6. Terapia genica Terapia genica ex vivo ed in vivo

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1 6. Terapia genica 6.1. Terapia genica ex vivo ed in vivo 6.2. Oligonucleotidi (Triple helix-forming Oligonucleotides- TFO, Transcription factor decoy, antisenso/ribozimi, sirna/mirna, aptameri) 6.3. Produzione di animali transgenici Applicazioni della transgenesi animale in campo farmaceutico (animali transgenici produttori di biofarmaci, donatori di tessuti ed organi nello xenotrapianto, modelli di malattie umane nella ricerca biomedica).

2 Manipolazione genetica degli animali Severino Antinori Lo specialista italiano per la fertilità Severino Antinori parla ad una conferenza sul clonaggio umano a Roma il 9 Marzo Le autorità italiane avvisano che Antinori rischia di perdere il permesso a praticare in Italia a causa dei suoi piani sulla possibile clonazione dell uomo.

3 Transgenesi animale ANIMALE TRANSGENICO animale che presenta un patrimonio genetico manipolato mediante: 1. Inserzione di geni esogeni 2. Sostituzione di geni endogeni con geni omologhi di origine umana (knock-in) 3. Delezione di uno specifico gene (knock-out) Primi esperimenti con la finalità di inserire DNA estraneo nel genoma animale all inizio degli anni 80.

4 studi di funzione genica produzione di proteine ricombinanti APPLICAZIONI DELLA TRANSGENESI ANIMALE modelli animali per le malattie sviluppo della terapia genica

5 Produzione di animali transgenici (I) BIOTECNOLOGIE TRADIZIONALI Drosophila e topi da decenni si sono dimostrati gli animali più adatti per le analisi genetiche che venivano effettuate: per incrocio sottoponendo gli animali a potenti mutageni chimici e radioattivi BIOTECNOLOGIE ATTUALI L introduzione di una sequenza di DNA esogeno in una cellula vivente è definita transgenesi Le tecniche attuali offrono la possibilità di scegliere il gene bersaglio da modificare gene targeting Il gene targeting si attua mediane tecnologie di mutagenesi mirata

6 Produzione di animali transgenici (II) Per produrre animali geneticamente modificati è necessario alterare il DNA delle cellule germinali così che questo venga ereditato. CELLULE BERSAGLIO: Oocita fecondato (=cellula per eccellenza totipotente) Cellule embrionali staminali (ES) costituiscono l embrione ai primissimi stati con ancora non completa separazione tra cellule somatiche e germinali. L animale transgenico è in grado di trasmettere stabilmente il DNA estraneo nella sua linea germinale. I transgeni possono integrarsi in porzioni di cromosomi in cui nessun gene endogeno viene modificato o si può avere alterazione dell espressione genica (mutagenesi inserzionale). La mutagenesi mirata effettuata su cellule ES rispetto alle somatiche consente di avere un animale in cui tutte le cellule nucleate hanno la mutazione nel locus desiderato.

7 Produzione di animali transgenici (III) Gli animali transgenici possono essere: Completamente transgenici, se il transgene è presente in tutte le cellule dell organismo Mosaici, se il trasferimento genico avviene in uno stadio più avanzato e solo alcune cellule contengono il transgene Presenza o assenza del transgene in diverse popolazioni cellulari verificata con: PCR Southern blot Northern blot Gli animali di laboratorio più utilizzati per questo tipo di studio sono i topi

8 TECNICHE per la produzione di animali transgenici Microinezione del DNA nel pronucleo Trasferimento in embrioni pre- e postimpianto Trasferimento di nuclei geneticamente modificati in oociti denucleati

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10 Microinezione del DNA nel pronucleo maschile (I) A

11 Microinezione del DNA nel pronucleo maschile (II) Per ottenere topi transgenici con questo metodo: 1. Alle femmine viene indotta una superovulazione, le si fa accoppiare con maschi fertili e le si sopprime il giorno dopo 2. Gli oociti fecondati vengono raccolti dagli ovidotti 3. Con una micropipetta si inietta il DNA d interesse nel pronucleo maschile dei singoli oociti; 4. Gli oociti che sopravvivono vengono reimpiantati in ovidotti di altre femmine e lasciati sviluppare fino al termine della gravidanza. Il transgene si integra a caso nel DNA cromosomico (quasi sempre come evento unico) Nel sito d integrazione possono trovarsi concatameri contenenti fino a 50 copie di transgene che vengono trasmesse alla progenie secondo le regole mendeliane (il 50% della progenie avrà il transgene)

