.
8 Dicroismo Circolare...quando una mezzo assorbe preferenzialmente una delle due componenti polarizzate circolarmente
9 Lo spettropolarimetro
10 differenza in assorbanza A = A L - A R Unità di misura ellitticità in gradi θ θ = tan -1 (b/a) dove b e a sono l asse minore e l asse maggiore dell ellisse risultante C è una semplice relazione numerica tra A e θ: θ = A 10 mθ (mdeg) = 3*10-4 A
11 Unità di misura θ = A Il segnale può essere normalizzato per la concentrazione ε = A/(c*d) M -1 cm -1 [θ] molar = 100*θ/(c*d) deg cm 2 dmol -1 [θ] molar = 3298 ε
12 Effetto di dicroismo circolare quando...un cromoforo è otticamente attivo: (a) intrinsecamente, in ragione della sua struttura (b) poichè legato covalentemente ad un centro chirale (c) poichè localizzato in un contesto asimmetrico e ordinato.
13 Gli enantiomeri hanno spettri di discroismo circolare speculari
14 Il caso delle proteine Cromoforo regione spettrale informazioni Gruppi prostetici visibile ( nm) interazione gruppo prostetico e catena polipeptidica Amminoacidi aromatici vicino UV ( nm) struttura terziaria Legame peptidico lontano UV ( nm) struttura secondaria
15 Strutture secondarie delle proteine Hanno segnali CD caratteristici. Lo spettro far-uv CD di una proteina è, idealmente, la somma dei segnali delle singole strutture secondarie presenti
16 Applicazioni del dicroismo circolare Determinazione delle struttura secondaria delle proteine che non possono essere cristallizzate Studio dell effetto di ligandi (ad es. farmaci) sulla struttura delle proteine Studio dell effetto dell ambiente (ph, temperatura, sali) sulla struttura delle proteine Studio delle interazioni proteina-proteina e proteinaacido nucleico Processi dinamici, es. folding delle proteine...
17 Caratterizzazione della stabilità termica Lisozima
18 Beta-lattoglobulina Whey protein belonging to the family of lipocalin: - β-barrel (reversible binding of hydrophobic compounds) - α-helix (hides Cys121 from solvent)
19 Caratterizzazione della stabilità chimica La curva di denaturazione viene costruita riportando come varia il segnale CD ad una appropriata lunghezza d onda in funzione dell agente denaturante
20 Caratterizzazione della stabilità termica La curva di stabilità termica può venire costruita anche in modo continuo, cioè registrando il segnale CD ad una sola lunghezza d onda durante un riscaldamento controllato.
21 Effetto di ligandi sulla stabilità conformazionale BLG BLG-palmitato La presenza di ligandi incrementa la stabilità conformazionale della proteina sia nei confronti del denaturante chimico...
22 Effetto di ligandi sulla stabilità conformazionale... che del denaturante fisico. L incremento della stabilità termica può essere utilizzato per provare il legame del ligando
23 Effetto del ph sulla stabilità conformazionale La stabilità conformazione della BLG viene influenzata anche dalle variazioni di ph. A ph acidi la denaturazione avviene a temperature più elevate.
24 ph / ligando Il complesso BLG-palmitato è stabile anche a ph acido.
25 Veicolazione di farmaci idrofobici Unfolded protein, % BLG + palmitate + fluvast Unfolded fraction BLG + palmitate + flurbiprofen [Urea], M temperature, C
26 Effetto di cosoluti sulla stabilità conformazionale La presenza di polioli stabilla ulteriormente la struttura tridimensionale della proteina. L effetto stabilizzante è funzione della natura e della concentrazione del poliolo.
27 Saccarosio / palmitato Il calice centrale della BLG è accessibile al palmitato anche in presenza di 20% saccarosio. CD / β-barrel DTNB / α-helix Utilizzando in combinazione opportune tecniche spettroscopiche è possibile caratterizzare anche altre regioni strutturali della proteina.
28 Utilizzo combinato di diverse tecniche spettroscopiche loop-daao Temperatura di denaturazione, C wt loop trp fluor far-uv CD FAD fluor DAAO wild-type PERDITA DI ELEMENTI DI STRUTTURA TERZIARIA PERDITA DI ELEMENTI DI STRUTTURA SECONDARIA RILASCIO DEL FAD
29 People involved DeFENS Alberto Barbiroli Matteo Miriani Mauro Marengo Dimitrios Fessas (DSC) Enzio Ragg (NMR) Miriam Zanoletti (a w ) Stefania Iametti Francesco Bonomi Dep. Functional Ingredients, TNO Utrecht (Financial support) Stefano Renzetti
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