Analisi di proteine:

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1 Analisi di proteine: Elettroforesi e Western Blot Seminario Metodologico per il Corso di Didattica Libera Marilena Dinardo mariamaddalena.dinardo@uniba.it

2 Le proteine sono il prodotto dei geni: sono le proteine che servono a fabbricare un organismo, a farlo funzionare e, quando sono difettose, si rendono responsabili di malattie. Ed è proprio attraverso lo studio del funzionamento delle proteine che si potrebbe arrivare alla costruzione di nuovi farmaci.

3 Purificazione delle proteine: La purificazione di una proteina costituisce il primo passaggio nello studio delle sue proprietà. Una proteina, per poter essere purificata, deve dapprima essere estratta dalla sua matrice biologica e poi allontanata selettivamente dalle altre proteine.

4 La procedura adottata per ottenere un estratto grezzo (estratto contenente tutte le proteine cellulari solubili nel tampone di estrazione utilizzato) dipende dalla localizzazione cellulare della proteina di interesse.

5 Campioni proteici Estratti di tessuti o cellule Proteine ricombinanti etichettate con antigeni ( tags : HA, T7) Virus interi purificati Localizzazione cellulare (nucleo, membrana, citoplasma)

6 Estrazione delle proteine Lisi delle cellule con un tampone di lisi che dissocia le proteine e inibisce le proteasi cellulari Concentrazione dei sali Detergenti (Triton X-100, NP40, SDS) ph Inibitori di proteasi Bassa temperatura (ghiaccio) Proteasi Inibitori proteasi: Leupeptina, Pepstatina, Aprotinina, PMSF

7 Le procedure utilizzate per ottenere un estratto proteico grezzo sono estremamente semplici e richiedono: - la rottura delle cellule in uno specifico buffer; - la centrifugazione del campione per rimuovere i residui insolubili.

8 La rottura delle cellule può essere ottenuta mediante: Digestione enzimatica della parete o della membrana plasmatica mediante appropriate miscele di cellulasi, lipasi e proteasi (tripsina, collagenasi, ialuronidasi); Shock osmotico; Successivi cicli di congelamento/scongelamento; Generalmente devono però essere applicati metodi più energici, che sottopongono le cellule a stress meccanici. I metodi di rottura meccanici sono fondamentalmente di due tipi: mediante forze frizionali tra cellule e materiale solido; mediante forze frizionali in sospensione di cellule.

9 Gli omogeneizzatori sono costituiti da un tubo di vetro e da un pestello mosso a mano (Dounce o Tenbrock) o elettronicamente (Potter- Elvejham). Il tubo è mantenuto fisso mentre il pestello viene fatto ruotare per generare le forze frizionali, le quali sono più elevate alla superficie del pestello e minime lungo la parete del tubo. Lo spazio libero tra il pestello e la parete del tubo è mantenuta entro dimensioni precise in quanto l attrito sviluppato dipende dal raggio del pestello e del tubo di vetro e dalla velocità di rotazione del pestello stesso.

10 Elettroforesi

11 Analisi elettroforetica delle proteine del siero

12 Elettroforesi La velocità di una molecola carica che si muove in un campo elettrico è direttamente proporzionale alla forza del campo elettrico (E) e alla carica della molecola (q) ed è inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola e alla viscosità del mezzo in cui si muove (forze frizionali fo resistenza): v = Eq/f dove f=6πrη

13 Fattori che influenzano la velocità di migrazione CAMPIONE (Carica, Dimensioni, Forma) TAMPONE (Concentrazione, ph) SUPPORTO (Adsorbimento, Filtrazione molecolare)

14 SUPPORTI Non setaccianti (Carta), acetato di cellulosa Setaccianti Gel di poliacrilammide(pag) Gel di Agarosio

15 Elettroforesi su gel Metodo per separare le molecole (DNA, RNA, proteine, etc.) sulla base di proprieta fisiche o chimiche quali: (1) dimensioni (2) forma (3) carica elettrica

16 Elettroforesi di DNA I gel sono fatti di agarosio o di poliacrilammide I campioni di DNA vengono caricati ed e applicata una differenza di potenziale Il DNA, carico negativamente, migra verso l elettrodo + I frammenti di DNA piu piccoli migrano piu velocemente

17 Elettroforesi di Proteine Piu complessa dell elettroforesi di DNA Proteine diverse hanno cariche diverse Le proteine variano molto per forma Generalmente il gel e fatto di poliacrilammide

18 Perche usare Gel di Poliacrilammide per separare le proteine? I gel di poliacrilammide hanno una trama piu compatta I pori hanno dimensioni minori che nei gel di agarosio Le proteine sono molto piu piccole del DNA Amminoacido medio = 110 Da Paio di nucleotidi medio = 649 Da 1 kilobase di DNA = 650 kda 1 kilobase di DNA codifica 333 amminoacidi = 36 kda

