V Giornata di Genetica Forense Roma, 5 giugno 2013 INDAGINI GENETICHE SU REPERTI OSSEI MEDIANTE POWERPLEX FUSION SYSTEM: RISULTATI PRELIMINARI

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1 V Giornata di Genetica Forense Roma, 5 giugno 2013 INDAGINI GENETICHE SU REPERTI OSSEI MEDIANTE POWERPLEX FUSION SYSTEM: RISULTATI PRELIMINARI Silvia Zoppis, Manuela Rosini, Carla Vecchiotti Università di Roma Sapienza Dip. S.A.I.M.L.A.L. Sez. Medicina Legale Laboratorio di Genetica Forense

2 Analisi di reperti ossei Molteplici e complesse variabili (degradazione del materiale genetico; contaminazione ambientale dei reperti; presenza di inibitori dell amplificazione del DNA) sono in grado di condizionare il buon esito dell analisi ovverosia l ottenimento di un profilo STR completo ed interpretabile Il reperto scheletrico è unanimemente considerato CRITICO

3 Il nostro studio Analisi genetiche eseguite su campioni ossei in diverse condizioni di repertazione (carbonizzazione, inumazione, annegamento, ecc.); Estrazione mediante DNA IQ System; Amplificazione e tipizzazione degli STR mediante PowerPlex Fusion System; Valutazione dei risultati ottenuti in rapporto alle caratteristiche dei singoli reperti

4 Selezione dei campioni Lo studio è stato condotto su un campione costituito da 10 casi giunti alla nostra osservazione, per i quali l Autorità Giudiziaria richiedeva l esecuzione delle indagini genetiche ai fini dell identificazione personale o dell accertamento della paternità, selezionati sulla base di peculiarità relative alle condizioni di ritrovamento dei resti nonché allo stato fisico delle ossa stesse situazioni che al momento dell ispezione preliminare all esecuzione delle indagini genetiche suggerivano una specifica criticità

5 Casi selezionati CASO N. ETÀ DEI REPERTI CONDIZIONI AMBIENTALI DI RITROVAMENTO MODALITÀ DEL DECESSO 1 23 anni riesumazione di cadavere in cassa di zinco cause naturali 2 10 anni 3 4 anni ritrovamento di cadavere all interno di una fossa ricoperta da uno spesso strato di calce esumazione di cadavere in cassa di legno andata incontro a rottura con conseguente spandimento dei resti nel terreno circostante 4 3 mesi scoperta casuale di uno scheletro carbonizzato in un terreno agricolo causa violenta (omicidio) cause naturali causa violenta (omicidio) 5 7 giorni ritrovamento di cadavere in avanzato stato di putrefazione all interno di una serra ignota 6 5 mesi ritrovamento di cadavere in acque fluviali ignota 7 4 anni circa scoperta casuale di uno scheletro carbonizzato a seguito di un incendio in un terreno agricolo ignota 8 29 anni esumazione di cadavere in cassa di zinco cause naturali 9 2 giorni cadavere parzialmente carbonizzato a seguito di un incendio domestico 10 7 giorni cadavere completamente carbonizzato a seguito di un incendio domestico causa violenta (omicidio) causa violenta (accidentale)