12 Microinezione del DNA nel pronucleo maschile (III) Vantaggi: Tecnologia altamente precisa e molto efficace DNA esogeno iniettato direttamente (senza vettore) Uso di YAC per inserimento di grandi complessi multigenici e/o sequenze di regolazione Svantaggi: Tecnicamente difficile Costi elevati Non adatta alla produzione su larga scala di animali transgenici Non adatta a manipolazioni genetiche complicate Integrazione random

13 Efficienza del processo di transgenesi per microiniezione minore del 5%

14 Uso di vettori lentivirali per trasferire un transgene in un embrione VANTAGGI Maggiore efficienza di trasferimento Molto utilizzato per generare polli transgenici SVANTAGGI Ridotta capacità di packaging Integrazione random

15 Trasferimento di embrioni pre- o post -impianto B Le cellule embrionali in stadi molto precoci sono totipotenti e forniscono al DNA estraneo un modo per inserirsi nella linea germinale. Il DNA può essere trasferito: A. In cellule non selezionate di embrioni molto precoci Solitamente questo tipo di trasferimento si effettua utilizzando vettori retrovirali e può essere effettuato sugli embrioni prima dell impianto o in fasi precoci post impianto. Il trasferimento genico che si ottiene non coinvolge tutti i tipi cellulari dando luogo ad animali mosaico. Questo metodo è stato utilizzato per studiare il destino di linee cellulari nel corso dello sviluppo, mediante geni indicatori. B. In linee cellulari derivanti da cellule staminali embrionali (ES)

16 Trasferimento in Cellule Staminali Embrionali (ES) Le blastocisti degli embrioni di mammifero sono costituiti da uno strato trofoectodermico esterno, da una massa cellulare interna (ICM) dalla quale si originano i tessuti propri del feto, dalle membrane fetali (amnio, allantoide, sacco del tuorlo) e dall endoderma extraembrionico. La massa cellulare interna puo essere espiantata giorni dopo l accoppiamento e coltivata in vitro. Le Cellule Embrionali Staminali sono "linee cellulari" che si ottengono dalla crescita della massa cellulare interna (ICM) in LIF. Quando vengono coltivate in presenza di LIF (Leukemia Inhibitory Factor), le ES possono essere iniettate all interno del blastocele di blastocisti accettrici, dove vengono integrate con l ICM. Se questa blastocisti viene successivamente trapiantata nell utero di una madre adottiva, gli embrioni si sviluppano normalmente e le cellule staminali contribuiscono alla formazione dei tessuti. In questo modo otteniamo topi transgenici.

17 Trasferimento di DNA in cellule ES (I)

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20 Press Release (8 October 2007) The Nobel Assembly at Karolinska Institutet has today decided to award The Nobel Prize in Physiology or Medicine for 2007 jointly to Mario R. Capecchi, Martin J. Evans and Oliver Smithies for their discoveries of "principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells Mario R. Capecchi, born 1937 in Italy, US citizen, PhD in Biophysics 1967, Harvard University, Cambridge, MA, USA. Howard Hughes Medical Institute Investigator and Distinguished Professor of Human Genetics and Biology at the University of Utah, Salt Lake City, UT, USA. Sir Martin J. Evans, born 1941 in Great Britain, British citizen, PhD in Anatomy and Embryology 1969, University College, London, UK. Director of the School of Biosciences and Professor of Mammalian Genetics, Cardiff University, UK. Oliver Smithies, born 1925 in Great Britain, US citizen, PhD in Biochemistry 1951, Oxford University, UK. Excellence Professor of Pathology and Laboratory Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill, NC, USA.

21 .."principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells Summary This year's Nobel Laureates have made a series of ground-breaking discoveries concerning embryonic stem cells and DNA recombination in mammals. Their discoveries led to the creation of an immensely powerful technology referred to as gene targeting in mice. It is now being applied to virtually all areas of biomedicine from basic research to the development of new therapies. Gene targeting is often used to inactivate single genes. Such gene "knockout" experiments have elucidated the roles of numerous genes in embryonic development, adult physiology, aging and disease. To date, more than ten thousand mouse genes (approximately half of the genes in the mammalian genome) have been knocked out. Ongoing international efforts will make "knockout mice" for all genes available within the near future. With gene targeting it is now possible to produce almost any type of DNA modification in the mouse genome, allowing scientists to establish the roles of individual genes in health and disease. Gene targeting has already produced more than five hundred different mouse models of human disorders, including cardiovascular and neuro-degenerative diseases, diabetes and cancer. Outline Modification of genes by homologous recombination Embryonic stem cells vehicles to the mouse germ line Two ideas come together homologous recombination in ES cells Birth of the knockout mouse the beginning of a new era in genetics Gene targeting is used to study health and disease

