ONCOGENI ed ONCOSOPPRESSORI. Nabissi 15

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1 ONCOGENI ed ONCOSOPPRESSORI

2 I prodotti degli oncogeni possono essere classificati in sei gruppi: 1.Fattori di trascrizione 2.Rimodellatori della cromatina 3.Fattori di crescita 4.Recettori dei fattori di crescita 5.Trasduttri del segnale 6.Regolatori dell apoptosi

3 FATTORI DI TRASCRIZIONE I fattori di trascrizione (TF) sono spesso membri di una famiglia multigenica che mostra dei domini strutturali comuni e molti di questi fattori per funzionare richiedono l interazione con altre proteine. Il TF regolano positivamente o negativamente l espressione di determinati geni, legandosi a specifiche sequenze di DNA (promoter, enhancer, silencer). Esempi di TF, codificati anche da retrovirus sono c-myc, fos e jun.

4 c-myc Il gene myc è conservato in tutte le specie animali e fu inizialmente scoperto in diversi retrovirus responsabili nell induzione di sarcomi, carcinomi e leucemie mieloidi. La proteina codificata da myc è un fattore trascrizionale (p64 myc ) presente nelle cellule in attiva proliferazione anche se myc svolge un ruolo importante anche nell indurre l apoptosi. Myc è classificato tra i gene della pronta risposta insieme a fos e jun, indotti da fattori di crescita mitogenici, con il ruolo di indurre la progressione dalla fase G0-G1 alla fase S del ciclo cellulare.

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6 Myc e ciclo cellulare: cicline D, E e A geni che codificano per le CDK2 e CDK4 gene dell enzima ornitina-decarbossilasi (ODC), essenziale nel metabolismo degli acidi nucleici reprime i geni delle CDKI (inibitori delle CDK) attiva i geni che codificano per E2F reprime il gene dell inibitore delle CDK (p27 KIP1 ).

7 I LIVELLI ECCESSIVI DI MYC POSSONO INDURRE LA CELLULA AD ATTIVARE IL PROCESSO DI APOPTOSI.

8 fos e jun Il fattore di trascrizione fos (p55) dimerizza con il fattore di trascrizione jun (p39) per formare il fattore di trascrizione AP-1, il quale aumenta l espressione di diversi geni che controllano la divisione cellulare. L attività di AP-1 è indotta da fattori di crescita, citochine, ormoni polipetidici, neurotrasmettitori, interazione cellula-matrice, infezioni virali e batteriche e da diversi stress fisici e chimici.

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10 AP-1 è un dimero composto da proteine della famiglia Jun (c-jun, JunB, JunD), Fos (c-fos, FosB, Fra-1, Fra-2). Riconosce sequenze del DNA TGAG/CTCA o CRE (TGACGTCA)

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12 FATTORI DI CRESCITA I fattori di crescita (GF) sono proteine di piccole dimensioni che stimolano la proliferazione, il differenziamento, la sopravvivenza e la motilità cellulare. La maggior parte dei GF hanno effetto positivo su questi fenomeni, anche se alcuni come il TGF-b (trasforming growth factor beta) agiscono come segnale inibitorio. Nell ambito delle patologie tumorali molti geni che codifica per GF, si comportano da oncogeni, in quanto subiscono mutazioni tali da indurre la cellula ad una sovra-produzione del GF con conseguente attivazione di uno stimolo proliferativo autocrino o paracrino.

13 WNT SIGNALING Attivazione della trascrizione di geni bersaglio che inducono proliferazione cellulare e disassociazione delle E-caderine con conseguente perdita dei legami cellula/cellula e stimolo della mobilità cellulare.

14 Insulin Growth Factor (IGF) Fra i vari fattori di crescita che giocano un ruolo determinante nei vari processi che inducono proliferazione cellulare, sopravvivenza cellulare e resistenza ai chemioterapici e radioterapia c è il sistema IGF (insulin growth factor). Il sistema IGF consiste di due ligandi, IGF-I e IGF-II, tre recettori di membrana (IGF-IR, IGF- IIR) e recettore dell insulina (IR) e sei proteine di legame ad alta affinità (IGFBP 1-6). I recettori IGF-IR una volta tradotti vengono glicosilati, dimerizzano e processati in due subunità a e b che attraverso ponti disolfuro vanno a formare il tetramero funzionante (b-a-a-b) che viene trasportato in membrana. Attraverso la subunità a che è extracellulare si ha il legame del IGF, con conseguente trasduzione del segnale a livello intracellulare che consiste nella fosforilazione di residui di tirosina in domini di tirosin chinasi.

15 La cascata di attivazione comporta, principalmente, tre tipi si segnali: 1.attivazione del pathways del fosfatidilinositolo 3- chinasi (PI-3K), Akt, mtor che attiva la sintesi proteica e i meccanismi antiapoptotici mediante inattivazione (fosforilazione) di Bad 2.attivazione del pathway di Ras/Raf1/MEK/ERK che induce proliferazione cellulare 3.attivazione di altri meccanismi cellulari che inducono l espressione di fattori di crescita, citochine e integrine

16 Inoltre il IGF-IR svolge un ruolo nel facilitare : 1.il passaggio dalle fase G0 a G1 mediante attivazione della p70 S6K, che fosforila la proteina ribosomiale S6 che stimola l insieme di proteine ribosomiali necessarie a entrare nel ciclo cellulare. 2.Inoltre promuove anche il passaggio dalla fase G1 a S mediante l induzione dell espressione della ciclina D1 e della CDK4, comportando fosforilazione del fattore Rb.

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18 L autofagia è regolata negativamente da mtor, una serine/threonine kinase, via la formazione del complesso mtorc1 complex. Inibitori di PI3K e mtor esercitano un forte autophagy-inducing effect

19 RECETTORI PER I FATTORI DI CRESCITA L eccessiva stimolazione della proliferazione cellulare, nei tumori, dipende anche dall amplificazione o dalle mutazioni dei geni codificanti per i recettori dei fattori di crescita, con conseguente aumento dell espressione dei recettori o la sintesi di recettori strutturalmente e funzionalmente modificati, con conseguente alterazione del segnale e guadagno di funzione. Tali recettori possono essere suddivisi in base ai residui presenti nella regione citoplasmatica in: tirosinchinasici e serin/treoninchinasici Nell ambito dei tumori, i recettori tirosinchinasici (RTK) sono quelli maggiormente mutati nei tumori e sono tra i geni codificati dagli oncogeni virali.

