VALUTAZIONE DELL ESPOSIZIONE PROFESSIONALE AD IDROCARBURI POLICICLICI AROMATICI MEDIANTE INDICATORI BIOLOGICI ED AMBIENTALI

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1 VALUTAZIONE DELL ESPOSIZIONE PROFESSIONALE AD IDROCARBURI POLICICLICI AROMATICI MEDIANTE INDICATORI BIOLOGICI ED AMBIENTALI R. Guadagni 1, G. Genovese 1, P. Basilicata 1, C. Novi 2, E. Russo 2, R. d Angelo 2, N. Sannolo 1 1 Dipartimento di Medicina Sperimentale, Sezione di Medicina del Lavoro, Igiene e Tossicologia Industriale, Seconda Università degli Studi di Napoli 2 INAIL - Direzione Regionale Campania - Consulenza Tecnica Accertamento Rischi e Prevenzione Introduzione Gli Idrocarburi Policiclici Aromatici (IPA) sono inquinanti ubiquitari che si formano durante i processi di combustione incompleta e per pirolisi di materiale organico. Essi suscitano, ormai da diversi anni, molta preoccupazione ed interesse nella comunità scientifica a causa della loro diffusione e delle loro caratteristiche tossicologiche. La maggior parte dei dati sulla pericolosità degli IPA deriva da numerosi studi di laboratorio, condotti in vitro o su animali, per individuare gli effetti causati dall esposizione a tali composti a vari livelli di concentrazione nonché da studi epidemiologici condotti su lavoratori impegnati in diverse attività lavorative. Per quanto riguarda gli effetti tossici che gli IPA inducono sugli organismi viventi, sembra che essi interferiscano con la funzionalità delle membrane cellulari e con il sistema enzimatico associato ad esse. Questo si verifica perché sono composti lipofili e si accumulano nei tessuti degli organismi esposti. L effetto tossico più grave sull uomo, associato all esposizione a tali contaminanti, è certamente il cancro. Alcuni IPA hanno dimostrato, in studi effettuati su roditori e alcuni primati, di essere in grado di causare il cancro ai polmoni, se assorbiti per inalazione, allo stomaco, se ingeriti attraverso alimenti contaminati, ed alla pelle per contatto dermico; tali dati, sono stati purtroppo confermati sull uomo. A differenza dei singoli IPA (classificati da diverse agenzie per la tutela della salute come possibili o probabili cancerogeni per l'uomo), i materiali che li contengono in miscela ed alcune produzioni industriali che espongono i lavoratori a questi composti, come produzione di coke o alluminio e la gassificazione del carbone, sono stati inseriti dall Agenzia Internazionale di Ricerca sul Cancro (I.A.R.C.) nella classe 1, che include le sostanze cancerogene accertate per l uomo. Nell allegato XLII al D. Lgs 81/08, menzionato nell art. 234 (Titolo IX, Capo II, dedicato alla Protezione da agenti cancerogeni e mutageni ) sono inseriti i "lavori che espongono

2 agli idrocarburi policiclici aromatici presenti nella fuliggine, nel catrame o nella pece di carbone". Tra le attività lavorative con rischio di esposizione ad alte dosi di IPA ritroviamo, inoltre, la produzione di elettrodi di grafite, di gomma, di energia elettrica (in particolare in centrali alimentate a carbone), l impiego in distributori di carburante, la sintesi di benzene o altri solventi. Alla luce di quanto detto risulta evidente che la tossicità di tali composti, unitamente alla loro elevata diffusione, rendono necessarie indagini di monitoraggio ambientale e/o biologico dei lavoratori esposti; nel presente lavoro di ricerca, pertanto, sono state sviluppate procedure analitiche di identificazione e quantificazione di sedici IPA, scelti come indicatori biologici ed ambientali, secondo quanto raccomandato dall EPA (Environmental Protection Agency) 1 e dalla Commissione Consultiva Tossicologica Nazionale (CCTN) 2. Le procedure sviluppate sono state applicate ad una campagna di monitoraggio ambientale presso una stazione di rifornimento carburante al fine di valutare i reali livelli espositivi dei lavoratori in due