a) Titolo: Analisi di genomica mediante tecniche microarray dei tumori stromali gastrointestinali (GIST) e relative implicazioni cliniche.

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1 Proponente: Dott.ssa Maria A Pantaleo a) Titolo: Analisi di genomica mediante tecniche microarray dei tumori stromali gastrointestinali (GIST) e relative implicazioni cliniche. b) Breve presentazione dell oggetto di studio: Il presente studio è mirato all analisi genomica globale dei tumori stromali gastrointestinali (GIST), ovvero analisi del profilo di espressione genica, analisi cromosomica ed analisi dello stato mutazionale del recettore c-kit e PDGFRα la cui alterazione è alla base del processo patogentico della malattia. Lo studio prevede la selezione di circa 20 pazienti affetti da GIST afferenti al Dipartimento di Ematologia ed Oncologia Medica Seragnoli. Dopo consenso informato secondo le procedure previste dal Comitato Etico locale, l analisi genomica sarà condotta su un campione patologico fresco congelato. L analisi molecolare non richiede un prelievo di materiale ad hoc, ma verrà condotta sul materiale biologico ottenuto dalle seguenti fonti: - pezzo operatorio in caso di pazienti sottoposti ad intervento chirurgico - prelievo bioptico eseguito ad intento diagnostico in caso di malattia non operabile - prelievo bioptico eseguito in caso di necessaria nuova caratterizzazione istologica della malattia Su ciascun campione verrà condotta un analisi molecolare globale che comprende: - studio del profilo di espressione genica mediante microarray ad oligonucleotidi HU133A prodotto da Affymetrix (Santa Clara, CA). - studio di genotyping mediante Genome-Wide Human SNP Array 6.0 prodotto da Affymetrix (Santa Clara, CA) - analisi mutazionale dello stato di ckit e di PDGFR α mediante Real-time PCR o tecnologia TaqMan (Genotyping Assays ready kits). Segue l analisi dei dati al fine di caratterizzare i GIST sul piano molecolare ed infine la correlazione con le caratteristiche clinico-patologiche ed eventualmente con la resistenza alla terapia medica. c) Status questionis: I tumori stromali gastrointestinali (GIST) sono tumori rari ma rappresentano la più comune forma tumorale mesenchimale del tratto gastroenterico. Dal punto di vista molecolare circa il 90% dei GIST è caratterizzato da una mutazione specifica a carico di c-kit, un proto-oncogene localizzato sul cromosoma 4q-12 che codifica per la proteina di membrana KIT, un recettore tirosin-kinasico per lo stem cell factor (SCF). Tali mutazioni di tipo gain of function sono responsabili di un attivazione costitutiva del recettore, che sembra rivestire un ruolo cardine nel processo di sviluppo di questi tumori (1).