20 I RTK si possono suddividere in: tirosinchinasi citoplasmatiche recettori con attività tirosinchinasica I RTK sono suddivisi in diverse famiglie che si caratterizzano principalmente per la porzione aminoacidica extracellulare in: porzione ricca di cisteine come EGFR, IR, IGFR domini simili a quelli delle Ig (Ig like motif), come PDGFR e FGFR domini con sequenze di fibronectina combinate a sequenze Ig-like, come efrinaar, efrinabr, angiotensina.1r domini che reagiscono con le caderine in presenza di Ca 2+

21 Attivazione dei recettori RTK: Il sito catalitico, in posizione C-terminale ha attività proteinchinasica, ed è costituito da tre regioni: 1) legante ATP, 2) attività fosfotransferasica, 3) contenente una proteinchinasi attivata da fosforilazione dopo legame del ligando al recettore. Gli RTK sono presenti in stato inattivo come monomeri e dimerizzano dopo interazione con il ligando. La dimerizzazione induce un cambiamento conformazionale che attiva il sito catalitico con attività tirosinchinasica, che induce fosforilazione nei siti catalitici che in altri residui.

22 Il primo segnale dell attivazione del recettore, mediata dal ligando, e la fosforilazione nel dominio citoplasmatico del recettore stesso, mediata dalla dimerizzazione del recettore. receptor-directed protein-tyrosine phosphatases (PTPs)

23 Il legame ligando-recettore recluta proteine adattatrici contenenti SH2 domain L autofosforilazione dei recettori genera siti di fosforilazione i quali diventano siti recettivi per proteine SH2 che includono fosfolipasi C o GRB (growth factor receptor bound). I domini SH3 agiscono poi come domini di legame per domini ricchi in prolina presenti in molecole effettrici che agiscono come percorsi molecolari a valle.

24 Trasduzione del segnale La posizione specifica delle tirosine presenti nei RTK è quella che rende che condiziona le interazioni con specifiche proteine citoplasmatiche da fosforilare. In particolare i domini SH2 presenti su specifiche proteine (proteine con attività enzimatica) vengono fosforilate dai TRK o mediante proteine adattatrici che facilitano il contatto con le proteine che sono substrato delle proteinchinasi. I residui carichi positivamente, presenti nelle regioni SH2 reagiscono con i gruppi fosfato (carichi negativamente) presenti sulle TK e permettono la formazione di un complesso che attiva la proteina contenente il dominio SH2. Altri domini proteici che interagiscono con le tirosine fosforilate sono i SH3 e PTB (phosphotyrosin binding).

25 RAS RAS è un oncogene coinvolto nella proliferazione cellulare ed è composto da tre membri (H, K, N)-RAS. Sono proteine legate nel lato citoplasmatico della cellula ed il loro ruolo è quello di legate, nello stato inattivo GDP. Mutazioni puntiformi del gene Ras sono l anomalia singola piu comune di oncogeni trasmesse come carattere autosomico dominante.

26 Queste proteine sono attivate dai RTK e passano continuamente da una forma inattiva legante il GDP ad una forma attiva legante il GTP. Le proteine ras sono state scoperte nei virus oncogeni : K-ras-A, K-ras.B : sarcoma murino, il proto oncogene umano nel cromosoma 12 H-ras: sarcoma murino, il proto oncogene umano nel cromosoma 11 N-ras: neuroblastoma e carcinomi umani, presente nel cromosoma 1 Il prodotto di questi geni distinti è molto simile e viene denominato p21 ras

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28 Mutazioni nei geni ras hanno come conseguenza quella di ridurre l attività GTPasica, con conseguente mantenimento del GTP e quindi prodotto attivo o mutazioni che facilitano il distacco del GDP e conseguentemente ras attivo. Il risultato finale è che ras rimane piu a lungo o costitutivamente attivo, stimolando la proliferazione cellulare delle cellule tumorali.

29 MUTAZIONE DI KRAS Inactive KRAS GDP active KRAS GTP GAP Inactive KRAS GDP + GTP GAP Mutant KRAS active + Downstream signal transduction cascade

30 mutazioni attivanti RAS mutationi RAS si riscontrano nel 30% dei tumori HRAS1 KRAS2 NRAS R-RAS Ras-mut = GAP- refractory GTPase Un alta incidenza di mutazioni di K-RAS si riscontrano nei tumori al pancreas (70 100%)

31 Meccanismo di trasduzione di ras Nel citoplasma delle cellule è presente una proteina denominato GRB-2 con domini SH2/3 che gli permettono di formare un complesso con una proteina denominata SOS (che è un fattore di scambio di nucleotidi guanidilici). Quando la cellula riceve un segnale da un fattore di crescita che lega RTK, il complesso GRB-2 SOS interagisce mediante i domini SH2/3 o PTB (phosphotyrosin binding) ai residui fosforilati del RTK. Questo contatto permette il reclutamento da parte di SOS della proteina ras (che lega il GDP), questo permette lo scambio con il GTP e ras si attiva.

32 Questa attivazione comporta la fosforilazione della serina/treonina chinasi raf-1 che a sua volta fosforila una MAPKK (MEK) (Mitogen Activated Protein Kinase Kinase) che a sua volta fosforila una MAPK (ERK1/2) che trasloca nel nucleo, fosforila fattori di trascrizione, come c- fos, myc e attiva la proteina ribosomiale S6, che attivano la trascrizione di geni coinvolti nell indurre la proliferazione cellulare o contribuiscono alla crescita cellulare. Quando ras lega il GTP assume un cambiamento conformazionale che comporta anche il reclutamento delle GTP-asi activating protein (GAPs) come la p120 GAP e la neurofibromina1 (NF1) che riportano ras nella forma legante il GDP. NF-1

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34 PI3-K pathways

35 I pathways RAS, PI(3)K e mtor formano una rete biochimica intersecata che, quando mutata, guida la crescita cellulare in maniera indipendente dall ambiente circostante. Questi pathways guidano la tumorigenesi attraverso la fosforilazione coordinata di proteine che attivano la progressione del ciclo cellulare, la regolazione della sintesi di proteine e di fattori trascrizionali che regolano l espressione di geni coinvolti in questi processi.