differenti condizioni climatiche. Materiali e Metodi Il lavoro è stato articolato in diverse fasi, di seguito illustrate: 1. Scelta dei marcatori ambientali e biologici Per il monitoraggio ambientale (MA) sono stati presi in esame i 16 composti che, secondo quanto suggerito dall EPA, sono rappresentativi della miscela di IPA aerodispersi. Essi sono: Acenaftene, Acenaftilene, Antracene, Benzo(a)antracene, Benzo(b)fluorantene, Benzo(k)fluorantene, Benzo(ghi)perilene, Benzo(a)pirene, Crisene, Dibenzo(a,h)antracene, Fenantrene, Fluorantene, Fluorene, Indeno(1,2,3-cd)pirene, Naftalene, Pirene. Per il monitoraggio biologico (MB) si è deciso di quantificare gli IPA tal quali nell urina dei soggetti esposti; pertanto sono stati scelti, come indicatori biologici di esposizione, gli IPA raccomandati dalla CCTN, che coincidono con quelli raccomandati dall EPA per il monitoraggio ambientale. 2. Sviluppo di procedure analitiche per la quantificazione degli IPA in matrici biologiche ed ambientali Sia per il MA che per il MB le procedure sono state sviluppate utilizzando, quale tecnica analitica, la gas cromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC/MS). Le analisi sono state eseguite con un gas cromatografo con iniettore split-splitless, collegato ad uno spettrometro di massa a singolo quadrupolo, adoperando, per la separazione cromatografica, una colonna capillare 5Sil-MS (30m x 0,25mm x 0,25µm); la

3 quantificazione è stata effettuata utilizzando Pirene-d 10 e Benzo(a)pirene-d 12, come standard interni (IS). Poiché gli IPA sono dispersi in aria sia in fase vapore sia adsorbiti su particolato, per il MA i campionamenti sono stati effettuati utilizzando sistemi di captazione combinati, costituiti da una fiala riempita con resina adsorbente (XAD 2 ) in coda ad una membrana in politetrafluoroetilene (PTFE, diametro 37 mm; porosità 2 µm). La matrice ambientale nel presente lavoro di ricerca è, pertanto, costituita dall insieme di XAD 2 e membrana in PTFE. Per quanto concerne il MB, in seguito a studi di tossicocinetica degli analiti in oggetto, si è deciso di eseguire la quantificazione degli IPA tal quali nella matrice urinaria. Gli analiti sono stati estratti dalla matrice biologica (urina) mediante Head Space/Solid Phase Microextraction (HS/SPME) adoperando fibre in polidimetilsilossano (PDMS) 100µm, e dalle matrici ambientali (fiale adsorbenti XAD 2 e membrane in politetrafluoroetilene) mediante estrazione solido/liquido con ausilio degli ultrasuoni utilizzando una miscela di toluene/diclorometano (70/30=V/V) come solvente di estrazione. Sono state, poi, costruite le curve di calibrazione (in triplicato) al fine di verificare la linearità della risposta strumentale e valutare la riproducibilità e l accuratezza dei metodi analitici sviluppati. 3. Applicazione in campagne di monitoraggio ambientale in una stazione di rifornimento carburante E stata eseguita una campagna di monitoraggio ambientale di area e personale presso una stazione di rifornimento carburante, ubicata su un tratto di autostrada del Sud Italia ad elevato traffico veicolare. Per il MA di area, i livelli dei 16 IPA sono stati misurati in vari siti di campionamento, per 3 condizioni operative differenti (riempimento cisterne/steccatura, erogazione e lavoro d ufficio), posizionando i campionatori fissi nelle seguenti postazioni: n.1 postazione sopravento, lontano dalle pompe di erogazione e dal passaggio di autoveicoli (bianco); n.1 postazione presso la cisterna all atto del riempimento di carburante da parte dell autocisterna e durante la verifica dei volumi di carburante trasferiti (operazione steccatura); n. 4 postazioni in corrispondenza delle pompe erogatrici del carburante self e servito ; n. 1 postazione all interno dell ufficio (vicino alla cassa). Il MA personale è stato condotto su 6 addetti all erogazione carburante.