19 Elettroforesi di proteine Condizioni Non Denaturanti Non-denaturante (nativo): nessun pre-trattamento delle proteine prima dell elettroforesi Le proteine conservano la loro forma normale (struttura 2 e 3 ; legami disolfuro covalenti) Le proteine conservano la loro carica normale Le proteine sono separate sulla base di carica, dimensioni e forma Nome Carica Massa Forma Proteina Q +3 30kD Proteina R 4 42kD

20 Elettroforesi di proteine Condizioni denaturanti Le proteine sono trattate con SDS (detergente anionico) prima dell elettroforesi (SDS-PAGE) Le molecole di SDS si legano alle proteine Le proteine perdono la loro normale forma Le proteine hanno tutte lo stesso rapporto carica/massa Le proteine vengono separate esclusivamente sulla base delle loro dimensioni Carica Massa +3 30kD SDS Carica Massa kD 4 42kD kD

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22 SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) CH 3 SDS (Sodio Dodecil Solfato) Solubilizza e denatura le proteine Aggiunge cariche negative alle proteine CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 O O S O - O SDS

23 Proteina Nativa Carica netta: -4 Proteina trattata con SDS Carica netta: Molto (-)

24 Sistemi per la corsa di SDS-PAGE Amersham Biosciences Bio-Rad Piccolo (8 x 10 cm) Medio (16 x 16 cm)

25 SDS-PAGE acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1% Colorazione con Blu di Coomassie

26 Come funziona un Gel SDS-PAGE? Le proteine cariche negativamente si muovono verso l elettrodo positivo s-s SDS, calore Proteine con SDS Proteine piu piccole si muovono piu velocemente Le proteine si separano per dimensione +

27 Cosa c e nel buffer di caricamento? Un tampone (Tris) per fornire il giusto ph (6,8) SDS (Sodio Dodecil Solfato) per solubilizzare le proteine e fornire loro una carica negativa complessiva Glicerolo per rendere pesanti i campioni e farli scendere nei pozzetti Un agente riducente (DTT o b-mercaptoetanolo) per rompere i legami disolfuro Un colorante (Blu di Bromofenolo) per visualizzare i campioni

28 Il Gel E costituito da due parti: Stacking gel: 4-5% gel superiore, ph 6.8 Running gel: 8-14% gel separatore, ph 8.8 Le molecole di acrilammide sono tenute assieme dalla bis-acrilammide, formando una struttura a lattice Polimerizzazione piu rapida aggiungendo catalizzatori: TEMED e APS

29 Il Gel Componenti del gel SDS-PAGE Soluzione di Acrilammide/Bis-Acrilammide Tris-HCl ph 6.8 oppure Tris-HCl ph 8.8 SDS ddh2o TEMED APS (ammonio persolfato) Buffer di corsa (Tris, Glicina, SDS)

30 Come funziona: Proteine vengono caricate, viene applicata una corrente elettrica Includere un marker di peso molecolare colorato 10-50ug di estratto proteico totale 0.1-1ug di proteina purificata Ioni Cloruro (-) / Proteina / Glicina (+) Si muovono verso il gel separatore ( resolving ) Differenze di ph causano la ionizzazione della glicina, permettendo alle proteine di migrare nel gel separatore Stacking ph 6,8 Resolving ph 8,8 Il Gel +

31 Il Gel % di acrilammide consigliata Dimensioni delle proteine 8% 10% 12% kda kda kda

32 Visualizzazione delle proteine nel gel I due metodi piu usati sono: Colorazione con il Coomassie Brilliant Colorazione con l argento Silver staining (puo essere visualizzato ~1ng di proteina per banda) Coomassie staining Silver staining

33 Dimensioni in kda Stima dei pesi molecolari kd mm Distanza (mm dal pozzetto)

34 Stima dei pesi molecolari

35 Western Blotting

36 Southern Blot: Per l analisi del DNA. (sonda = DNA o RNA). Northern Blot: Per l analisi dell RNA. (sonda = DNA o RNA). Western Blot: Per l analisi delle proteine. (sonda = anticorpo).

37 Buffer-soaked filter papers Western Blotting Nitrocellulose membrane - + Gel Buffer Electrode SDS-PAGE Direction of transfer Assemble sandwich Wet blotting Graphite Electrode Plates - + Semi-dry blotting Nitrocellulose with bound proteins Stained (Red Ponceau)

38 Cosa e un Western Blot? Una tecnica in cui le proteine sono separate mediante elettroforesi su gel e successivamente trasferite su un supporto (membrana o filtro). Successivamente una specifica proteina viene identificata mediante la sua reazione specifica con un anticorpo.