36 Il pathway PI(3)-chinasi. PI(3)K è attivato sia da RAS che da RTK e di seguito attiva diversi pathways a valle attraverso la generazione del secondo messaggero lipidico fosfatidil-inositol-3,4,5-trifosfato (PtdIns(3,4,5)P3. In particolare la famiglia di chinasi serina-treonina AKT è considerata come il principale bersaglio di PI(3)K nei tumori. Esistono tre classi di PI(3)Ks, ma sembra che solo il sottogruppo IA-PI(3)K sia coinvolto nei tumori. IA-PI(3)K sono eterodimeri composti da una famiglia di subunità regolatorie (p85) e di subunità catalitiche (p110).

37 Sono capaci di fosforilate l anello inositolico del lipide di membrana fosfatidilinositolo 4,5 bifosfato per generare il secondo messaggero PtdIns(3, 4, 5)P3. Inoltre le subunità p85 contengono dei domini che legano specifici residui nella regione citoplasmatica dei RTKs, questo legame permette di generare un pool locale di PtdIns(3, 4, 5)P3. Le subunità p110 possono legarsi direttamente ed attivare RAS. Una delle famiglie maggiormente attivate da PtdIns(3, 4, 5)P3 sono le serine/treonine chinasi AKT. AKT controlla il ciclo cellulare, la sopravvivenza e la crescita cellulare attraverso la fosforilazione di diversi substrati.

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40 Regolazione del pathway PI3K

41 Per i tumori con lesioni genetiche definite, l abilità di superare un dato bersaglio terapeutico è data dalla capacità di acquisire altre mutazioni che superano l effetto del farmaco o effettori biochimici del pathway mutato o di up-regolare il pathway disregolato. a) l attivazione del fattore IF4E e HIF, inizialmente determinato dal pathway Ras/Akt e bloccata con Rapamicina risulta inefficiente causa attivazione di pathways alternativi.

42 b) In tumori con lesioni iniziali in PI(3)K o altri regolatori di mtor non hanno vie alternative per attivare IF4E and HIF. Questi tumori rispondono a Rapamicina

43 c) In tumori che esprimono EGFR e ERBB3 inibitori dell eterodimero bloccano la via delle IP3K. d) Nei tumori dove ERBB3 non è espresso la via IP3K è regolata da altre vie e gli inibitori non funzionano

44 PTEN è una fosfatasi che lega e distrugge PIP3 convertendolo in PI(4,5)P 2 o PI(3,4)P 2

45 mutazioni PTEN Prostatic carcinomas PTEN mutato negli stadi avanzati. Le cellule PTEN-negative cells diventano andrigeni resistenti E tendono a metastiizzare carcinoma mammario: inattivato 15-30% GLIOMA: mutazioni di PTEN sono indice di aggressività Carcinoma follicolare della tiroide (25%),

46 EGF RECEPTOR

47 EGF-R EGF-R ha un ruolo importante nell ambito di diverse patologie tumorali in quanto la sua attivazione costitutiva lo rende responsabile dell attivazione di meccanismi di proliferazione cellulare. L omologo del protoncogene EGF-R è stato scoperto nel virus dell eritroblastosi aviaria e denominato v-erb. L analisi della sequenza aminoacidica di v-erb ha dimostrato che questo oncogene virale codifica per una proteina (gp65) che è simile ad una parte del EGFR, quindi è un recettore troncato della porzione extracellulare responsabile del legame a EGF, ma contenente la porzione citoplasmatica con attività tirosinchinasica che è costitutivamente attiva. I pathways principalmente attivati dall attivazione di EGF-R sono quello di Ras/MAPchinasi e PI3 chinasi/akt, che agiscono entrambi nella mitogenesi e sopravvivenza cellulare.

48 ATTIVAZIONE DEI SEGNALI INTRACELLULARI EGFR-DIPENDENTI 1)Legame del ligando specifico nella porzione extracellulare del EGFR 2)Formazione dell omodimero o eterodimero che causa la fosforilazione ATP-dipendente di specifici residui di tirosina nel dominio intracellulare di EGFR 3)Attivazione dei pathways intracellulari: 1) Ras-Raf-MEK-MAPK che controllano la progressione della fase G1/S 2) PI3K-Akt che attiva una cascata antiapoptotica e di sopravvivenza

49 EGFR è un recettore appartenente ad una famiglia di quattro recettori.

50 Tre diverse strategie terapeutiche per interagire con tale sistema e inibire la trasduzione dei segnali proliferativi : Uso di anticorpi monoclonali antirecettore che si legano alla porzione extracellulare della molecola recettoriale e impediscono il legame con il ligando Uso di farmaci inibitori selettivi della tirosinchinasi associata al recettore Uso di farmaci che agiscono sulle fasi piu avanzata della cascata della trasduzione del segnale come i farmaci che interagiscono con le proteine della famiglia RAS (inibitori della farnesiltrasferasi)

51 Meccanismo d azione dei farmaci Anti-EGFR Le conseguenze sono: - Arresto delle cellule in fase G1 con incremento di p27 (inibizione delle CDK) -Inibizione dell angiogenesi tramite il blocco della sintesi di TGFa, VEGF, IL-8, FGF. -inibizione dell invasività e delle metastasi

52 Meccanismo dei Anti-EGFR Monoclonal Antibodies. L anti-egfr cetuximab, che è una immunoglobulina IgG1 induce immunorisposta anticorpo dipendente, citotossicità cellulo-mediata (Panello A). Inoltre gli anticorpi anti-egfr inducono internalizzazione del recettore e down-regolazione incrementando la sua degradazione (Panello B).

