La valutazione della Emorragia Feto-Materna: tecniche a confronto

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1 La valutazione della Emorragia Feto-Materna: tecniche a confronto Dr. Roberto Distefano Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale RAGUSA 6 UK NEQAS Users Meeting Milano 20 novembre 2013

2 F M H Uno dei compiti che la legge 219/2005 affida ai Servizi Trasfusionali è quello di garantire l'esecuzione di indagini finalizzate al monitoraggio dell'emorragia feto-materna e quindi alla prevenzione della MEN. I SIMT sono tenuti inoltre alla tenuta di un registro dei pazienti da sottoporre alla profilassi.

3 Situazione italiana Blood Transfusion 2013 n 4 Nel corso del 2010 è stato inviato a tutti i 280 SIMT italiani un questionario con 37 quesiti riguardo i seguenti argomenti: 1. Tipo di servizio fornito e registro immunoprofilassi 2. Modalità immunoprofilassi 3. Tipizzazione RBC e ricerca anticorpi irregolari 4. Valutazione FMH 5. Incidenza di MEN nel 2010 Ultima Survey nel 2004

4 Survey SIMT hanno risposto 164 in modo attivo 41 SIMT eseguono i test per FMH

5 Test di Kleihauer-Betke Test di eluizione acida dell emoglobina: dopo fissazione del vetrino con metanolo ed eluizione della Hb con una soluzione acida, si colora con eritrosina. Metodo di screening o semi-quantitativo.

6 Kleihauer secondo BCSH guidelines Se in un C.V. ci sono almeno 100 emazie, si procede al conteggio delle emazie fetali: <10 emazie in 25 C.V. l FMH è < 2 ml >10 emazie in 25 C.V. si deve procedere alla quantificazione

7 FMH rapid screen Risultato POSITIVO Risultato NEGATIVO Formazione di rosette

8 FMH rapid screen: interpretazione risultati Risultato POSITIVO: 5 o più rosette in 5 campi a basso ingrandimento Risultato NEGATIVO: 4 o meno rosette in 5 campi a basso ingrandimento

9 FMH rapid screen

10 Test ricerca Ag D con IAT (Du) e lettura al microscopio 6 Laboratori hanno risposto di eseguire la ricerca di emazie fetali nel sangue materno utilizzando il test dell antiglobulina indiretto seguito da lettura al microscopio. Anche questo è un metodo di screening con il quale non è possibile quantificare l entità dell emorragia feto-materna.

11 Gel Agglutination Test (G.A.T.) Si utilizza un anticorpo monoclonale anti-d in grado di legarsi alle emazie fetali D+ Il test si basa sul principio del consumo dell anticorpo, misurato indirettamente tramite cellule indicatrici D+. Il risultato si confronta con quelli di una serie di campioni standard forniti nel kit, che hanno una differente concentrazione di eritrociti D+: negativo, 0.1%, 0.2%, 0.4%. È un metodo semi-quantitativo

12 Gel Agglutination Test (G.A.T.)

13 Metodo citofluorimetrico 1. Valutazione eritrociti D+ 2. Valutazione eritrociti fetali HbF+

14 1.Metodo con anticorpo anti-d Sangue in EDTA diluito 1:10 in PBS/BSA 0,2% 5 μl lavati in 2 ml di PBS/BSA 0,2% Marcare con 25 μl di anti-d* e 5 μl di CD45 Incubare 15' a T.A. 2 lavaggi in PBS/BSA 0,2% Risospendere in 0,5 ml di PBS Acquisire eventi. *Quanti-D Millipore, North Ryde, Australia

15 Controllo positivo 0,5%

16 Controllo negativo

17 Campione positivo % emazie D+ X 18 = ml di G.R. Fetali nel circolo materno

18 Ultimi lotti di Quanti D.

19 2.Metodo con anticorpo anti HbF 10μl di sangue intero μl di fissativo A e 100 μl di fissativo B (30 ) Lavaggio Permeabilizzazione con SDS (3 ) 2 Lavaggi 50 μl di anti CA FITC + 50 μl di anti HbF PE + 50 μl di sospensione di eritrociti trattati (15 ) Lavaggio Acquisizione di almeno eventi (G.R.)

20 Controllo positivo ( %)

21 Controllo negativo

22 Campioni

23 Conclusioni (1) Test di Kleihauer vantaggi: facile, economico, kit commerciali svantaggi: qualitativo, sovrastima FMH rapid screen (rosette): come Kleihauer Test Du: idem G.A.T. vantaggi: semi-quantitativo svantaggi: metodica indaginosa, approvvigionamento mensile reagenti

24 Conclusioni (2) Metodo citometrico vantaggi: semplice, quantitativo svantaggi: citofluorimetro Metodo con anti-d: problemi di approvvigionamento

25 Conclusioni (3) Incidenza FMH totale nascite nell anno 2010:

26 Conclusioni (4) Incidenza FMH totale nascite nell anno 2010:

27 Conclusioni (5) Implementare la copertura globale del monitoraggio della MEN Utilizzo in tutti i SIMT di metodi di screening validati (ad es. Kleihauer) Creare un network con i SIMT che hanno in uso il metodo citometrico Accreditamento SIMT.

28 Grazie per l attenzione