,, Ministero dell' Istruzione, dell' Università e della Ricerca

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1 ,, Ministero dell' Istruzione, dell' Università e della Ricerca Dipartimento per l'università, l'alta Formazione Artistica, Musicale e Coreutica e per la Ricerca Direzione Generale per il Coordinamento e lo Sviluppo della Ricerca PROGRAMMI DI RICERCA SCIENTIFICA DI RILEVANTE INTERESSE NAZIONALE RICHIESTA DI COFINANZIAMENTO (D.M. 1152/ric del 27/12/211) PROGETTO DI UNA UNITÀ DI RICERCA - MODELLO B Anno prot. 21X3Y2Y2_3 1 - Area Scientifico-disciplinare 2 - Coordinatore Scientifico SIMONELLI FRANCESCA Professore Straordinario Seconda Università degli Studi di NAPOLI Facoltà di MEDICINA e CHIRURGIA Dipartimento di OFTALMOLOGIA 3 - Responsabile dell'unità di Ricerca BANFI (Cognome) Ricercatore non confermato (Qualifica) SANDRO (Nome) 3/6/1964 (Data di nascita) BNFSDR64H3F839D (Codice fiscale) Seconda Università degli Studi di NAPOLI (Università/Ente) Dipartimento di PATOLOGIA GENERALE (Dipartimento) (telefono) (fax) banfi@tigem.it ( ) 4 - Curriculum scientifico POSIZIONE ATTUALE Ricercatore Universitario Facolta' di Medicina e Chirurgia Seconda Universita' degli Studi di Napoli Ricercatore ( Associate Investigator ) Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Napoli, Italia Docente della Scuola Superiore Europea di Medicina Molecolare (SEMM) Coordinatore al TIGEM del Programma di Dottorato Internazionale in Genetica Umana in convenzione con la Universita' britannica Open University ESPERIENZE PROFESSIONALI Attività prelaurea Internato prelaurea in Neurologia presso l'istituto di Neurologia, II Facolta' di Medicina, Universita' di Napoli, Italia; Supervisore: Dr. A. Filla Formazione postlaurea in Neurologia presso l'istituto di Neurologia, II Facolta' di Medicina, Universita' di Napoli, Italia; Supervisore: Dr. A. Filla. 2/91-8/91 Formazione postlaurea presso l'istituto di Genetica Molecolare, II Facolta' di Medicina, Universita' di Napoli, Italia; Supervisore: Dr. S. Cocozza. Attività postlaurea

2 9/91-4/92 Postdoctoral fellow presso il Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, Houston, Texas; Supervisore: Dr. H.Y. Zoghbi. 5/ Research Associate presso il Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, Houston, Texas; Supervisore: Dr. H.Y. Zoghbi Ricercatore presso il Telethon Institute for Genetics and Medicine (T.I.GE.M.) Dal 24 Docente della Scuola Superiore Europea di Medicina Molecolare (SEMM) Dal 25 Coordinatore del Programma di Dottorato di Ricerca Internazionale in Genetica umana in convenzione con la universita' britannica Open University Dal 211 Ricercatore Universitario, Genetica Medica, Seconda Universita' degli Studi di Napoli. PUBBLICAZIONI Autore of 84 pubblicazioni su riviste internazionali "peer-reviewed". Queste pubblicazioni hanno ricevuto una media di citazioni ciascuna e raggiungono un Impact factor totale di 78. H-Index = 31 ATTIVITA' DI REVISIONE Academic editor per la rivista PLoS ONE Revisore per le seguenti riviste: Genomics, Journal of Medical Genetics, Clinical Genetics, European Journal of Human Genetics, Genesis, Genome Research, Gene, Human Genetics, Human Molecular Genetics, Trends in Biochemical Sciences, Investigative Ophthalmology & Visual Science (IOVS), British Journal of Ophthalmology, BMC Genomics, BMC Molecular Biology, BMC Developmental Biology, Molecular Vision, PLoS ONE, PLoS Genetics. Revisore per le seguenti agenzie di finanziamento: Israel Science Foundation, EMBO, The Wellcome Trust, French National Research Program on Vision, Fight for Sight-British Eye Research Foundation, MRC, Swiss National Science Foundation). PREMI INTERNAZIONALI, RICONOSCIMENTI, AFFILIAZIONI A SOCIETA' SCIENTIFICHE International prizes Board of Director Awards from FFB (Foundation Fighting Blindness). Academy memberships 1. American Society of Human Genetics (ASHG) 2. Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) 3. European Society of Human Genetics (ESHG) 4. Societa' Italiana di Genetica Umana (SIGU) 5. Bioinformatic Italian Society (BITS) CURRENT POSITION Assistant Professor in Medical Genetics, Department of General Pathology, Second University of Naples (SUN), Naples, Italy Associate Investigator, Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Naples, Italy. Lecturer, European School of Molecular Medicine (SEMM), Naples, Italy Coordinator of the joint TIGEM-Open University PhD Program in Human Genetics, Naples, Italy RESEARCH AND PROFESSIONAL EXPERIENCE Predoctoral Fellow in Neurology at the Institute of Neurology, School of Medicine, Federico II University, Naples, Italy Supervisor: Dr. A. Filla Postdoctoral Fellow in Neurology at the Institute of Neurology, School of Medicine, Federico II University, Naples, Italy; Supervisor: Dr. A. Filla. 2/91-8/91 Postdoctoral Fellow at the Institute for Molecular Genetics, School of Medicine, Federico II University, Naples, Italy; Supervisor: Dr. S. Cocozza. 9/91-4/92 Postdoctoral Fellow at the Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, Houston, TX; Supervisor: Dr. H.Y. Zoghbi. 5/92-12/94 Research Associate at the Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, Houston, TX; Supervisor: Dr. H.Y. Zoghbi /2 Researcher, Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Milan, Italy; 1/2-Present Associate Investigator, Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Naples, Italy. 24-Present Lecturer, European School of Molecular Medicine (SEMM), Naples, Italy. 25-Present Coordinator of the joint TIGEM-Open University PhD Program in Human Genetics, Naples, Italy. 211-Present Assistant Professor in Medical Genetics, Department of General Pathology, Second University of Naples (SUN), Naples, Italy. PUBLICATIONS Authors of 84 publications in International peer-reviewed journals. These manuscripts have an average citation of and reach a total Impact factor of 78. H-Index = 31 REVIEWER ACTIVITIES Academic editor for PLoS ONE Reviewers for the following journals: Genomics, Journal of Medical Genetics, Clinical Genetics, European Journal of Human Genetics, Genesis, Genome Research, Gene, Human Genetics, Human Molecular Genetics, Trends in Biochemical Sciences, Investigative Ophthalmology & Visual Science (IOVS), British Journal of Ophthalmology, BMC Genomics, BMC Molecular Biology, BMC Developmental Biology, Molecular Vision, PLoS ONE, PLoS Genetics. Reviewer for the follwoing funding agencies: Israel Science Foundation, EMBO, The Wellcome Trust, French National Research Program on Vision, Fight for Sight-British Eye Research Foundation, MRC, Swiss National Science Foundation. INTERNATIONAL PRIZES, AWARDS, ACADEMY MEMBERSHIP International prizes Board of Director Awards from FFB (Foundation Fighting Blindness). Academy memberships 1. American Society of Human Genetics (ASHG) 2. Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) 3. European Society of Human Genetics (ESHG) 4. Societa' Italiana di Genetica Umana (SIGU) 5. Bioinformatic Italian Society (BITS)

3 5 - Pubblicazioni scientifiche più significative del Responsabile dell'unità di Ricerca 1. Meola N, Pizzo M, Alfano G, Surace EM, BANFI S. (212). The long non-coding RNA Vax2os1 controls the cell cycle progression of photoreceptor progenitors in the mouse retina. RNA, vol. 18; p , ISSN: Alfano G, Conte I, Caramico T, Avellino R, Arno B, Pizzo MT, Tanimoto N, Beck SC, Huber G, Dollé P, Seeliger M, BANFI S. (211). Vax2 regulates retinoic acid distribution and cone opsin expression in the vertebrate eye. DEVELOPMENT, vol. 138; p , ISSN: Diez Roux G, BANFI S., Sultan M, Geffers L, Anand S, Rozado D, Magen A, Canidio E, Pagani M, Peluso I, Lin-Marq N, Koch M, Bilio M, Cantiello I, Verde R, De Masi C, Bianchi SA, Cicchini J, Perroud E, Mehmeti S, Dagand E, Schrinner S, Nürnberger A, Schmidt K, Metz K, Zwingmann C, Brieske