39 A cosa serve il Western Blot? Qual e la proteina che mi interessa? SDS-PAGE (non certo) Si basa sul confronto di peso molecolare Western blot (certo) Si basa su una reazione specifica antigene-anticorpo? +

40 Fasi di un Western Blot Prima fase: elettroforesi su gel. (Le proteine del campione vengono separate su un gel in base alle loro dimensioni) Seconda fase: trasferimento su membrana. (Le proteine nel gel sono poi trasferite su una membrana di nitrocellulosa mediante un campo elettrico) Terza fase: saturazione o blocking. (La saturazione e usata per prevenire le interazioni non specifiche tra l anticorpo e la membrana)

41 Fasi di un Western Blot Quarta fase: legame dell anticorpo primario. (L anticorpo riconosce la proteina specifica immobilizzata sulla membrana) Quinta fase: legame dell anticorpo secondario. (L anticorpo secondario, coniugato a un enzima (AP o HRP), riconosce specificamente l anticorpo primario, gia legato alla proteina sulla membrana) Sesta fase: rivelazione o detection. (L enzima coniugato all anticorpo secondario scinde un substrato che, in corrispondenza della proteina specifica, sviluppa precipitato colorato o chemioluminescenza)

42 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento Le proteine nel gel sono ancora in soluzione Le bande diffondono e si confondono col tempo E necessaria l immobilizzazione per: Preservare in maniera permanente l esperimento di elettroforesi Permettere il riconoscimento di proteine specifiche La strategia piu comune e il trasferimento su membrana Nitrocellulosa PVDF (Polivinilidene fluoride) Nylon

43 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento membrana

44 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento Elettroblotting Apparato di trasferimento Il gel e messo tra strati di carta da filtro con la membrana a diretto contatto col gel sul lato verso l elettrodo positivo Viene applicato un campo elettrico e le proteine migrano fuori dal gel verso l elettrodo positivo e si legano alla membrana Fatto a 4 C per evitare surriscaldamento, decomposizione del tampone e degradazione delle proteine

45 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento Trasferimento dal catodo (-) all anodo (+) 1) Spugnette 2) 3 fogli di carta da filtro imbevuti di tampone di trasferimento 3) Gel 4) Membrana 5) 3 fogli di carta da filtro imbevuti di tampone di trasferimento 6) Spugnette

46 Apparato per il trasferimento Semi-dry

47 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento Componenti del tampone di trasferimento: 25mM Tris 190mM glicina 20% metanolo

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49 Western blot: terza fase saturazione o blocking Per saturare i siti idrofobici liberi sulla membrana Per prevenire il legame dell anticorpo primario alla membrana stessa Latte scremato o Albumina di Siero Bovino (BSA)

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51 Western blot: quarta fase incubazione con anticorpo primario

52 Western blot: quarta fase incubazione con anticorpo primario L anticorpo primario riconosce la proteina di interesse e non lega le altre proteine immobilizzate sulla membrana Anticorpi come sonde: Molto sensibili Possono essere prodotti Immunizzando una specie diversa (anticorpi policlonali) Generando anticorpi monoclonali (mab) Economici

53 Anticorpi Ab + Ag Kd AbAg Kd = [Ab] = 10-9 M [AbAg]

54 Anticorpi Anticorpo primario Riconosce la proteina Anticorpo secondario Lega l anticorpo primario Generalmente prodotto in una specie diversa Coniugato con un enzima Il substrato dell enzima sara convertito in un prodotto colorato Puo anche essere radioattivo o fluorescente

55 Anticorpi (immunoglobuline, Ig) Una proteina a forma di Y secreta nel sangue in risposta ad uno specifico antigene, come un batterio o un virus, che neutralizza l antigene legandosi specificamente ed esso e producendo una risposta immunitaria. Anticorpi

56 Anticorpi policlonali Produzione Immunizzazione ripetuta dell animale con l antigene (peptide, proteina purificata o ricombinante) Il sangue e prelevato nel momento di picco di produzione dell anticorpo ed e purificato il siero Il pool degli anticorpi riconosce molti epitopi dell antigene usato per l immunizzazione

57 Anticorpi monoclonali Riconoscono solo un epitopo

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59 Western blot: quinta fase Incubazione con anticorpo secondario

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61 Western blot: sesta fase rivelazione o detection Fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi del rafano (HRP: horseradish peroxidase) Conversione di un substrato colorimetrico in un precipitato colorato Substrati Chemioluminescenti Emettono luce se convertiti dall enzima Possono essere visualizzati su lastre radiografiche Marcatura radioattiva Anticorpi secondari biotinilati

62 Western blot substrato HRP HRP luce Anticorpo primario Anticorpo secondario Rivelazione Il substrato metabolizzato dalla perossidasi (HRP) emette luce pg proteina

63 A cosa serve il Western Blot? Quanta proteina di interesse c e? Proteina di interesse Bande non specifiche Densita' media (intensita') [Proteina], pg Pg di Proteina