Buone regole. -nel dubbio, chiedere! LEGGERE BENE IL PROTOCOLLO PRIMA DI INIZIARE

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Leonzio Valentini
7 anni fa
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Precauzioni da adottare in laboratorio: -non mangiare nè bere -indossare il camice -indossare sempre i guanti quando si maneggiano i tubini, i gel, le micropipette -nel dubbio, chiedere!

1 Precauzioni da adottare in laboratorio: -non mangiare nè bere -indossare il camice -indossare sempre i guanti quando si maneggiano i tubini, i gel, le micropipette -nel dubbio, chiedere! Buone regole LEGGERE BENE IL PROTOCOLLO PRIMA DI INIZIARE Iniziare pulendo bancone, rack e micropipette ed organizzando la postazione Utilizzare un puntale nuovo ogni volta che si pipetta, per evitare contaminazioni tra diversi campioni

2 Lo studio delle radiazioni assorbite da una sostanza (SPETTRO DI ASSORBIMENTO) può essere utilizza A SCOPO ANALITICO Il colore delle sostanze è dovuto al fatto che esse assorbono specifiche radiazioni e ne lasciano passare o riflettono altre SOSTANZA COLORATA: assorbe solo alcune radiazioni che costituiscono la luce bianca e lascia passare tutte le altre SOSTANZA INCOLORE: non assorbe nessuna radiazione che costituisce la luce bianca ma assorbe radiazioni a lunghezza d onda comprese nell ultravioletto o nell infrarosso

3 Il massimo dell assorbimento dipende dai gruppi funzionali presenti nelle molecole ed identifica LO SPETTRO DI ASSORBIMENTO

4 Spettri di di assorbimento della luce da parte dei comuni nucleotidi, gli spettri sono quasi identici, per effettuare misure di assorbimento viene usata la luce a 260 nm

5 ASSORBIMENTO DELLA LUCE ULTRAVIOLETTA DA PARTE DEGLI Aa AROMATICI Il triptofano e la tirosina Assorbono la luce ultravioletta, ciò spiega perché la maggior parte delle proteine hanno un caratteristico assorbimento della luce ad una lunghezza d onda di 280nm

Quantificazione di DNA -la concentrazione del DNA (in µg/µl) (sapendo che in una cuvetta con un cammino ottico di 1cm, il DNA a doppio filamento alla concentrazione di 50µg/ml ha A=1 a 260nm, si

6 Quantificazione di DNA -la concentrazione del DNA (in µg/µl) (sapendo che in una cuvetta con un cammino ottico di 1cm, il DNA a doppio filamento alla concentrazione di 50µg/ml ha A=1 a 260nm, si ottiene che la concentrazione del DNA (µg/ml) è = A260 x 50 µg/ml x il fattore di diluizione); -- il rapporto delle letture a 260 e 280 nm (A260/A280). Tale rapporto deve essere 1.8 per una preparazione pura di DNA. Se il rapporto è < 1.8, significa che è presente una contaminazione da parte di proteine - partendo dal valore di concentrazione ottenuto, calcolare quanto DNA totale è presente nella preparazione di partenza.

7 Purificazione di DNA plasmidico Sali ed alcol sono aggiunti alla soluzione acquosa di DNA L acqua è una molecola polare. Il DNA interagisce con l acqua con interazioni elettrostatiche, venendo dissolto nell acqua (è idrofilico) grazie ai gruppi fosfato (PO3-) dello scheletro zuccheri-fosfati. I sali neutralizzano le cariche sullo scheletro zuccheri-fosfati. Vengono comunemente usati Sodio Cloruro (NaCl) o Sodio Acetato. In soluzione questo è presente come ioni Na+ e [CH3COO]-. Gli ioni Na+ neutralizzano le cariche negative PO3- del DNA, rendendo la molecola meno idrofilica, e quindi meno solubile in acqua. Perchè gli alcol? Le interazioni elettrostatiche tra ioni Na+ e PO3- in soluzione sono regolate dalla costante dielettrica della soluzione (Legge di Coulomb). L acqua ha una costante dielettrica alta, il che rende difficile l interazione tra Na+ e PO3-. Etanolo o isopropanolo hanno una costante dielettrica minore, consentendo a Na+ di interagire con PO3-, schermarne la carica e rendere l acido nucleico meno idrofilico, causandone la precipitazione.

8 Elettroforesi su gel Permette la separazione di acidi nucleici in funzione delle loro dimensioni, della carica e della forma E una tecnica fondamentale per: l analisi (elettroforesi analitica) la purificazione degli acidi nucleici (elettroforesi preparativa)

9 catodo anodo - + RNA e DNA sono carichi negativamente Gli acidi nucleici sono carichi negativamente ed in un campo elettrico migrano dal polo negativo verso il polo positivo.