6 Caso n. 7 Caso n. 4 Caso n. 8 Caso n. 10

7 Protocollo di estrazione del DNA da reperti ossei con il kit DNA IQ System Dopo uno scrub approfondito della superficie ossea con bisturi sterile, si è proceduto alla polverizzazione dell osso (300 mg-1 g) mediante trapano elettrico (a bassa velocità, con ripetizione di colpi rapidi e ripetuti). Il materiale così ottenuto è stato, quindi, posto in incubazione overnight a 56 C in 500 µl-1 ml di Bone Incubation Buffer + Proteinasi K + DTT, dopodiché il sopranatante è stato prelevato, previa centrifugazione a rpm per 5. Si è, infine, proceduto all estrazione del DNA mediante il kit commerciale denominato DNA IQ System secondo il seguente protocollo: 1. prelievo del sopranatante ed inserimento all interno di una provetta da 1,5 ml; 2. aggiunta di 500 µl-1 ml di Lysis Buffer (preliminarmente preparato tramite l aggiunta di 1 μl di DTT 1M per ogni 100 μl di Lysis Buffer); 3. aggiunta di 7 μl di resina magnetica; vortex ed incubazione a temperatura ambiente per 5 ; 4. vortex e posizionamento della provetta sul supporto magnetico; rimozione della soluzione; 5. lavaggio con 200 μl di Lysis Buffer (sol. di lavoro); 6. lavaggio con 200 μl di Wash Buffer 1X (preliminarmente preparato tramite l aggiunta di 15 ml di etanolo assoluto e 15 ml di isopropanolo al Wash Buffer 2X fornito dal kit), ripetuto per un totale di 3 lavaggi; 7. rimozione accurata della soluzione; asciugatura con tappo aperto, sul supporto magnetico, a temperatura ambiente per 5-10 ; 8. aggiunta di µl di Elution Buffer ed incubazione a 65 C per 5 ; 9. vortex e riposizionamento della provetta sul supporto magnetico; 10. trasferimento della soluzione in una provetta nuova; 11. conservazione dell estratto a 4 C (a breve termine) o a -20 C (a lungo termine)

8 Quantificazione del DNA (qpcr) Per la quantificazione dei campioni di DNA mediante qpcr è stato utilizzato uno strumento Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR ed il kit Quantifiler Duo DNA Quantification Kit (Applied Biosystems) Con l eccezione del campione n. 10, per cui il valore di qpcr evidenziato risultava pari a 0, il range quantitativo di DNA nei campioni in esame era di ng/μl. I dati forniti dallo specifico controllo interno (IPC) della reazione ha permesso di evidenziare nei campioni n la presenza di inibitori della PCR

9 Amplificazione del DNA (PCR) Le reazioni di PCR sono state eseguite per tutti i campioni con un volume di reazione di 25 μl utilizzando lo strumento denominato DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 2720 (Applied Biosystems) secondo il protocollo indicato nel manuale d uso del kit: Mix: 5 μl; Primers: 5 μl; n cicli: 30 DNA+H 2 O: 15 μl; V f : 25 μl Tipizzazione STRs autosomici Per l analisi del DNA é stato utilizzato il sequenziatore automatico ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). I parametri di impostazione della corsa elettroforetica e di analisi del tracciato sono quelli indicati nel manuale d uso del kit. I tracciati elettroforetici sono stati analizzati mediante il software GeneMapper ID v3.2.1.

10 Caso n.1

11 Caso n.2

12 Caso n.3

13 Caso n.4

14 Caso n.5

15 Caso n.6

16 Caso n.7

17 Caso n.8

18 Caso n.9

19 Caso n.10

20 Risultati CASO N. CAMPIONE ESAMINATO ESTRAZIONE DNA AMPLIFICAZIONE STRS 1 Femore DNA IQ TM System PowerPlex Fusion System RISULTATI TIPIZZAZIONE STRS Profilo parziale maschile (4 loci su 24) 2 Femore DNA IQ TM System PowerPlex Fusion System Profilo completo femminile 3 Femore DNA IQ TM System PowerPlex Fusion System Profilo parziale maschile (8 loci su 24) 4 Femore DNA IQ TM System PowerPlex Fusion System Profilo completo maschile 5 Femore DNA IQ TM System PowerPlex Fusion System Profilo completo maschile 6 Femore DNA IQ TM System PowerPlex Fusion System Profilo completo maschile 7 Tibia DNA IQ TM System PowerPlex Fusion System Profilo completo maschile 8 Femore DNA IQ TM System PowerPlex Fusion System Profilo parziale femminile (10 loci su 24) 9 Femore DNA IQ TM System PowerPlex Fusion System Profilo completo maschile 10 Tibia DNA IQ TM System PowerPlex Fusion System Profilo assente

21 Conclusioni Da questi primi risultati ottenuti dall analisi di reperti ossei mediante il kit PowerPlex Fusion System, è possibile evidenziare i seguenti vantaggi relativi all utilizzo del suddetto kit: Analisi di un elevato numero di loci (23+ Amelogenina); Marcata riduzione dei tempi di PCR (90 min. circa); Maggiori possibilità di ottenere risultati utili laddove i kit precedentemente in uso non abbiano fornito un profilo completo

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