Sviluppo microbico Procedure di valutazione dello sviluppo microbico. Esercitazione 1. Analisi sperimentali. Metodi diretti.

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1 Procedure di valutazione dello sviluppo microbico Analisi sperimentali Materiale Microrganismo: Saccharomyces cerevisiae Terreno colturale: 1 turno MEB Composizione (g/l) MEB: estratto malto 20, peptone di soia 1, glucosio 20, acqua di fonte, ph 5.8 Metodi diretti numero di cellule conta totale (conta diretta) al microscopio conta biologica in piastra massa cellulare peso secco Metodi indiretti turbidimetria (assorbanza 600 nm) Colture allestite in beute da 500 ml contenenti ciascuna 100 ml di terreno colturale

2 3 giorno 2 giorno 1 giorno Procedura allestimento colture preparazione materiale, inoculo di 1 beuta con coltura in solido (slant) di Saccharomyces cerevisiae incubazione in agitazione a C allestimento inoculo inoculo di ciascuna beuta con 10 ml della coltura di inoculo e determinazioni t 0 (conta totale, conta in piastra e OD) incubazione in agitazione a C preparazione campioni determinazione dello sviluppo microbico impiegando le diverse procedure (conta totale, conta in piastra, peso secco e OD)

3 Conta totale Campioni Prelievi della coltura di Saccharomyces cerevisiae opportunamente diluiti Conta totale Materiale Camera emocitometrica Sulla superficie della camera sono incise 2 copie del reticolo di conta posizione reticoli -1-2 camera di Bürker schema reticolo di conta

4 Conta totale Preparazione della camera di conta posizionare il coprioggetto con una pipetta si inserisce per capillarità il campione opportunamente diluito coprioggetto campione reticolo camera di conta Per la conta si utilizza un microscopio contrasto di fase (400 ingrandimenti)

5 Conta totale Contare le cellule che si presentano all interno e su 2 lati contigui del campo prescelto in funzione della densità/dimensione delle cellule cellule da contare cellule da non contare

6 Conta totale Effettuare la conta di 10 campi (A, B o C) scelti dall operatore per ciascuno dei 2 reticoli (totale 10 conte x 2 reticoli = 20 determinazioni) C B Calcolare il valore medio A Considerando le dimensioni del reticolo (in particolare per A, B o C) determinare la popolazione presente nel campione Dimensioni dei singoli riquadri del reticolo RIQUADRO LATO AREA VOLUME (mm) (mm 2 ) (spessore 1/10 mm) A 1/20 1/400 1/4.000 B 1/20 x 1/5 1/100 1/1.000 C 1/5 1/25 1/250

7 Conta totale Calcolo per la determinazione della popolazione presente nel campione Riq. A: n cellule (valore medio) x 4.000* x 1.000** x diluizione del campione Riq. B: n cellule (valore medio) x 1.000* x 1.000** x diluizione del campione Riq. C: n cellule (valore medio) x 250* x 1.000** x diluizione del campione * fattore in funzione del volume del reticolo in cui è stata effettuata la conta (A, B o C) ** fattore per il passaggio da mm 3 (in relazione alle dimensioni sei singoli riquadri) a cm 3 (ml) 1/250 di mm 3 C B 1/4.000 di mm 3 A 1/1.000 di mm 3

8 Conta biologica in piastra Conta biologica in piastra Materiale Provette conteneti 9 ml di soluzione fisiologica Terreno colturale: agar malto Piastre sterili Procedura allestimento diluizioni decimali in soluzione fisiologica inoculo in piastra delle singole diluizioni campione incubazione a C per 48 ore 1 ml Conta UCF (Unità Formanti Colonie)

9 Conta biologica in piastra Campione in piastra Introduzione terreno colturale Conta UCF Incubazione Fase di mescolamento

10 Peso secco Peso secco Materiale Provette da centrifuga Centrifuga Stufa Termobilancia Procedura Centrifugazione di un volume noto di brodocoltura Lavaggio delle cellule (1/2 volte) Essiccamento in stufa C fino a peso costante Peso del campione in termobilancia CAMPIONE filtrazione/centrifugazione essiccamento Peso delle cellule dopo essiccamento

11 Peso secco Campione e provette Centrifugazione/lavaggio Pesata Essiccamento in stufa

12 Turbidimetria Turbidimetria Materiale Spettrofotometro (600 nm) Procedura Diluizione del campione Determinazione assorbanza a 600 nm contro acqua

13 Esempio Dati relativi allo sviluppo microbico prelievi effettuati fino a 56 h di incubazione tempo Conta totale conta in piastra peso secco assorbanza* (ore) Cellule/mL (UCF/mL 10 8 ) (g/l) (600 nm) 0 0, ,03 4 2, ,13 8 3, , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,65 * campioni diluiti 1:10

14 10,0 8,0 cellule/ml 6,0 4,0 Conta totale 2,0 0, Tempo (ore) 7,0 conta biologica in piastra (UCF /ml) 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 Conta in piastra 0, tempo (ore)

15 3,0 2,5 peso secco (g/l) 2,0 1,5 1,0 Peso secco 0,5 0, tempo (ore) 0,7 0,6 Assorbanza (600 nm) 0,5 0,4 0,3 0,2 Assorbanza 0,1 0, tempo (ore)

16 ESEMPI DI RELAZIONE TRA LE DIVERSE PROCEDURE DI DETERMINAZIONE DELLO SVILUPPO MICROBICO 3,0 2,5 Peso secco (g/l) 2,0 1,5 1,0 7,0 0,5 0,0 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 Torbidità (A) 10,0 9,0 Conta in piastra (UCF /ml) 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 8,0 1,0 Conta totale (cellule/ml) 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 0,0 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 Torbidità (A) 2,0 1,0 0,0 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 Torbidità (A)

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