53 Nella FISH il centromero del cromosoma 17 e' marcato con un segnale fluorescente verde e il gene HER-2 con un segnale fluorescente arancio. In breve si contano circa 60 nuclei cellulari e in ognuno di essi si fa il rapporto tra segnale verde e segnale arancio.il tumore e'definito "positivo" per l'amplificazione genica quando il rapporto gene/cromosoma e'>2

54 Percentuali di tumori EGFR+ Tipo di Neoplasia % espressione EGFR Vescica 31-48% Mammella 14-91% Utero 90% Colon 25-77% Esofago 43-88% Stomaco 4-33% Glioma 40-63% Testa-collo % Ovaio 35-70% Pancreas 30-89% Prostata 40-85% Rene 50-90% Polmone 40-80%

55 INIBITORI DELLE TIROSINCHINASI

56 REGOLAZIONE DELL ATTIVITA DELLE TK TKs sono divise in due classi, recettori TKs transmembrana con dominio attivatore extracellulare e dominio catalitico intracellulare e TKs citoplasmatiche che mancano del dominio extracellulare che si trovano nel citoplasma, nucleo e membrane interne. L attività delle TK è regolata in modo tale che in condizioni non proliferative sono defosforilate, perchè è assente il ligando. Le TK-non recettori associate sono mantenute in uno stato inattivo da inibitori cellulari e stimoli di diversa natura dissociano questi inibitori e inducono la fosforilazione mediante altre chinasi. L azione delle chinasi è terminata dalle fosfatasi che idrolizzando il fosfato presente sulla tirosina ed inducono gli inibitori.

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58 Un meccanismo comune nei tumori ematologici è l attivazione delle TK mediante la fusione di un recettore o non recettore TK con una proteina partner, come conseguenza di una traslocazione cromosomica. Un aspetto frequente della proteina partner è un dominio che causa una oligomerizzazione costitutiva della TK in assenza di ligando, promovendo autofosforilazione ed attivazione. BCR-ABL nella CML (leucemia mielodie cronica), dove si genera una proteina chimerica che costituisce una TK costitutivamente attiva. Mutazioni della chinasi FLT3 nella leucemia mieloide acuta (AML) che rende la TK attiva in assenza di ligando.

59 Leucemia Mieloide Cronica (LMC) Il cromosoma Philadelphia x Y Presente in oltre il 95% dei pazienti affetti da LMC

60 Rappresentazione schematica del cromosoma Philadelphia (Ph) Leucemia Mieloide Cronica La traslocazione t (9;22) Cromosoma 9 Cromosoma 9+ Cromosoma 22 Cromosoma Ph bcr Bcr-Abl abl Proteina di fusione con elevata attività tirosina-chinasica La fusione BCR-ABL durante la traslocazione e associata a un notevole aumento dell attività tirosinchinasica di ABL e da a quest ultima la capacità di legare il sito SH2 di attacco a GRB2.

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62 Meccanismi di resistenza secondaria all Imatinib Mutazioni di BCR-ABL Aumentato efflusso dalla cellula (glicoproteina MDR) Iperespressione di BCR-ABL Alterazioni genetiche aggiuntive

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64 ONCOSOPPRESSORI

65 Geni oncosoppressori Geni la cui mancata attività all interno della cellula favorisce la crescita tumorale. L alterazione nella struttura o nell'espressione di questi geni (inattivazione) se è a carico di entrambi gli alleli determina perdita di funzione e fenotipo tumorale. Inibitori della crescita (TGF-beta) Recettore di inibitore (TGF-beta Receptor) Inibitore di trasduttore del segnale (NF1, PTEN) Inibitori dei fattore di trascrizione (Rb) Inibitori del ciclo cellulare (CDKI, p16, p21) Fattori apoptotici (Bad, Bax)

66 Funzione di controllo dell integrità del genoma (p53) Corretta duplicazione del genoma Riparazione del DNA BRCA-1 Integrità del genoma (stabilità cromosomi riparazione DNA) BRCA-2 Integrità del genoma (stabilità cromosomi, riparazione DNA) NER Integrità del genoma (riparazione DNA per escissione dei nucleotidi) MSH2 Integrità del genoma (riparazione DNA da errato appaiamento) ATM Integrità del genoma attiva sistemi riparazione, attiva p53, rallenta ciclo mitotico in fase G2

67 Meccanismi di inattivazione di geni oncosoppressori Perdita del prodotto o formazione di prodotto inattivo (troncato) a causa di Delezione (perdita gene, perdita intero cromosoma) Mutazione (non senso, di senso, frameshift) Epigenetica (es metilazione) (ipermetilazione del promotore di MLH1 impedisce il mismatch repair) Prodotti virali

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69 TP53 p53 funziona principalmente come fattore trascrizionale e controlla l espressione di un ampio spettro di geni, coinvolti nelle piu disparate funzioni. p53 è spesso mutato nei tumori. Mutazioni che producono un p53 troncato o malfunzionante o mutazioni che interferiscono con il DNA Binding Domain sono predizione di una pessima diagnosi.

70 Per quanto la perdita o mutazioni in p53 sia associate ad un incremento della suscettibilità a sviluppare un tumore, topi -/- per p53 sviluppano normalmente e altre osservazioni indirizzano p53 anche verso un ruolo nella normale fisiologia cellulare. Questi studi includono il ruolo di p53 nel regolare la longevità e l invecchiamento, la glicolisi e la risposta apoptotica dopo ischemia, la sopravvivenza cellulare dopo danni genotossici o stress ossidativo, angiogenesi, rimodellamento osseo ed autofagia.