4 I prelievi (sia per il MA di area che per quello personale) sono stati condotti utilizzando sistemi di captazione combinati, costituiti da una fiala riempita con resina adsorbente, adoperata per campionare la fase vapore, in coda ad una membrana in PTFE per la raccolta della frazione di IPA aerodispersi in forma particellare (aerosol). Membrana e fiala sono state collegate in serie ad una pompa che aspira aria ad un flusso costante di 2 l/min, secondo quanto previsto nel metodo ufficiale NIOSH 5506 POLYNUCLEAR AROMATIC HYDROCARBONS. I sistemi di captazione fissi sono stati posizionati nelle suddette postazioni ad 1,5 m di altezza da terra, mentre quelli personali sono stati posizionati sul torace dei lavoratori in prossimità della zona respiratoria. I campionamenti sono stati condotti per l intera durata dei turni lavorativi. Quanto sopra riportato è stato ripetuto per due rilievi in condizioni climatiche differenti (estate, inverno). Risultati e Discussione Per la valutazione dell esposizione professionale a idrocarburi policiclici aromatici un punto cruciale è rappresentato dalla scelta degli indicatori ambientali e biologici da prendere in considerazione. Da un attento studio della normativa vigente è emerso che per ciò che concerne il monitoraggio ambientale l ACGIH (American Conference of Governmental Industrial Hygienists) non indica alcun valore limite specifico inerente i singoli IPA ad eccezione del naftalene (TLV-TWA 52mg/m 3 ) mentre nel caso di benzo(a)pirene, benzo(a)antracene, benzo(b)fluorantene e crisene specifica che l esposizione, in tutti i casi, dovrebbe essere attentamente controllata per mantenere i livelli più bassi possibili. Le stime del rischio delle miscele complesse, tuttavia, dovrebbero basarsi sui dati di tossicità e di esposizione dell intera miscela e non dei singoli componenti che possono interagire tra loro con effetti additivi, sinergici o antagonisti. Non potendo valutare la concentrazione di tutti gli IPA presenti in una miscela, è stato necessario individuare un numero limitato di composti (markers) in grado di descrivere, nel modo più accurato possibile, la composizione quali/quantitativa della miscela stessa e quindi l esposizione più verosimile dei soggetti. In Italia, sono consigliati come markers almeno sei IPA, cui è associata la frase di rischio R45 (può provocare il cancro) o R49 (può provocare il cancro per inalazione). Nel presente lavoro sono stati presi in considerazione altri idrocarburi, proposti e raccomandati da diversi Enti nazionali ed internazionali e sono stati, infine, scelti tutti i composti

5 raccomandati dall Enviromental Protection Agency (EPA). Resta comunque la difficoltà di confrontare dati ottenuti da indagini di MA nelle quali viene valutata l esposizione professionale alla miscela di IPA scelti come markers con valori limite proposti da enti ufficiali in quanto l ACGIH indica un TLV-TWA (pari a 0,2 mg/m³) esclusivamente per i prodotti volatili di catrame e pece di carbone. Per ciò che concerne il monitoraggio biologico, fino a qualche anno fa si riteneva che esso potesse essere effettuato dosando soltanto alcuni metaboliti degli IPA; in particolare l 1-idrossipirene urinario (1-OHPIR urinario) era considerato il migliore indicatore biologico di esposizione ad IPA data l elevata percentuale di trasformazione del pirene (uno degli IPA più rappresentativi) in 1-OHPIR (pari al 90% circa nell uomo) 3. Esso, inoltre, è suggerito dall ACGIH come indicatore di esposizione sebbene venga specificato unicamente il momento del prelievo del campione (fine turno fine settimana lavorativa) e non il valore limite. La Società Italiana Valori di Riferimento (SIVR), invece, prende in considerazione tra i vari metaboliti urinari degli IPA anche 1-naftolo e idrossifenantrene. Da studi più recenti 4 è emerso, tuttavia, che il monitoraggio biologico può essere eseguito quantificando gli IPA tal quali nell urina dei soggetti esposti. Ciò trova conferma nella farmacocinetica degli analiti, secondo la quale una discreta percentuale viene eliminata immodificata nelle urine. Il dosaggio degli IPA tal quali nella matrice urinaria consente, inoltre, una correlazione immediata tra dose interna e dose esterna a cui è stato esposto un lavoratore e prescinde da eventuali errori di valutazione. Pertanto sono stati scelti come indicatori biologici di esposizione gli IPA raccomandati dalla CCTN che coincidono con quelli raccomandati dall EPA per il monitoraggio ambientale. Una volta individuati i markers di esposizione sono state sviluppate procedure analitiche per la quantificazione degli IPA in matrici biologiche ed ambientali. Dopo una prima fase di caratterizzazione strumentale degli analiti e degli IS, mediante analisi GC/MS full scan, è stato sviluppato un metodo gas cromatografico che consentisse la separazione degli analiti in miscela, mentre il metodo di spettrometria di massa è stato ottimizzato, in termini di sensibilità analitica, passando ad una modalità di acquisizione a scansione di ioni selezionati (SIM, Selected Ion Monitoring). Successivamente sono state messe a punto le procedure di estrazione degli analiti da urina e da resine adsorbenti e membrane filtranti, adoperate come matrici ambientali.