2 La mutazione di più frequente riscontro, in circa il 65% di tutti i GIST, è quella a carico dell esone 11, che codifica per il dominio juxtamembrana intracellulare del recettore. Altre mutazioni sono quelle a carico degli esoni 9, 13 e 17, che codificano rispettivamente per il dominio juxtamembrana extracellulare, per il dominio tirosinchinasico e per il dominio della fosfotransferasi e che sono presenti in circa il 10% dei GIST (2). Tuttavia una piccola percentuale (5-7%) di GIST non esprime la mutazione a carico di c-kit, bensì del recettore α del fattore di crescita di derivazione piastrinica (PDGFRα), una tirosin-chinasi strutturalmente omologa a c- KIT ed implicata negli stessi circuiti di segnalazione intracellulari (3,4). Le mutazioni del PDGFRα sono mutuamente esclusive rispetto alle mutazioni di KIT e coinvolgono nell 80% dei casi l esone 18 e nei restanti casi l esone 12 (10-15%) o l esone 14 (1-5%). Infine circa il 10-15% dei GIST, definiti wild-type, non presenta alcuna mutazione sia a carico di c-kit che di PDGFRα, suggerendo la probabile esistenza di meccanismi patogenetici molecolari alternativi (5). Attualmente lo standard terapeutico per i pazienti affetti da GIST in stadio avanzato è rappresentato da Imatinib, un inibitore tirosin-kinasico di KIT e PDGFRα, in grado di indurre una risposta parziale o una stabilità di malattia dal 75% al 90% dei casi (6). Lo stato mutazionale di c-kit e PDGRFα sembra essere predittivo della risposta clinica all imatinib: infatti pazienti portatori di una mutazione a carico dell esone 11 mostrano un tasso di risposta del 83.5%, rispetto al 48% osservato nei pazienti con mutazioni a carico dell esone 9, mentre i pazienti con mutazione puntiforme D842V a livello dell esone 8 di PDGRFα risultano resistenti all imatinib (3,4,7,8). I GIST wild-type risultano essere maggiormente resistenti all imatinib, con una percentuale di risposta o di stabilità di malattia variabile a seconda degli studi considerati. Tuttavia, nonostante la buona risposta iniziale al trattamento, la maggior parte dei pazienti va incontro a progressione di malattia, per l acquisizione di mutazioni aggiuntive che inducono una resistenza secondaria al farmaco (9-12). Sunitinib, un inibitore tirosin-kinasico multitarget di VEGFR, PDGFR, KIT e FLT3, si è dimostrato essere in grado di indurre un tempo alla progressione significativamente maggiore rispetto al placebo e rappresenta attualmente lo standard di trattamento di seconda linea dopo sviluppo di resistenza o intolleranza all imatinib (13). Sono disponibili anche risultati riguardanti la correlazione tra la resistenza al sunitinib e lo stato mutazionale del sito di legame del farmaco alla tasca intracellulare dell ATP (14). A fronte di una ricchezza di dati disponibili in letteratura riguardo allo stato mutazionale di c-kit e PDGFRα e correlazione con la sensibilità o resistenza all imatinib, vi sono diversi pazienti che non rispondono alla terapia subito o nel tempo. Studi di genomica più ampi e innovativi condotti sui GIST, quali il profilo di espressione genica e il genotyping, sono necessari in quanto le conoscenze sul background molecolare di questi tumori sono ancora parziali, in particolar modo delle forme wild-type, al fine di rispondere a numerosi quesiti circa i meccanismi patogenetici, le vie di segnalazione intracellulari alternative e alla resistenza farmacologia che rimangono tuttora aperti e irrisolti.

3 d) Originalità e rilevanza del progetto in ambito locale ed in ambito internazionale: Lo studio globale di genomica dei GIST, mediante la valutazione dello stato mutazionale di c-kit e PDGFRα assieme al profilo di espressione genica ed all analisi cromosomica, potrebbe completare le conoscenze attuali sulla biologia di questi tumori, in particolar modo delle forme wild-type che rimangono un campo di ricerca ancora non esplorato. I risultati potrebbero consentire di superare molti aspetti prognostici e predittivi di terapia ancora non risolti in questa patologia. I risultati che si otterrebbero da questo studio monocentrico potrebbero poi essere allargati ad altri gruppi di ricerca nazionale che si occupano di GIST nonché permetterebbero un confronto con gruppi di ricerca internazionali in cui la tecnologia array come Affymetrix è già piu utilizzata ma non ancora in questa patologia. Inoltre, la tecnologia di genomica array, di cui si avvererebbe il progetto, presenta moltissimi potenziali e rappresenta in campo nazionale una tecnologia ancora da scoprire, pertanto potrebbe offrire molte possibilità nel campo della ricerca sul cancro con applicazioni anche in altre patologie neoplastiche. e) Descrizione delle tecniche e delle metodologie utilizzate: Il tipo di tessuto umano in studio è un campione patologico fresco. L analisi molecolare non richiede un prelievo di materiale ad hoc, ma verrà condotta sul materiale biologico ottenuto dalle seguenti fonti: - pezzo operatorio in caso di pazienti sottoposti ad intervento chirurgico - prelievo bioptico eseguito ad intento diagnostico in caso di malattia non operabile - prelievo bioptico eseguito in caso di necessaria nuova caratterizzazione istologica della malattia Su ciascun campione verrà condotta un analisi molecolare globale che comprende: - studio del profilo di espressione genica mediante microarray ad oligonucleotidi HU133A prodotto da Affymetrix (Santa Clara, CA). - studio di genotyping mediante Genome-Wide Human SNP Array 6.0 prodotto da Affymetrix (Santa Clara, CA) - analisi mutazionale dello stato di c-kit e di PDGFR α mediante Real-time PCR o tecnologia TaqMan (Genotyping Assays ready kits). f) Obiettivi, risultati attesi e modalità di monitoraggio: Obiettivi: - Studio globale di genomica dei GIST, mediante il profilo di espressione genica e genotyping.