71 TP53 Mutazioni Germinali predispongono a diversi tipi di cancro Tumor spectrum in TP53 mutation carriers Breast 28.9 >80% Soft tissues Brain Bones Adrenal gland Lung Leuk/Lymph. Stomach Colorectum 1.7 Skin 1.5 Ovary 1.5 Other

72 TP53 è un oncosoppressore % topi con tumore p53+/+ 1% at 18 mesi p53+/- 2% at 9 mesi p53-/- 75% at 6 mesi

73 Mutazioni in p53

74 TAD N-terminal [aa1-42] TAD regolazione negativa attraverso interazione con MDM2 Domino transattivante (TAD): attiva geni che codificano per prodotti che esercitano un ruolo inibitorio sulla progressione del ciclo cellulare (p21/waf), ed inibiscono l espressione di geni coinvolti nella progressione della fase G1/S (geni delle cicline). La regolazione dell espressione di questi geni avviene quando p53 trasloca nel nucleo, previa fosforilazione del residuo di serina 316 (ser316), svolta da specifiche chinasi. Contiene anche il sito di legame per MDM2

75 Pro-rich region fra TAD e DBD PxxP presenti 5 zone nella regione Delezione della P- rich region riduce la risposta apoptotica e il blocco del ciclo cellulare, ma non la normale risposta trascrizionale Contiene residui che diventano fosforilati dopo la risposta apoptotica Regione ricca in prolina: regione ricca di aminoacidi basici, che attivati in seguito a fosforilazione permette il legame al DNA tramite il DNA Binding Domain

76 p53 DBD 2 a-helical loops che contattano il DNA Altre strutture deputate Al legame al DNA

77 Mutazioni alla DBD La maggior parte delle mutazioni che causano il tumore si trovano nella DBD Destabilizzando le interazioni. p53 lega il DNA come tetramero

78 Dominio di tetramerizzazione 2b + 2a struttura Legata alla DBD via 37aa

79 C-terminal allosteric domain Diversi eventi nella regione C-terminale possono riattivare la regione DBD Dominio legante il DNA: permette l interazione con il DNA

80 ATTIVAZIONE di p53 Il funzionamento di p53 è regolato da alcune proteine effettrici: ATM e ATR, le quali riconoscono il DNA danneggiato. ATM e ATR attivano le chinasi CHK2 e CHK1. CHK1 attraverso una serie di processi inibisce le CDKs, mentre CHK2 come ATM stesso attivano p53, il quale a sua volta attiva p21/waf (bloccando la proliferazione), attiva geni pro-apoptotici (Bad, Bax, PUMA, ) ed attiva GADD45 (growth arrest and DNA-damage inducible). Se il DNA viene riparato p53 attiva il suo inibitore MDM2, che a sua volta lega p53 e lo porta a degradazione. Se il danno non viene riparato p53 attiva il processo di apoptosi.

81 ATM e ATR fosforilano p53 arrestando la fase G1/S nabissi 14

82 I meccanismi che controllano il passaggio dalla fase G1 alla S, consistono anche di processi d inibizione della proliferazione cellulare, i quali regolano l attività dei complessi C/CDK. Le due principali classi d inibitori sono fattori proteici della famiglia Cip/Kid e INK4/Arf. La famiglia Cip/Kid è composta da tre mebri : p21waf, p27 e p57. p57 funziona come freno all interno del ciclo cellulare, mentre p21/waf sono principalmente dei mediatori di segnali citostatici. Ink4 e Arf agiscono rispettivamente bloccando il ciclo cellulare ed agendo sul fattore trascrizionale p53.

83 Inibizione di P53 MDM2 associata con p53 TAD MDM2-binding comporta 1. Repressione della transattivazione 2. Destabilizzazione di p53 in quanto MDM2-binding stimola degradazione di p53

84 p53 and MDM2 formano un feedback loop autoregolatorio. p53 stimola l espressione di MDM2; MDM2 inibisce p53 bloccando la sua attività trascrizionale, favorendo la sua degradazione. DNA damage favorisce la fosforilazione di p53, prevenendo la sua associazione con MDM2. ARF, previene la degradazione di p53 MDM2-mediata. Quindi inibitori dell interazione p53 MDM2 possono attivare p53 nei tumori esprimenti p53.

85 Diverse strategie per rompere il legame MDM2-p53 Prima dell attivazione attivato fosforilazione Rottura del legame attivazione fosforilazione Inattivata l azione di E3 Activated ARF-binding inactivated E3-act

86 Se la riparazione del DNA non viene effettuata allora p53 puo indurre apoptosi attraverso l attivazione di geni proapoptotici della famiglia Bcl-2, Fas e repressione di geni anti-apoptotici. L azione di p53 come fattore responsabile del blocco del ciclo cellulare o dell attivazione dell apoptosi sembra sia regolata dai sui livelli all interno della cellula. Bassi livelli inducono blocco del ciclo cellulare mentre alti livelli l apoptosi.

87 Cell death (Apoptosis) by p53

88 Bersaglio: Microambiente La necessità per i tumori di rifornirsi di nutriente puo essere contrastata con farmaci antiangiogenetici, come nell uso di anticorpi monoclonali contro il VEGF, nel trattamento del cancro al colon, ma è un approccio che potrebbe essere applicato in molti tumori. Inoltre la terapia che agisce piu sull ospite (cellule endoteliali) che sul tumore è sicuramente meno soggetta a resistenza farmacologica, in quanto le cellule normale hanno sicuramente meno plasticità genetica delle tumorali. Studi recenti riguardanti le interazioni tumore-stroma rivelano un complesso scambio d informazioni che non riguardano solo la vascolarizzazione. Lo stroma comprende oltre ai fibroblasti un numero elevato di cellule infiammatorie che possono chiaramente influenzare la crescita del tumore. Uno dei fattori stromali maggiormente studiato è TGF-b, il quale svolge diversi ruoli che possono influenzare positivamente o negativamente la crescita tumorale.

89 TGF-beta (TGF-b) Nei tessuti, l omeostasi richiede un bilanciamento delle interazioni fra le cellule e la matrice extracellulare. Queste interazioni cooperative coinvolgono numerose citochine che agiscono attraverso specifici recettori di membrana. Quando il bilanciamento tra cellule e matrice extracellulare è perturbato si possono sviluppare diverse patologie. Questo fenomeno è particolarmente evidente per il TGF-b che è un membro della famiglia di fattori di crescita che include la proteina morfogenetica ossea e l activina. Quasi tutti i tipi di cellule producono TGF-b ed hanno i recettori per il TGF-b il quale regola la proliferazione e la differenziazione delle cellule, lo sviluppo embrionale, la riparazione delle ferite e l'angiogenesi.