6 Per l HS/SPME degli IPA dall urina, sono stati valutati temperature e tempi di contatto della fibra con lo spazio di testa; dagli esperimenti condotti si è compreso che l equilibrio di ripartizione degli analiti tra la matrice urinaria e lo spazio di testa si raggiunge ponendo il campione in bagno termostatato ad ultrasuoni (70 C) per 15min e l adsorbimento ottimale degli analiti si ottiene ponendo la fibra a contatto con lo spazio di testa per 60 minuti. Nel caso dell estrazione da resine adsorbenti e membrane filtranti, invece, sono stati testati diversi solventi, tempi di immersione dei campioni nel bagno ad ultrasuoni e numero di cicli di estrazione. La procedura definitiva ha previsto un unico ciclo estrattivo adoperando 5ml di una miscela toluene/diclorometano (70/30) ed immergendo i campioni per 1h in bagno ad ultrasuoni. Il recupero di estrazione ottenuto per entrambe le matrici è maggiore del 60% per tutti gli analiti presi in esame. Successivamente, è stata valutata la linearità della risposta analitica nei range di concentrazione di interesse costruendo curve di calibrazione per ciascuna matrice in esame; i campioni sono stati analizzati in triplicato al fine di valutare anche l accuratezza e la precisione dell intera procedura sviluppata (calcolate rispettivamente come Acc% e CV%). Tutti i parametri testati hanno soddisfatto i requisiti necessari: sono stati ottenuti, infatti, coefficienti di correlazione (R 2 ) prossimi all unità ed elevati livelli di accuratezza e precisione. È stata verificata, inoltre, l elevata sensibilità della procedura mediante il calcolo dei limiti di rivelazione e di quantificazione (LOD e LLOQ). Le procedure sviluppate sono state applicate ad una campagna di monitoraggio ambientale mediante campionamenti di area e personale presso una stazione di rifornimento carburante, ubicata su un tratto di autostrada del Sud Italia ad elevato traffico veicolare, al fine di valutare i reali livelli espositivi dei lavoratori in due differenti condizioni climatiche (estate e inverno). In entrambi i casi sono stati quantificati i singoli IPA sia nelle membrane che nelle fiale e, successivamente, è stata calcolata la concentrazione totale dei 16 IPA per ciascun campione (IPA TOT ). Per il monitoraggio ambientale di area, i livelli di IPA aerodispersi, espressi come totale delle concentrazioni dei singoli composti in entrambe le matrici, sono compresi tra 0, e 0, mg/m 3 in estate e tra 0, e 0, mg/m 3 in inverno; le concentrazioni di naftalene, invece, variano tra 0, e 0, mg/m 3 in estate e tra 0, e 0, mg/m 3 in inverno.