4 - Correlazione dei dati ottenuti con lo stato mutazionale di c-kit and PDGFRα, con i parametri clinico-patologici ed eventualmente con la resistenza alla terapia medica. Indicatori di risultato: gli indicatori di risultato saranno dapprima i dati grezzi che si otterranno mediante l analisi del DNA e RNA estratto dal campione congelato, e poi i dati fini che si otterranno dopo l analisi con software di Affymetrix Risultati attesi a metà progetto: identificazione dei campioni biologici, estrazione di DNA ed RNA, inizio di analisi di Affymetrix per l ottenimento dei dati grezzi Risultati attesi al termine del progetto: - caratterizzazione genomica dei GIST mediante il profilo di espressione genica, mediante analisi cromosomica e dello stato mutazionale di c-kit e PDGFRalfa - correlazione dei suddetti parametri biologici tra loro, con le caratteristiche clinico-patologiche e risultati della terapia medica Tecniche di analisi dei dati: la quantificazione e normalizzazione dei dati provenienti da ciascun probe set di Affymetrix è effettuata in ambiente R, grazie al pacchetto affy di Bioconductor ( L algoritmo scelto e gcrma, che ha mostrato, rispetto a mas5 e rma, il miglior compromesso fra un ottimale normalizzazione dei campioni (controllata tramite boxplot e MA-plot) e l identificazione di un set di geni differenziali. All interno di bioconductor verranno anche svolte le normali procedure di controllo qualità dei dati, fra cui il calcolo della degradazione dei campioni, l identificazione di eventuali aree di fluorescenza disomogenea e l identificazione dei campioni caratterizzati da un errore standard normalizzato troppo elevato. I probe set vengono quindi filtrati per eliminare i geni poco espressi o poco variabili, tramite un filtro sul livello di espressione e sul range interquantile (pacchetto genefilter di Bioconductor). La lista di geni filtrati viene poi utilizzata per effettuare un analisi delle componenti principali, una tecnica nonsupervisionata che permette di ridurre la variabilità di un dataset a coordinate in uno spazio multidimensionale, in cui gli assi rappresentano le componenti principali della varianza del set di dati iniziale. La selezione dei geni differenzialmente espressi è effettuata tramite un t-test modificato implementato nel pacchetto limma di Bioconductor: la statistica t viene modificata dal calcolo degli errori standard sull intorno di geni che mostrano un livello di espressione simile al gene in esame, con l effetto di rendere l analisi stabile e di migliorare il calcolo del false discovery rate anche in esperimenti con un basso numero di array. I geni differenzialmente espressi vengono visualizzati mediante un clustering gerarchico ( con metodo di linkage completo e metrica di similarità costituita dalla distanza di Manhattan. L analisi supervisionata di class prediction viene effettuata a utilizzando l algoritmo del nearest shrunken centroid implementato nel pacchetto PAM (Prediction Analysis of Microarrays,