90 Il ruolo essenziale del TGF-b, dimostrato in diversi esperimenti, dimostra che l'incremento o decremento di TGF-b è legato a diversi tipi di patologie, fra cui il cancro. Ci sono tre isoforme di TFG-b (1, 2, 3) ognuna codificata da geni distinti ma strutturalmente altamente conservate ma differenti nell affinità di legame al recettore. Il TGF-b è sintetizzato come un largo precursore contenente una regione che viene tagliata prima della secrezione del precursore, ma che rimane attaccata mediante legami non covalenti. Una volta secreto il TGF-b viene immagazzinato nella matrice extracellulare, in un complesso comprendente una proteina di legame (TGF-b binding protein, TGFBP), che ne evita il legame al recettore. Il TGF-b viene poi rilasciato mediante una glicoproteina di matrice (trombospondina-1) la quale cambia la conformazione della TGF-b BP. Il TGF-b attivo agisce su tre tipi di recettori (I, II, III), ma i tipi I e II sono quelli specifici solo per TGF-b.

91 TGF-β è immaganizzato nella ECM in forma inattiva complessato con beta-glicani e decorina precursore maturo Dopo il taglio TGF-β forma omodimeri via legami S-S Tagliato ma ancora legato alla ECM TGFBP TGF-β attivo puo essere rilasciato tramite acidificazione Contatto cellula-cellula, proteasi, trombospondina

92 I recettori di tipo II e II contengono delle chinasi serina-treonina nel loro dominio intracellulare che attivano la fosforilazione di diversi fattori di trascrizione conosciuti come SMAD (10 membri). SMAD2 e SMAD3 sono fosforilati mediante attivazione del TGF-RI, SMAD4 è un partner comune di tutti gli SMAD attivati da recettori, mentre SMAD6 e SMAD7 bloccano la fosforilazione di SMAD2 e SMAD3, inibendo così il segnale attivato da TGF-b. Un meccanismo generale dell azione del TGF-b, consiste nel legame del TGF-b al TGF-RII che recluta, lega e fosforila il TGF-RI il quale stimola l attività chinasica. che fosforila SMAD2 o SMAD3 i quali formano un complesso che migra nel nucleo e lega altri fattori trascrizionali regolando la trascrizione di specifici geni

93 TGF-β /SMAD

94 Ruolo del TGF-b nel cancro Regolazione del ciclo cellulare ed effetto sulla proliferazione. Nelle cellule ematopoietiche, endoteliali ed epiteliali il TGF-b è un potente inibitore della proliferazione cellulare, stimolando la sintesi delle CDKI (p15) ed inibendo le funzioni e la produzione delle CDK2, CDK4, ciclina A ed E. Questi effetti risultano in una riduzione della fosforilazione di Rb, bloccando cosi l attivazione dei fattori E2F. Nei tumori le mutazioni a carico del pathway TGF-b, comportano una proliferazione incontrollata. Questa perdita nel controllo della proliferazione ha come conseguenza anche un induzione della secrezione di TGF-b da parte dei fibroblasti, che agisce (essendo le cellule tumorali resistenti) sugli stessi fibroblasti, sul sistema immunitario, sulle cellule endoteliali e sulla muscolatura liscia causando immunosoppressione, angiogenesi e stimolando l invasività del tumore.

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96 Stimola l espressione dei CDKI come p15 e p21e reprime l espressione di c-myc TGF-β L arresto è mediato dalla downregolazione di Myc, il quale rilascia Miz1. Miz1 si lega al promotore del p15 e lo attiva in co-operazione con il complesso Smad.

97 Topi SMAD4 +/- sviluppano polipi duodenali e gastrici con abbondante stroma ed infiltrazioni di eosinofili a 6-12 mesi Carcinomi Smad4 +/- Apc +/- mostrano proliferazione delle cellule stromali e forte invasione tissutale.

98 Effetto sulle metastasi TGF-b è uno dei piu potenti stimolatori della produzione e deposizione della matrice extracellulare. Stimola la produzione e influenza le proprietà adesive della matrice extracellulare, attraverso principalmente due meccanismi. TGF-b stimola i fibroblasti ed altre cellule a produrre le proteine della matrice extracellulare e le proteine di adesione cellulare, incluso il collagene, fibronectina ed integrine. Secondo, TGF-b decrementa la produzione di enzimi che degradano la matrice extracellulare, incluso collagenasi, eparinasi e stromelisine ed incrementa la produzione di proteine che inibiscono gli enzimi che degradano la matrice extracellulare come gli inibitori dell attivatore del plasminogeno e gli inibitori delle metalloproteasi (TIMPs). Nei tumori TGF-b è aumentato e la sua azione induce stimolazione delle molecole di adesione cellulare, stimolando l invasività Nabissi e l angiogenesi. 15

99 Cosa succede alle cellule tumorali quando TGF-β pathway è spento(via perdita di SMAD o TGFB-R2) Le cellule non sono piu responsive a TGF-β ma continuano a produrlo e rilasciarlo Cellule di carcinoma sono immerse nelle cellule stromali normali interagendo 1. Produzione locale di TGF-β sopprime la risposta immunitaria antitumorale 2. TGF-β stimola l angiogenesi TGF-beta1 è spesso elevato nel plasma di pazienti con tumore al seno, polmone, fegato e prostata

100 Effetti immunosoppressivi TGF-b che è prodotto da tutti i leucociti, promuove la loro differenziazione ed inibisce la proliferazione ed attivazione. Sopprimendo la proliferazione leucocitaria, induce una diminuzione di cellule del sistema immunitario, suggerendo un ruolo del TGF-b nell aiutare il tumore a sfuggire dalla immunosorveglianza.

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102 Le particelle virali o virioni, hanno piccole dimensioni (da 0,02 a 0,4 m) e una semplice organizzazione strutturale. VIRUS ONCOGENI Sono costituiti da piccole particelle formate essenzialmente da solo materiale genetico (RNA o DNA), detto core, avvolto da membrane protettive, quali capside e pericapside di natura lipo e/o glicoproteico, che ha una duplice funzione di proteggere il genoma e mediare la penetrazione nella cellula ospite. La mancanza di ribosomi e di sistemi enzimatici deputati alla produzione di energia (ATP) fa si che il processo di replicazione possa avvenire solo quando il genoma virale, penetrato nella cellula ospite, si spoglia della capsula ed inizia il suo processo replicativo con il contributo della cellula ospite.