22 Applicazioni degli animali transgenici derivanti da ES modificate (I) Studio dell espressione genica e sua regolazione: I transgeni costituiti da presunte sequenze di regolazione associate ad un gene indicatore come LacZ, forniscono un metodo sensibile e potente per individuare l espressione genica e studiarne la regolazione. Studio dell espressione genica mediante inattivazione genica mirata: Geni specifici possono essere inattivati mediante mutagenesi mirata, introducendo un transgene nel locus del gene da inattivare (inattivazione da inserzione) ottenendo così indicazioni sul gene d interesse Studi sugli effetti di dose e sull espressione ectopica: Informazioni ottenute sovraesprimendo un transgene o mediante la sua espressione ectopica (transgene associato ad un promotore tessuto specifico che ne causa l espressione solo in alcuni tipi cellulari). Ablazione di una linea cellulare: Si possono progettare transgeni costituiti da un unico promotore tessuto-specifico associati ad una sequenza che codifica per una tossina. Quando il promotore viene attivato ad un determinato punto dello sviluppo embrionale, la cellula viene uccisa. Studio dell acquisizione funzionale: Qualsiasi gene che produca un effetto dominante negativo o acquisizione di funzione può essere studiato mediante l introduzione di un determinato transgene. Produzione di modelli per malattie umane: L inattivazione da inserzione è spesso utilizzata per costruire modelli di mutazioni da perdita di funzione mentre i modelli per mutazioni con acquisizione di funzione si producono inserendo un transgene mutante PRODUZIONE DI BIOFARMACI

23 Fonti di Cellule Staminali (I) CELLULE STAMINALI EMBRIONALI: cellule il cui destino non è ancora "deciso : possono originare vari tipi di cellule diverse, attraverso un processo denominato "differenziamento utili nella cura di alcune malattie Tuttavia, per poterle ricavare, gli embrioni non devono avere più di 5-7 giorni.

24 Fonti alternative di Cellule Staminali (II) ADULT STEM CELLS Il midollo osseo degli adulti: Le cellule staminali del midollo osseo degli adulti producono normalmente cellule ematopietiche e cellule del midollo osseo. Fino a poco tempo fa, gli scienziati pensavano che fosse impossibile che le cellule del midollo osseo potessero "tornare indietro nel tempo", potendo quindi reinventarsi per dare origine a tipi di cellule completamente differenti come quelle cerebrali, nervose, intestinali o epiteliali. Tuttavia, alcuni medici statunitensi hanno identificato, di recente, una cellula staminale proveniente dal midollo osseo di un adulto, che credono possa svilupparsi in un altro tipo di cellula. Sangue placentare: Normalmente eliminato durante il parto, proveniente dal cordone ombelicale. Le imprese si offrono già da ora per raccogliere il sangue della placenta e conservarlo, a pagamento, nell'eventualità in cui il bambino si ammali. Cellule staminali così raccolte potranno essere utilizzate per curare problemi sanguigni, come la leucemia e alcuni disturbi genetici e immunitari, come le lesioni vascolari o cerebrali, diabete, morbo di Parkinson e la distrofia muscolare.

25 Trasferimento di nuclei geneticamente modificati in oociti denucleati PRINCIPIO: la manipolazione genetica utilizza una tecnologia di TRASFERIMENTO NUCLEARE un nucleo viene tolto dalla cellula somatica donatrice e trapiantato in un oocita in cui è stato preventivamente eliminato il nucleo. L oocita così ottenuto può dare luogo ad un individuo con l intero genoma del donatore. C Gli esperimenti che hanno portato a generare per la prima volta un individuo adulto clonato sono stati effettuati da Wilmut et al. nel Questi hanno clonato una pecora: la pecora Dolly