7 Per il monitoraggio ambientale personale, i livelli di IPA aerodispersi nella zona respiratoria degli addetti al rifornimento carburante monitorati, espressi come totale delle concentrazioni dei singoli composti in entrambe le matrici, sono compresi tra 0, e 0, mg/m 3 in estate e tra 0, e 0, mg/m 3 in inverno; le concentrazioni di naftalene, invece, variano tra 0, , mg/m 3 in estate e tra 0, e 0, mg/m 3 in inverno. In tutti i casi i valori ottenuti risultano di gran lunga inferiori ai TLV-TWA suggeriti dall ACGIH per l anno Come si può notare, le condizioni climatiche (temperatura ed umidità relativa, riportate in Tabella A) influiscono notevolmente sulla dispersione degli IPA; le concentrazioni totali dei 16 IPA aerodispersi e del naftalene riscontrate in estate, infatti, sono maggiori rispetto a quelle ritrovate eseguendo il campionamento nel periodo invernale. Inverno (T media 10 C e Umidità relativa media 53%) Estate (T media 26 C e Umidità relativa media 44%) IPA MA area [IPA], mg/m 3 MA personale [IPA], mg/m 3 MA area [IPA], mg/m 3 MA personale [IPA], mg/m 3 NAP 0, , , , , , , , BaA 0,2* , , , , 8* , , , CRI 0,9* , , , ,7* , , , BbF 0,5* , , , ,7* , , , BaP 0,3* , , , ,3* , , , IPA TOT 0, , , , , , , , Tabella A: Concentrazioni, in mg/m 3, di IPA misurate mediante campionatori fissi e personali in condizioni climatiche differenti (estate e inverno) Per entrambi i monitoraggi ambientali, inoltre, tra gli IPA scelti come markers sono stati quantificati anche i 4 composti per i quali l ACGIH raccomanda livelli più bassi possibile, ovvero benzo(a)pirene, benzo(a)antracene, benzo(b)fluoroantene e crisene; le concentrazioni di questi composti sono dell ordine di qualche ng/m 3 (Tabella A) ed è possibile affermare, quindi, che sono piuttosto contenute, come raccomandato dall ACGIH. Conclusioni Punto cruciale nella valutazione e gestione dei rischi per la salute connessi con l esposizione ad idrocarburi policiclici aromatici nei luoghi di lavoro è rappresentato dalla

8 scelta degli indicatori ambientali e biologici. I markers presi in considerazione nel presente lavoro di ricerca sono sufficientemente rappresentativi della miscela di IPA aerodispersi, in quanto comprendono composti con diverse caratteristiche chimico-fisiche. I bassi livelli di esposizione ad IPA aerodispersi riscontrati nelle indagini di monitoraggio condotte, inoltre, mettono in luce la necessità di disporre di metodiche analitiche sensibili, affidabili e riproducibili, in grado di evidenziare gli attuali livelli di esposizione professionale. L utilizzo della gas cromatografia accoppiata alla spettrometria di massa in modalità di acquisizione a scansione di ioni selezionati (GC/MS-SIM) quale tecnica analitica ha consentito, oltre al raggiungimento di elevati livelli di sensibilità, anche la messa a punto di procedure rapide e applicabili, quindi, ad analisi di routine. Bibliografia 1) U. S. EPA, United States Enviromental Protection Agency, The determination of benzo(a)pyrene and other polynuclear aromatic hydrocarbons (PAHs) in ambient air using gas chromatographic (GC) and high performance liquid chromatogreaphic (HPLC) analysis. 1987, Method TO13. revision ) Menichini E., Opinion adopted by the Italian National Advisory Toxycological Committee on polycyclic aromatic hydrocarbons (containing the original Italian text). Roma, Istituto Superiore di Sanità, 1992, (serie Relazioni 92/4) 3) Jongeneelen F.J., Akker W., Bos R.P., Anzion R.B.M., Theuws J.L., Roelofs H.M., Henderson P.T., 1- Hydroxy-pyrene as an indicator of mutagenicity of coal tar after activation with human liver preparations. Mutat. Res., 1988, 204, ) Waidyanatha S., Zheng Y., Rappaport S.M., Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in urine of coke oven workers by headspace solid phese microextraction and gas chromatography-mass spectrometry. Chemico-biological Interaction, 2003, 145,