103 Molti virus hanno invece un secondo rivestimento, proveniente dalla membrana cellulare della cellula ospite e formato da fosfolipidi. Questo secondo rivestimento è chiamato envelope, su cui sono evidenti le molecole necessarie per l infezione.

104 Virus oncogeni Le caratteristiche generali che sono rappresentative della trasformazione virale delle cellule eucariotiche sono: 1) la singola interazione di una particella virale con la cellula suscettibile è sufficiente per indurre la trasformazione 2) La trasformazione induce una modificazione genetica spesso irreversibile nella cellula infettata, in quanto il genoma virale s integra stabilmente nel DNA cellulare. Per alcune forma virali il DNA virale rimane nella cellula ospite in forma episomiale (DNA non integrato).

105 3) La trasformazione comporta l espressione dei geni virali necessari al mantenimento del DNA virale nella cellula infettata. 4) Le cellule trasformate possono rilasciare il virus, esprimere antigeni virali (nucleari, citoplasmatici o di membrana), acquisire un fenotipo immortalizzato (perdere i meccanismi di controllo della proliferazione e crescere in modo indefinito).

106 Virus oncogeni a DNA I virus oncogeni a DNA appartengono a cinque famiglie: PAPOVAVIRUS: PA (papilloma), PO (polioma), VA (virus vacuolizzante) ADENOVIRUS: isolati per la prima volta dalle adenoidi HERPESVIRUS: induce delle striscianti progressioni di lesioni erpetiche (herpes dal greco strisciare) POXVIRUS: deriva dalla parola inglese pock (pustola) HEPADNAVIRUS: deriva da HEPA(tic), DNA, virus

107 Il comportamento dei virus dipende dalla permissività della cellula ospite, infatti nelle cellule permissive in cui viene permessa la replicazione delle particelle virali, dopo integrazione del genoma virale in quello dell ospite si ha una infezione di tipo produttivo con effetto citopatico litico e quindi morte della cellula. Di conseguenza non si ha trasformazione cellulare con possibile sviluppo di cellule tumorali.

108 Nelle cellule non permissive non si ha produzione delle particelle virali necessarie a completare il ciclo replicativo del virus e quindi i pochi geni virali espressi possono spingere la cellula verso la trasformazione. La trasformazione puo contribuire allo sviluppo di tumori in quanto puo indurre la modifica di meccanismi cellulari (proliferazione, apoptosi, sopravvivenza, immunosoppressione) grazie all integrazione di porzioni di DNA virale nel DNA della cellula ospite che avrà introdotto un nuovo gene o alterata l espressione di geni preesistenti, inoltre la cellula trasformata non rilascia mai il virus infettivo.

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110 Nell ambito del processo di trasformazione numerose proteine virali interagiscono con le proteine cellulari dell ospite formando dei complessi che modificano i normali processi regolatori cellulari, spesso regolando attivando proto-oncogeni o disattivando le funzioni dei proto-oncosoppressori.

111 Under typical circumstances, viruses do not cause cancers except in the settings of immunosuppression and/or complementing host cell mutations. Non-tumorigenic viruses, which constitute the overwhelming majority of viruses, target many of the same innate immune and tumour suppressor pathways as tumour viruses but do so in ways that do not place the host at risk for carcinogenesis.

112 PAPOVAVIRUS Famiglia di virus di piccole dimensioni con DNA bicatenario racchiuso in un capside privo di envelope, costituita da due generi: i poliomavirus ed i papillomavirus. Il genoma dei poliomavirus è costituito da 7 geni codificanti proteine precoci e tardive, le tardive sono proteine virali strutturali e quindi non vengono mai espressi nelle cellule trasformate. Le proteine precoci (antigene T piccolo, medio e grande),sono necessarie per la replicazione del DNA virale nelle cellule permissive e per la trasformazione. Nelle cellule trasformate l antigene T medio si associa alla membrana plasmatica ed attiva la protein-chinasi c-src, antigene T piccolo si localizza nel nucleo mentre il T grande è in parte associato alla membrana plasmatica diventando bersaglio dei linfociti T citotossici. Comunque l infezione da poliomavirus non è attualmente associato a tumori umani, pur essendo presenti in diverse patologie umane regioni geniche del virus.

113 PAPILLOMAVIRUS La particella del Human Papillomavirus (HPV) consiste di un DNA circolare di 8000 bp racchiuso in un capside composto da due molecole (L1 e L2). Il genoma ha la capacità di codificare per queste due proteine e per almeno sei proteine precoci (E1, E2, E4-7) che sono necessarie per la replicazione del DNA virale e per l assemblamento di nuove particelle virali all interno della cellula infettata. I due gruppi di geni sono separati da delle regioni regolatrici (URR) di circa 1000 bp che non codificano per proteine ma contengono cis-elementi necessari per la regolazione genica, la replicazione del genoma e per il suo impacchettamento nelle particella virali

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115 Il ciclo infettivo del HPV inizia quando le particelle infettive raggiungono lo strato basale dell epitelio, dove esse si legano ed entrano nelle cellule, attraverso piccole lesioni. Il ciclo replicativo all interno dell epitelio puo essere suddiviso in due parti: il genoma virale viene replicato in circa 100 copie e mantenuto per un periodo di tempo variabile a questo basso numero di copie all interno delle cellule permissive. Le proteine E1 e E2 sono essenziali per questa replicazione del DNA. Nella seconda fase le cellule basali sono spinte verso il compartimento subbasale, perdono la loro capacità di dividersi ed iniziano il loro programma di differenziamento. Il HPV replica in questo compartimento e per il suo rilascio nell ambiente extracellulare approfitta della disintegrazione delle cellule epiteliali che avviene in conseguenza del loro naturale turn-over nello strato superficiale

116 Le proteine critiche nel processo di replicazione virale sono le proteine E6 ed E7 che interagiscono con diverse proteine cellulari. Pur essendoci differenze fra le proteine E6/E7 nei sottotipi HPV ad alto e basso rischio, le principali interazioni caratterizzate delle proteine E6/E7 sono con le proteine cellulari p53 ed Rb, le quali sono molecole centrali nel controllo del ciclo cellulare. Il legame di E7 a Rb attiva il fattore trascrizionale E2F il quale attiva la trascrizione di geni coinvolti nella replicazione del DNA. La proteina virale E6 interagisce ed inattiva (portandolo a proteolisi) il fattore trascrizionale p53.

