RIASSUNTO. L analisi genetica di tratti complessi è semplificata in popolazioni isolate,

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1 RIASSUNTO L analisi genetica di tratti complessi è semplificata in popolazioni isolate, nelle quali inincrocio ed effetto fondatore riducono la diversità genetica di malattie che possono, in tal modo, essere studiate più facilmente. In Sardegna l isolamento geografico e le condizioni economico-culturali favoriscono la formazione di differenti popolazioni geneticamente omogenee, discendenti ciascuna da un numero ristretto di fondatori. Nell isola sono infatti noti esempi di effetto fondatore per diverse malattie ereditarie (β-talassemia, morbo di Wilson, carenza di G6PD, ecc.) ed è stato dimostrato che le componenti genetiche di alcune malattie complesse hanno origine da un comune fondatore (come nel breast cancer). La malattia di Alzheimer (AD) è una patologia complessa neurodegenerativa. Attualmente tre geni, APP, PS1 e PS2, sono associati con AD ad insorgenza precoce ma è stato postulato un loro coinvolgimento anche con la forma ad insorgenza tardiva. Infatti, la malattia di Alzheimer ad insorgenza tardiva (LOAD), ha una patologia virtualmente identica ad AD causata da mutazioni in PS1-2 ed APP. Traendo vantaggio dalle nostre speciali popolazioni, abbiamo affrontato uno studio per verificare la presenza di un aplotipo comune in linkage disequilibrium con la malattia in un campione di 35 pazienti LOAD provenienti dal Nord-Sardegna. Abbiamo compiuto un analisi di associazione utilizzando marcatori polimorfici (microsatelliti) interni o fiancheggianti i 3 geni candidati.

2 La nostra analisi ha evidenziato un aplotipo comune in un sottogruppo di pazienti per i marcatori fiancheggianti il gene PS-1 (p value= 0.013); il sequenziamento della parte codificante del gene PS-1, nei pazienti con l aplotipo individuato, non ha però evidenziato alcuna variante funzionale. I nostri dati sono tuttavia coerenti con una possibile associazione tra il locus PS-1 e LOAD e quindi con un effetto fondatore, per questa, in Nord-Sardegna. Stiamo attualmente estendendo i nostri studi ad un campione più ampio di pazienti LOAD per replicare questi risultati preliminari ed indagare la presenza di una variante allelica del locus PS-1, potenzialmente coinvolta nella malattia di Alzheimer ad insorgenza tardiva.

3 INTRODUZIONE La malattia di Alzheimer: considerazioni generali ed epidemiologia La malattia di Alzheimer è una patologia complessa neurodegenerativa su base genetica che colpisce prevalentemente la popolazione anziana. Si manifesta come perdita di memoria, attenzione, orientamento temporo-spaziale-familiare, conseguente demenza ed eventuale morte. Fu descritta per la prima volta da Alois Alzheimer nel 1907 (Alzheimer A. 1907) e rappresenta il % di tutte le demenze. In Italia si stima la presenza di circa malati ed in Sardegna possiamo supporre che siano circa La malattia di Alzheimer non viene ereditata come tratto mendeliano ma è dovuta al contributo di diversi fattori sia genetici che ambientali, principalmente traumi e stress psicologici. Questi ultimi aumentano, quindi, la suscettibilità alla malattia in individui geneticamente predisposti. Nonostante numerose controversie, si suppone che la malattia di Alzheimer, spesso, sia preceduta da un disturbo depressivo e che comunque la presenza di questo sia correlata ad un significativo peggioramento delle facoltà cognitive, cui consegue una riduzione dell autonomia nella vita quotidiana. La totale perdita di capacità intellettiva può manifestarsi gradatamente e progredisce con un ritmo sempre più incalzante e devastante, dipendente dai casi. La malattia di Alzheimer può essere classificata clinicamente in base alla differente età di insorgenza in: a) precoce, solitamente familiare, rara (10% dei casi), trasmessa in maniera autosomica dominante con penetranza incompleta, che può comparire prima dei 40 anni; b) tardiva, per lo più sporadica, più frequente (90% dei casi), multifattoriale, che si manifesta dopo i 65 anni.

4 Sono state identificate diverse regioni cromosomiche e geni associati alla malattia. In particolare sono stati isolati tre geni: il gene APP (Proteina Precursore dell Amiloide) sul cromosoma 21 ed i due geni omologhi PS-1 (Presenilina 1) e PS-2 (Presenilina 2) sui cromosomi 14 e 1 rispettivamente. Mutazioni in ciascuno di questi tre geni sono responsabili di circa il 10% dei casi di malattia di Alzheimer ad insorgenza precoce. Per la malattia ad insorgenza tardiva sono stati identificati alcuni fattori predisponenti, tra cui il più studiato è l allele ε4 del gene ApoE situato sul cromosoma 19. Recentemente l allele 2 dell α-2-microglobulina situato sul cromosoma 12 è stato indicato come fattore predisponente alla malattia.