10 Effetto setaccio in un gel uniforme Nell elettroforesi gli acidi nucleici vengono sottoposti ad un campo elettrico (vengono fatti migrare o correre ) all interno di una matrice (gel di agarosio o poliacrilammide). - +

11 ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO L agarosio è un polisaccaride, isolato da un alga, costituito da residui alternati di D-galattosio e 3,6-anidro-L-galattosio. L elettroforesi in gel di agarosio consente la separazione di molecole di grandi dimensioni ( paia basi). Concentrazione di agarosio Risoluzione 0.8% : kb 2% : kb

12 Come si prepara un gel d agarosio Si scioglie l agarosio in polvere in una soluzione tampone a 100 C Alla soluzione d agarosio si aggiunge Etidio Bromuro (EtBr)

13 ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO generatore di corrente 100V 0,2A tampone elettroforetico Polo - Polo + scatola elettroforetica gel di agarosio 1.2%

14 ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO 100V 0,2A Polo - Polo + Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa.

15 ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO ON 100V 0,2A Polo - Polo + Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa.

16 ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO ON 100V 0,2A Polo - Polo + Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa.

L EtBr è fluorescente quando esposto agli UV, e la sua fluorescenza aumenta quando è

17 Visualizzazione Il DNA è visualizzato grazie al Bromuro di Etidio, un catione formato da più anelli aromatici che si intercala tra le basi del DNA. L EtBr è fluorescente quando esposto agli UV, e la sua fluorescenza aumenta quando è intercalato. Luce chiara Luce UV Attenzione! Il bromuro di etidio è mutageno: usare sempre i guanti, evitare inalazione, contatto con pelle e mucose

18 Per frammenti lineari di DNA e/o RNA la distanza di migrazione è inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola(ovvero alla sua lunghezza inbasi)

19 Conoscendo la distanza di migrazione di frammenti di dimensione nota (M) posso interpolare la lunghezza delle molecole A e B A = 2.5 kb B = 6 kb Dai Geni ai Genomi -EdiSES-

20 Per acidi nucleici non lineari, la velocità di migrazione è funzione non solo del rapporto carica/massa, ma anche della forma. La velocità con cui le molecole migrano aumenta in funzione dell aumentare del numero di superavvolgimenti della molecola.

21 Analisi per restrizione

22 Il codice della vita Il DNA, o acido desossiribonucleico, è costituito da lunghe catene di nucleotidi; ogni nucleotide è composto da uno zucchero (deossiribosio), un gruppo fosfato, una base azotata purinica o pirimidinica. Curtis et al. Invito alla biologia.blu Zanichelli editore

23 Il codice della vita Purine: adenina (A) e gunina (G); pirimidine: citosina (C) e timina (T). Curtis et al. Invito alla biologia.blu Zanichelli editore

24 La struttura del DNA Watson e Crick nel 1953 dedussero, anche grazie al lavoro di Rosalind Franklin e Maurice Wilkins, che il DNA è una doppia elica lunga e spiralizzata. Curtis et al. Invito alla biologia.blu Zanichelli editore

La struttura del DNA Le purine si appaiano con le pirimidine; tra adenina e timina ci sono due legami a idrogeno; tra citosina e guanina ce ne sono tre; i

25 La struttura del DNA Le purine si appaiano con le pirimidine; tra adenina e timina ci sono due legami a idrogeno; tra citosina e guanina ce ne sono tre; i filamenti sono antiparalleli: hanno due direzioni opposte indicate per convenzione 5-3 e 3-5. Curtis et al. Invito alla biologia.blu Zanichelli editore

26 I cromosomi I procarioti hanno un unico cromosoma circolare costituito da una sola molecola di DNA. Gli eucarioti hanno più cromosomi nei quali l unica molecola di DNA lineare è associata alle proteine, hanno sequenze ripetute con funzione sconosciuta. Curtis et al. Invito alla biologia.blu Zanichelli editore

27 La cromatina È l insieme di DNA e proteine e ne esistono due tipi: eterocromatica più condensata e compatta; eucromatinapiù dispersa per consentire la trasmissione di informazioni durante l interfase. Curtis et al. Invito alla biologia.blu Zanichelli editore

Il nucleosoma La cromatinaè formata da istoni carichi positivamente e perciò attratti dal DNA; ci sono 5 tipi di istoni sui quali si avvolge il DNA formando il

28 Il nucleosoma La cromatinaè formata da istoni carichi positivamente e perciò attratti dal DNA; ci sono 5 tipi di istoni sui quali si avvolge il DNA formando il nucleosoma; ogni nucleosoma è costituito da 8 molecole di istoni (due per tipo), l istone H1 si trova lungo il DNA. Curtis et al. Invito alla biologia.blu Zanichelli editore

29 Stati di ripiegamento I nucleosomi si uniscono in una struttura a collana di perle che si avvolge in anse e quindi in spirali condensate fino a formare il cromosoma. Curtis et al. Invito alla biologia.blu Zanichelli editore

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