26 Trasferimento di nuclei geneticamente modificati in oociti denucleati

27 Dolly e gli altri: le tappe della clonazione animale : un decennio di rane. Sono i primi esseri viventi su cui si sperimenta la clonazione mediante trasferimento nucleare. Nel 1952 Robert Briggs e Thomas King, due ricercatori inglesi, trapiantano il nucleo di una cellula prelevata da un embrione di rana nella cellula u ovo di un adulto; dieci hanno dopo John Gurdon esegue lo stesso procedimento prelevando però la cellula donatrice del nucleo dell'intestino di un girino. 1984: entrano in scena le pecore. Accade a Cambridge. Dapprima Steen Willadsen ottiene cinque pecore identiche da un unico embrione attraverso la tecnica "embryo splitting" (l'embrione che si spacca): si opera una divisione dell'embrione ad uno stadio precoce in due o più parti, da ognuna delle quali si origina un nuovo embrione geneticamente identico al progenitore e agli altri fratelli. Nello stesso anno e nello ste sso luogo si ottiene la prima pecora clonata per trasferimento nucleare, ma il nucleo trapiantato nella cellula uovo è preso da una cellula embrionale (non adulta). 1988: tori alla riscossa. Ne vengono prodotti ben sette, mediante embryo splitting, a Houston (Texas): si utilizzano i nuclei di più cellule, prese però dal medesimo embrione. 1995: Megan e Morag. Un anno prima del grande evento, la clonazione di due agnellini passa praticamente sotto silenzio. Il materiale genetico proviene però da feti, non da individui adulti. 1996: l'anno di Dolly. Nasce a Edimburgo la prima pecora ottenuta dal trasferimento del nucleo di una cellula somatica (adulta e differenziata) prelevata dalla mammella di una pecora di sei anni, nella cellula uovo proveniente da un altro individuo. La novità consiste nel clonare un individuo adulto. Dolly ha partorito due volte: nel 1998 (Bonnie) e nel : Polly. Sempre a Edimburgo viene clonata la prima pecora transgenica. 2000: cloni di seconda generazione. In Giappone si clona un toro, lui stesso clone di un altro individuo. 2000: Tetra. Nasce la prima scimmia clonata; è stata utilizzata la tecnica dell'embryo splitting. 2001: Copycat. Doveva essere la gatta "fotocopia" della madre e invece non sembra nemmeno sua figlia, diversa oltre che nel colore del pel o anche in molti aspetti comportamentali. Detiene il primato come primo animale domestico clonato. 2001: Ombretta. Pasqualino Loi e Grazyna Ptak, mentre lavorano ad un progetto di salvaguardia in Sardegna, centrano un record mondiale riuscendo a clonare per la prima volta un animale selvatico: il muflone. 2001: e i maiali? In Australia si ottiene per la prima volta il clone di un suino utilizzando una cellula epiteliale conservata per due anni in frigorifero. Nel mondo, altri tre maiali sono già stati clonati in precedenza. 2003: cloni GM. In Nuova Zelanda si clonano nove mucche a partire da un "genitore" geneticamente modificato allo scopo di produrre latte pi ù ricco di caseina per ottenere formaggi in tempi record: la clonazione permette di mantenere la modifica genetica anche nei cloni.

28 Problemi degli animali clonati PREMESSA: La clonazione è una strategia altamente inefficiente Caso Dolly: su 434 oociti 29 si sono potuti trasferire in pecora e solo 1 è giunto a formare un nuovo individuo. Invecchiamento precoce (Dolly è sopravvissuta 6 anni, la sua amica Matilda solo 3) Frequenti malformazioni cardiache, renali, polmonari Altissimo tasso di mortalità prenatale (circa 98%) Varie anomalie organiche che non sono riscontrabili in fase pre-natale o alla nascita Numerosi problemi bioetici

29 Animali transgenici per la produzione di biofarmaci (I) Gene farming (allevamento di geni) Pharming (da pharmacological e farming)

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31 Biofarmaci disponibili o in progress, ottenuti per transgenesi animale

32 Animali transgenici per la produzione di biofarmaci (II) OBIETTIVO Produzione di animali transgenici per ottenere l espressione di farmaci limitata ad alcuni sistemi biologici: Ghiandola mammaria (secrezione nel latte) Altri fluidi biologici: plasma, liquido seminale, urine, albume dell uovo Primi esempi: Maiali che esprimevano l ormone umano della crescita (Hammer et al. 1985) Espressione elevata di proteine eterologhe nel latte da ghiandole mammarie di suini transgenici (Wall et al. 1991) Espressione elevata di alfa1 anti-tripsina umana nel latte di pecore transgeniche (Wright et al. 1991) RESA complessivamente volte più elevata di quella ottenibile dalle colture di cellule ricombinanti dipendente anche dalla produzione annua di latte delle varie specie (mucca l; pecora 500 l; capra 400 l; maiale 250 l)