5 La malattia di Alzheimer: studio genetico di una patologia complessa Il nostro interesse si è focalizzato sulla malattia di Alzheimer sia per il suo forte impatto sociale, legato anche al continuo aumento dell età media della popolazione, sia per la convinzione del vantaggio dell analisi della popolazione sarda per l identificazione della componente genetica della malattia. La Sardegna è infatti considerata una terra ideale per studiare la componente ereditaria di malattie multifattoriali ed offre una maggiore probabilità di successo a chiunque voglia intraprenderne lo studio. Al suo interno vi sono aree che per deriva genetica, per elevato inincrocio (inbreeding) ed accentuata endogamia, presentano popolazioni con particolari caratteristiche di omogeneità genetica e discendenti da un numero ristretto di fondatori. Nell isola si osservano infatti numerosi esempi di effetto fondatore per malattie ereditarie (per es. talassemia, morbo di Wilson, carenza di G6PD, ecc ) per le quali si trovano una o poche cause molecolari prevalenti nella popolazione, in individui, quindi, discendenti da un unico founder. L Istituto di Genetica Molecolare si occupa dello studio dei fattori genetici coinvolti nelle malattie multifattoriali mediante la creazione di ampi database ( anche con acquisizione dei dati ambientali ed epidemiologici, inclusa la dieta e lo stile di vita), di banche di DNA e la costruzione di grandi alberi genealogici. Vengono studiati isolati genetici della Sardegna, dove è garantita l omogeneità nel tempo sia delle popolazioni che del contesto in cui queste vivono ed è quindi facilitata l individuazione dei fattori genetici associati a fenotipi patologici complessi.

6 Nello studio delle malattie multifattoriali viene applicato un approccio per linkage disequilibrium, che consiste nella identificazione negli affetti di regioni cromosomiche ancestrali (aplotipi) definite da marcatori genetici che si trovano in vicinanza del locus/gene predisponente al fenotipo patologico. Si presuppone che tali aplotipi siano conservati (dopo essere stati introdotti nella popolazione) per un certo numero di generazioni (anche se le ricombinazioni tendono a ridurne l estensione). Stiamo di fatto portando avanti due tipi di analisi sulla popolazione sarda: a) studio di gruppi di pazienti provenienti da tutta la Sardegna di cui però conosciamo la provenienza geografica dei loro più recenti avi; b) studio di piccoli villaggi di una regione particolarmente isolata della Sardegna (Ogliastra), che può essere considerata la terra dei Sardi antichi. In entrambi i casi utilizziamo lo stesso approccio metodologico. La popolazione sarda infatti non ha presentato, nel corso della sua storia, fenomeni di massiccia emigrazione fuori dall isola né di una immigrazione notevole dal continente. Non è quindi difficile poter collegare tra loro i malati, una volta che si conosca l origine dei nonni e dei bisnonni. È possibile così raggruppare i probandi per origine geografica ed estendere ulteriormente la genealogia, ricercando gli eventuali antenati comuni. Negli ultimi anni studi simili sono stati intrapresi in altre popolazioni isolate (Islanda, Saami), indicando questa come la migliore metodologia attualmente disponibile (Wright A. et al. 1999).

7 Istopatologia Da studi eseguiti su autopsie di malati di Alzheimer (Hutton et al. 1997) è emerso che le caratteristiche lesioni tessutali nelle aree del cervello che presiedono alla memoria e alla cognizione (corteccia cerebrale, ippocampo, ecc ), sono essenzialmente due: placche e grovigli ( plaques and tangles ). Le placche sono masse extracellulari di cui il principale componente è il peptide β-amiloide. Possono essere suddivise in due tipi, senili e diffuse, rispettivamente patologiche e non patologiche. Nelle placche senili un denso core centrale di β-amiloide è circondato da neuroni malati che possiedono dendriti ed assoni distrofici proiettati verso il core. Associati con essi vi sono microglia attivate che rilasciano citochine ed astrociti reattivi. Essendo le cellule di microglia simili a macrofagi e stimolando le citochine la proliferazione dei linfociti T, il quadro è simile ad una risposta infiammatoria in difesa dei neuroni ai quali queste cellule gliali sono associate con funzione di protezione. Le placche senili sono costituite da una forma più lunga del peptide β-amiloide, di 42 residui amminoacidici, che ha tendenza a formare fibrille citotossiche. Si può ipotizzare che nei fluidi interstiziali del cervello dei malati, il progressivo accumulo di questa forma del peptide β-amiloide causi la formazione di aggregati che inglobano neuroni (placche patologiche) stimolando come conseguenza una risposta infiammatoria, che in questo caso è dannosa e porta a morte la cellula nervosa.