5 g) Indicazione degli aspetti innovativi della ricerca: - mancanza di dati di analisi di genomica globale dei GIST allo stato delle conoscenze attuali - correlazione del background molecolare con aspetti clinici - ampliamento delle conoscenze sulla biologia di questi tumori rari, in particolar modo delle forme wild-type e possibile trasferimento di dati molecolari ad altre neoplasie - impiego di tecnologia di microarray Affymentrix h) Fattibilità: - il progetto sarà inserito all interno di studio piu ampio di analisi genomica per cui si è già ottenuta l approvazione del Comitato Etico della Azienda Ospedaliero Universitaria Sant Orsola-Malpighi (n 113/2008/U/Tess) - il Dipartimento di Ematologia e Scienze Oncologiche Seragnoli presso cui opero come ricercatore è un riferimento per il trattamento dei GIST, per cui sarà possibile la selezione dei pazienti e l ottenimento del campione biologico necessario su cui effettuare l analisi genomica - il centro di Centro Interdipartimentale di Ricerche sul Cancro G. Prodi dell Università di Bologna presso cui il progetto di ricerca sarà svolto ha in dotazione la strumentazione tecnologica necessaria Affymetrix, nonché il personale con competenze specifiche per lo svolgimento e realizzazione del progetto di ricerca stesso. i) Eventuali ricadute applicative: - i risultati del presente progetto potrebbero portare alla identificazione di gruppi di pazienti con caratteristiche prognostiche e predittive di risposta alle terapie su base molecolare - è possibile l identificazione di nuove molecole che sono alla base del meccanismo patogenetico e del mantenimento della neoplasia nonché di conseguenza nuovi bersagli molecolari terapeutici - il presente progetto potrà ampliare le conoscenze attuali della genomica dei tumori solidi in quanto i GIST rappresentano un modello sul piano molecolare. I risultati che si otterranno da questo studio potrebbero essere poi trasferiti in altre neoplasie e potrebbe quindi aprire la strada ad una migliore e piu approfondita caratterizzazione molecolare in oncologia l) Continuità e replicabilità: - il presente progetto potrebbe prima di tutto essere allargato ad un campione piu ampio anche coinvolgendo altri gruppi di ricerca in campo nazionale ed internazionale - è possibile ipotizzare un trasferimento sepcifico dei dati di genomica ottenuti nei GIST in altri tumori solidi

6 - studio del profilo di espressione genica e di genotyping anche in altre neoplasie con la medesima tecnologia Affymetrix m) Bibliografia: 1. Hirota S., Isozkki K., Moriyama Y., et al. Gain of function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science 279: , Corless CL, Fletcher JA, Heinrich MC. Biology of gastrointestinal stromal tumors. J Clin Oncol 2004;22: Heinrich MC, Corless CL, Duensing A, et al. PDGFRA activating mutations in gastrointestinal stromal tumors. Science 2003;299: Corless CL, Schroeder A, Griffith D, et al. PDGFRA mutations in gastrointestinal stromal tumors frequency, spectrum and in vitro sensitivity to imatinib. J Clin Oncol 2005;23: Medeiros F, Corless CL, Duensing A, et al. KIT-negative gastrointestinal stromal tumors. Am J Surg Pathol 2004;28: Demetri GD, von Mehern M, Blanke CD, et al. Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors. N Engl J Med 2002;347: Heinrich MC, Corless cl, Demetri GD, et al. Kinase mutations and Imatinib response in patients with metastatic gastrointestinal stromal tumors. J Clin Oncol 2003; 21: Debiec-Rychter M, Dumez H, Judson I, et al. Use of c-kit PDGFRA mutational analysis to predict the clinical response to imatinib in patients with advanced gastrointestinal stromal tumours entered on phase I and II studies of the EORTC Soft Tissue and Bone Sarcoma Group. Eur J Cancer 2004;40: Heinrich MC, Corless CL, Blanke CD, et al. Molecular correlates of imatinib resistance in gastrointestinal stromal tumors. J Clin Oncol 2006;24: Diebec-Rychter M, Cools J, Dumez H, et al. Mechanism of resistance to imatinib mesylate in gastrointestinal stromal tumors and activity of the PKC412 inhibitor against imatinib-resistant mutants. Gastroenterology 2005;128: Wakai T, Kanda T, Hirota S, et al. Late resistance to imatinib therapy in a metastatic gastrointestinal stromal tumor is associated with a second KIT mutation. Br J Cancer 2004; 90: Ale Maleddu A, Pantaleo MA, Nannini M, Di Battista M, Saponara M, Lolli C, Biasco G.Mechanisms of secondary resistance to tyrosine kinase inhibitors in gastrointestinal stromal tumours (Review). Oncol Rep Jun;21(6): Demetri GD, van Oosterom AT, Garrett CR, et al. Efficacy and safety of sunitinib in patients with advanced gastrointestinal stromal tumour after failure of imatinib a randomised controlled trial. Lancet 2006;368:

7 14. Heinrich Heinrich MC, Maki RG, Corless CL, Antonescu CR, Harlow A, Griffith D, Town A, McKinley A, Ou WB, Fletcher JA, Fletcher CD, Huang X, Cohen DP, Baum CM, Demetri GD. Primary and secondary kinase genotypes correlate with the biological and clinical activity of sunitinib in imatinibresistant gastrointestinal stromal tumor. J Clin Oncol 2008; 26(33):5352-9