33 Animali transgenici per la produzione di biofarmaci (III) GENERAZIONE DI ANIMALI TRANSGENICI COME BIOREATTORI Miroinjection Gene targeting Nuclear cloning ESPRESSIONE DEI TRANSGENI Promotore tessuto-specifico Elementi di regolazione distali EVENTI POST-TRADUZIONALI Maturazione delle proteine (pattern di glicosilazione) Stabilità dell espressione del transgene (soppressione rara negli animali) Purificazione delle proteine ricombinanti Effetti collaterali delle proteine ricombinanti sugli animali

34 Animali transgenici per la produzione di biofarmaci (IV)

35 Espressione di transgeni: hgh, β- lattoglobulina, tpa umano, CFTR, proteine regolatrici Sistemi modello di mlattie umane piccola taglia dell animale TOPI TRANSGENICI BOVINI TRANSGENICI Candidato ideale per l utilizzo della ghiandola mammaria come bioreattore (10000 l latte/anno Prodotti transgenici: lattoferrina (commercializzata in UK), lattoalbumina, sieroalbumina, collagene La transgenesi non altera carne e latte negli animali clonati Protocollo di microiniezione di DNA esogeno ancora inefficace Produzione di emoglobina (Hb) umana negli eritrociti, poi secreta nel plasma. Promotore prima umano poi di suino (+) Hb trasfusa direttamente (persistenza breve in circolo, ore, giorni). Maggiore stabilità. Già in produzione negli USA. SUINI TRANSGENICI OVINI TRANSGENICI Produzione di α1-antitripsina umana nel latte di pecora (microiniezione del costrutto in oociti fecondati) Produzione di tpa umano nel latte di capra Nessun effetto negativo sull animale transgenico e sulla sua prole

36 Produzione della proteina CFTR nel latte di topo CFTR correttamente glicosilata CFTR purificata dalla frazione grassa del latte

37 Protocollo di microiniezione del DNA esogeno nei bovini > 2000 oociti prelevati da mucche uccise nei mattatoi 2 vitelli transgenici

38 History and likely future of animal pharming Solo un prodotto approvato: recombinant human antithrombin III (ATryn), by GIC Biotherapeutics Animali ingegnerizzati per replicare la risposta immunitaria umorale umana Agosto 2006-Europa; Febbraio 2009-USA Before this decision, pessimists believed regulatory authorities would always find a way to shoot down transgenic proteins, But now that we have an approval, that argument goes away.

39 Polyclonal antibodies: Mimano fortemente la risposta naturale Efficaci nell attivare il complemento e nel reclutare neutrofili e macrofagi To date: Creazione di animali transcromosomici, usando un cromosoma artificiale umano contenente i loci delle catene IgG leggere e pesanti trasmissione del cromosoma artificiale alla linea germinale da dimostrare Targeting e inattivazione del locus IgG endogeno (Kuroiwa et al. 2004)

40 Animali transgenici donatori di tessuti ed organi nello xenotrapianto European Donor Hospital Education Programme (per incentivare un aumento delle donazioni) Sviluppo di organi artificiali (emodialisi, organi meccanici cardiaci, fegato artificiale) Uso di cellule staminali per creare tessuti o organi da trapiantare Xenotrapianto = trapianto, impianto o infusione nell uomo di organi, tessuti o cellule vivi di provenienza animale

41 Candidato ideale come donatore per lo xenotrapianto: il maiale

42 Potenziali rischi associati allo xenotrapianto Rigetto iperacuto dell organo Attivazione del complemento in seguito a legame di Ab umani ad un epitopo zuccherino (gal-α-gal) espresso dal suino SOLUZIONI: eliminazione temporanea di Ab xenoreativi; soppressione dell enzima α-1,3-galattosiltransferasi (suini knock-out o knock-in); Produzione di suini transgenici esprimenti proteine regolatrici del complemento (hdaf, protectina, MCP) Trasmissione di agenti infettivi dal donatore al ricevente (xenosi) PERV = Porcine endogenous retroviruses Dati preliminari su 160 pazienti esposte a cellule di suino non hanno evidenziato infezioni da PERV Inizio trials clinici nell uomo Sopravvivenza di 90 o più giorni di un organo di maiale, trapiantato in un primate non umano (attualmente: da poche settimane a 3 mesi non di routine)