117 La conseguenza di questa infezione è la perdita del controllo del ciclo cellulare, della riparazione del DNA ed il rallentamento del processo differenziativo delle cellule epiteliali. L abilità del HPV di persistere ed indurre progressione verso la malignità puo essere spiegata da una particolarità di questo stadio del suo ciclo replicativo. La costante attivazione delle proteine E6/E7 portano ad un incremento dell instabilità genomica, perdita del controllo del ciclo cellulare ed in ultimo al cancro. Durante la progressione del tumore il genoma virale s integra spesso nel genoma della cellula ospite con il risultato di una costante espressione delle proteine E6/E7 mediante stabilizzazione del loro trascritto (mrna), grazie all influenza sulle modifiche della cromatina o mediante la perdita della regolazione negativa della trascrizione mediata dalla proteina virale E2.

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119 Gli HPV attualmente caratterizzati sono piu di 100, di cui 40 capaci di infettare le mucose del tratto genitale e sono caratterizzati come a basso rischio ed alto rischio in conseguenza della loro prognosi clinica. Quelli a basso rischio sono principalmente associati con le lesioni anogenitali mentre quelli ad alto rischio con i tumori ano genitali. Due dei tipi a basso rischio (HPV-6 e HPV-11) causano la maggior parte delle lesioni ano genitali e dei papillomi respiratori ricorrenti. Le infezioni con HPV ad alto rischio causano virtualmente il 100 % dei tumori alla cervice, 90 % dei tumori all ano, 50 % di quelli alla vulva, vagina e pene. HPV-16 e HPV-18 od entrambi sono responsabili del 70 % dei tumori della cervice.

120 La progressione dell infezione da HPV a cancro alla cervice è accompagnata da una sequenza di cambiamenti istologici. La neoplasia intraepiteliale cervicale (CIN) è un anormalità istologica dell epitelio squamoso della cervice che è associata con l infezione da HPV ed è riconosciuta come un potenziale precursore del tumore alla cervice. La CIN è classificata in tre gradi: CIN 1: presenza di una leggera displasia, con presenza di cellule anormali CIN 2: moderata displasia con maggiore presenza di cellule anormali CIN 3: displasia severa con cellule anormali che occupano la maggior parte dell epitelio della cervice.

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122 Nel caso di CIN 2 e 3 la persistenza della displasia è associata con lo sviluppo del cancro, con percentuali rispettivamente del 57 % e 70 %. I due vaccini che sono stati sviluppati prevengono l infezione primaria da HPV e sono costituiti dalle proteine L1 assemblate fra loro in particelle virali-simili che sono morfologicamente identiche al virione HPV ma non contengono il genoma virale. Cosi il vaccino induce una risposta anticorpale virus-neutralizzante. I due vaccini contengono uno particelle virus simile dei ceppi HPV mentre il secondo per HPV

123 Patogenesi dell epatite B. HBV non è direttamente citotossico per le cellule, infatti molti portatori del virus HBV sono asintomatici o hanno lievi danni epatici per quanto vadano incontro a replicazione intraepatica del virus. Quindi si pensa che la risposta immunitaria dell ospite sia il principale determinante del danno epatico, infatti pazienti con difetti immunitari che sono infettati da HBV mostrano spesso lievi danni epatici acuti ma alta possibilità di andare incontro a danni cronici. La risposta immunitaria a HBV coinvolge risposta mediata da linfociti T MHC-classe II CD4+ helper e MCH-classe I CD8+ diretti contro diversi epitopi del core ed envelope dell HBV, mentre nei portatori cronici la risposta linfocitaria è attenuata, con una maggiore presenza di anticorpi anti-hbs

124 Questo tipo di risposta suggerisce che la maggior parte del danno epatico sia dovuto piu ad una risposta antigene-non specifica infiammatoria secondaria data dal rilascio di prodotti citotossici come TNF, ROS, proteasi e cellule natural killer (NK).

125 Carcinoma epatocellulare Un altro aspetto dell infezione da HBV è dato da un alto rischio di sviluppare carcinoma epatocellulare nei pazienti infettati cronici, con un incidenza 100 volte superiore a quella dei non-portatori. Terapia Il successo della terapia nei pazienti con infezione da HBV è nella riduzione dei livelli di viremia (livelli di antigene HBe) e delle disfunzioni epatiche (valutabili dai livelli di aminotransferasi). Attualmente comunque la scomparsa completa del virus si ha solo nel 5% dei pazienti, sebbene lo sviluppo di nuovi antivirali potrebbe incrementare questo dato.

126 Interferone Per molti la somministrazione d interferone alfa è stata la terapia principale, con una risposta positive nel 30 % dei casi (perdita di HBeAg), sviluppo di anticorpi anti-hbe e riduzione dei livelli di aminotrasferasi. Tuttavia gli effetti collaterali, dati in parte dalla stimolazione interferone alfa indotta,di antigeni MHC classe I sugli epatociti, con conseguente attività citotossica da parte dei linfociti T o effetti come febbre, mialgia, trombocitemia e depressione hanno reso difficile l uso di tale trattamento per molti pazienti. Farmaci antivirali Analoghi nucleosidici o nucleotidici (ex. Lamivudine), che bloccano la replicazione virale mediante inibizione dell attività delle trascrittasi inversa (RT) senza dare hanno effetto immunomodulatore ma la terapia induce resistenza farmacologica, mediata da mutazioni puntiformi nel sito catalitico della RT.