43 Meccanismo alla base del rigetto iperacuto di organi di suino suino uomo

44 Animali transgenici come modelli di malattie umane nella ricerca biomedica (I)

45 Animali transgenici come modelli di malattie umane nella ricerca biomedica (II) Permettono un esame dettagliato delle basi fisiologiche della malattia Offrono un sistema preventivo di valutazione per studiare l efficacia di nuove terapie sull uomo I primati: Costituiscono il miglior modello animale per le malattie umane (parenti più prossimi). I primati sono tuttavia costosi da allevare. Inoltre, hanno vita molto lunga e sono poco fecondi. Diversi problemi legati all etica delle sperimentazioni. Il pesce Danio rerio: Pesce in studio per sperimentazioni genetiche solo dal Screening molto rapido in quanto questo pesce è completamente trasparente. Esistono diversi mutanti naturali e indotti. Largamente utilizzato per lo studio delle patologie cardiache e delle patologie dello sviluppo o per malattie che coinvolgono proteine o percorsi molto conservati (es. biosintesi dell eme.)

46 Animali transgenici come modelli di malattie umane nella ricerca biomedica (III) I ratti: Più grandi dei topi; sono risultati più adatti per studi fisiologici, farmacologici, del comportamento e per l analisi di patologie cardiovascolari e neuropsichiatriche. Hanno tempi di generazione relativamente lunghi (11 settimane) e l allevamento delle colonie è più costoso di quello dei topi. Si sta concludendo una fitta mappa di marcatori genetici I topi Modelli maggiormente utilizzati per le malattie umane. Animali di dimensioni ridotte, allevabili con costi contenuti. Hanno vita breve (2-3 anni),gravidanze brevi (3mesi) e sono molto prolifici. E pertanto possibile progettare programmi di riproduzione per ottenere ceppi incrociati ricombinanti e seguire la trasmissione di una mutazione nel tempo. Esistono mutanti originati spontaneamente nelle colonie di allevamento e mutanti indotti mediante mutagenesi con raggi X o sostanze mutagene e mutagenesi mirata. Mappati numerosissimi marcatori polimorfici e le regioni conservate uomo-topo sono state ben studiate.

47 Animali transgenici come modelli di malattie umane nella ricerca biomedica (IV) Molti fenotipi patologici derivano dalla perdita di una funzione genica. Per preparare il modello di una malattia di questo tipo (se causata da un unico gene) si produce un topo knockout: Isolare il gene murino ortologo Utilizzarne un segmento per inattivare il gene endogeno in cellule ES Sviluppo dei topi fondatori Incroci tra i topi fondatori Ricerca della mutazione nei topi-progenie con saggi di PCR. Scopo: Creare un allele nullo in cui ci sia completa assenza d espressione.

48 Animali transgenici come modelli di malattie umane nella ricerca biomedica (V) MODELLI TRANSGENICI PER LO STUDIO DELL ONCOGENESI Oncomouse: topo transgenico con integrato l oncogene umano c-myc (1988) Topi transgenici per l oncogene ras e per l oncogene neu Topi knockin per l oncogene k-ras e p53 MODELLI TRANSGENICI PER LO STUDIO DELLE MALATTIE NEURODEGENERATIVE Alzheimer (modelli knockin del β-amiloide) Parkinson (α-sinucleina umana) MODELLI TRANSGENICI PER LO STUDIO DELL ATEROSCLEROSI Knockin per CEPT (Cholesterol Ester Transfer Protein) MODELLI KNOCK-OUT PER LO STUDIO DELLE PATOLOGIE GENETICHE RECESSIVE Knockout HPRT per la sindrome di Lesch-Nyan Knockout glucocerebrosidasi per la malattia di Gaucher Knockout CFTR per la fibrosi cistica

49 Distruzione mirata di un gene per ricombinazione omologa

50 Approfondimenti Testi di riferimento Calabrò M.L. Compendio di Biotecnologie farmaceutiche (EdiSES) Cap. 14 Riferimenti Bibliografici A. Kind & A. Schnieke Animal pharming, two decades on. Transgenic Res 17: , D.J. Wells Genetically modified animals and pharmacological research. Handbook of Experimental Pharmacology L. M. Houdebine Transgenic animal bioreactors. Transgenic Research 9: , 2000.