N, Springer C, Martinez-Hernandez A, Herzog S, Grabbe F, Sieverding C, Fischer B, Schrader K, Bürsing M, Schubert S, Helbig C, Alunni V, Battaini MA, Mura C, Henrichsen CN, Garcia-Lopez R, Echevarria D, Puelles E, Garcia-Calero E, Kruse S, Uhr M, Kauck C, Feng G, Milyaev N, Ong CK, Kumar L, Lam MS, Semple CA, Gyenesei A, Mundlos S, Radelof U, Lehrach H, Sarmientos P, Reymond A, Davidson, DR, Dollé P, Antonarakis SE, Yaspo ML, Martinez M, Baldock RA, Eichele G, Ballabio A (211). A high-resolution anatomical atlas of the transcriptome in the mouse embryo. PLOS BIOLOGY, vol. 9; p. e1582-, ISSN: Karali M, Manfredi A, Puppo A, Marrocco E, Gargiulo A, Allocca M, Della Corte M, Rossi S, Giunti M, Bacci ML, Simonelli F, Surace EM, BANFI S., Auricchio A (211). microrna-restricted Transgene Expression in the Retina. PLOS ONE, vol. 6; p. e22166-, ISSN: Testa F, Surace EM, Rossi S, Marrocco E, Gargiulo A, Di Iorio V, Ziviello C, Nesti A, Fecarotta S, Bacci ML, Giunti M, della Corte M, BANFI S., Auricchio A, Simonelli F (211). Evaluation of Italian Patients with Leber Congenital Amaurosis due to AIPL1 Mutations Highlights the Potential Applicability of Gene Therapy. INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE, vol. 52; p , ISSN: Vozzi D, Aaspõllu A, Athanasakis E, Berto A, Fabretto A, Licastro D, Külm M, Testa F, Trevisi P, Vahter M, Ziviello C, Martini A, Simonelli F, BANFI S., Gasparini P (211). Molecular Epidemiology of Usher Syndrome in Italy. MOLECULAR VISION, vol. 17; p , ISSN: Bandah-Rozenfeld D, Collin RW, Banin E, Ingeborgh van den Born L, Coene KL, Siemiatkowska AM, Zelinger L, Khan MI, Lefeber DJ, Erdinest I, Testa F, Simonelli F, Voesenek K, Blokland EA, Strom TM, Klaver CC, Qamar R, BANFI S., Cremers FP, Sharon D, den Hollander AI (21). Mutations in IMPG2, encoding interphotoreceptor matrix proteoglycan 2, cause autosomal-recessive retinitis pigmentosa. AMERICAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS, vol. 87; p , ISSN: Conte I, Carrella S, Avellino R, Karali M, Marco-Ferreres R, Bovolenta P, BANFI S. (21). mir-24 is required for lens and retinal development via Meis2 targeting. PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA; p , ISSN: De Cegli, R Romito A, Iacobacci S, Mao L, Lauria, M Fedele AO, Klose J, Borel C, Descombes P, Antonarakis SE, di Bernardo D, BANFI S., Ballabio A, Cobellis G (21). A mouse embryonic stem cell bank for inducible overexpression of human chromosome 21 genes. GENOME BIOLOGY, vol. 11; p. R64-, ISSN: X 1. Grillo G, Turi A, Licciulli F, MignoneF, Liuni S, BANFI S., Gennarino VA, Horner DS, Pavesi G, Picardi E, Pesole G (21). UTRdb and UTRsite (release 21): a collection of sequences and regulatory motifs of the untranslated regions of eukaryotic mrnas. NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 38; p. D75-D8, ISSN: Karali M, Peluso I, Gennarino VA, Bilio M, Verde R, Lago G, Dollé P, BANFI S. (21). mirneye: a microrna expression atlas of the mouse eye. BMC GENOMICS, vol. 11; p. 715-, ISSN: Simonelli F, Maguire AM, Testa F, Pierce EA, Mingozzi F, Bennicelli JL, Rossi F, Marshall K, BANFI S., Surace EM, Sun J, Redmond TM, Zhu X, ShindlerKS, Ying G, Ziviello C, Acerra C, Wright JF, McDonnell JW, High KA, Bennett J, Auricchio A (21). Gene therapy for Leber's congenital amaurosis is safe and effective through 1.5 years after vector administration. MOLECULAR THERAPY, vol. 18; p , ISSN: Gennarino VA, Sardiello M, Avellino R, Meola N, Maselli V, Anand S, Cutillo L, Ballabio A, BANFI S. (29). MicroRNA target prediction by expression analysis of host genes. GENOME RESEARCH, vol. 19; p , ISSN: Maguire AM, High KA, Auricchio A, Wright, F, Pierce EA, Testa F, Mingozzi F, Bennicelli J, Ying G, Rossi S, Fulton A, Marshall KA, BANFI S., Chung D, Morgan JIW, Hauck B, Zelanaia O, Zhu X, Raffini L, Coppieters F, De Baere E, Shindler KS, Volpe NJ, Surace EM, Acerra C, Lyubarsky A, Redmond TM, Stone E, Sun J, McDonnell JW, Leroy BP, Simonelli F, Bennett J (29). Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber's congenital amaurosis: a phase 1 dose-escalation trial. LANCET, vol. 374; p , ISSN: Meola N, Gennarino VA, BANFI S. (29). micrornas and genetic diseases. PATHOGENETICS, vol. 2; p. 7-, ISSN: Sardiello M, Palmieri M, di Ronza A, Medina DL, Valenza M, Gennarino VA, Di Malta C, Donaudy F, Embrione V, Polishchuk RS, BANFI S., Parenti G, Cattaneo E and Ballabio A (29). A gene network regulating lysosomal biogenesis and function. SCIENCE, vol. 325; p , ISSN: den Hollander A, McGee TL, Ziviello C, BANFI S., Dryja TP, Gonzalez-Fernandez F, Ghosh D, Berson E (29). A homozygous missense mutation in the IRBP gene (RBP3) associated with autosomal recessive retinitis pigmentosa. INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE, vol. 5; p , ISSN: Maguire AM, Simonelli F, Pierce EA, Pugh EN Jr, Mingozzi F, Bennicelli J, BANFI S., Marshall KA, Testa F, Surace EM, Rossi S, Lyubarsky A, Arruda VA, Konkle B, Stone E, Sun J, Jacobs J, Dell'Osso L, Hertle R, Ma J, Redmond TM, Zhu-X, Hauck B, Zelenaia O, Shindler KS, Maguire MG, Fraser Wright J, Volpe NJ, Wellman McDonnell J, Auricchio A, High KA, Bennett J (28). Vision in a Safety Study of Gene Transfer for Leber Congenital Amaurosis. NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE, vol. 358; p , ISSN: Maselli V, di Bernardo D, BANFI S. (28). CoGemiR: A Comparative Genomics microrna database. BMC GENOMICS, vol. 99; p. 457-, ISSN: Trifunovic D, Karali M, Campogampiero D, Ponzin D, BANFI S., Marigo V (28). A high-resolution RNA expression atlas of Retinitis Pigmentosa genes in the human and mouse retinas. INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE, vol. 49; p , ISSN: Cremers FP, Kimberling WJ, Kulm M, de Brouwer A, van Wijk E, Te Brinke H, Cremers CW, Hoefsloot LH, BANFI S., Simonelli F, Fleischhauer JC, Berger W, Kelley PM, Haralambous E, Bitner-Glindzicz M, Webster AR, Saihan Z, Debaere E, Leroy BP, Silvestri G, McKay G, Koenekoop RK, Millan JM, Rosenberg T, Joensuu T, Sankila EM, Weil D, Weston MD, Wissinger B, Kremer H (27). Development of a genotyping Microarray for usher syndrome. JOURNAL OF MEDICAL GENETICS, vol. 44; p , ISSN: Karali M, Peluso I, Marigo V, BANFI S. (27). Identification and characterization of micrornas expressed in the mouse eye. INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE, vol. 48; p , ISSN: Simonelli F, Ziviello C, Testa F, Rossi S, Fazzi E, Bianchi PE, Fossarello M, Signorini S, Bertone C, Galantuomo S, Brancati F, Valente EM, Ciccodicola A, Rinaldi E, Auricchio A, BANFI S. (27). Clinical and molecular genetics of Leber's congenital amaurosis (LCA): a multicenter study of Italian patients. INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE, vol. 48; p , ISSN: Antonini D, Rossi B, Han R, Minichiello A, Di Palma T, Corrado M, BANFI S., Zannini M, Brissette JL, Missero C (26). An Autoregulatory Loop Directs the Tissue-Specific Expression of p63 through a Long-Range Evolutionarily Conserved Enhancer. MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, vol. 26; p , ISSN: Alfano G, Vitiello C, Caccioppoli C, Caramico T, Carola A, Szego MJ, McInnes RR, Auricchio A, BANFI S. (25). Natural antisense transcripts associated with genes involved in eye development. HUMAN MOLECULAR GENETICS, vol. 14; p , ISSN: Boccia A, Petrillo M, di Bernardo D, Guffanti A, Mignone F, Confalonieri S, Luzi L, Pesole G, Paolella G, Ballabio A, BANFI S. (25). DG-CST (Disease Gene Conserved Sequence Tags), a database of human-mouse conserved elements associated to disease genes. NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 33; p. D55-D51, ISSN: Vitiello C, D'Adamo P, Gentile F, Vingolo EM, Gasparini P, BANFI S. (25). A novel GJA1 mutation causes oculodentodigital dysplasia without syndactyly. AMERICAN JOURNAL OF MEDICAL GENETICS. PART A, vol. 133; p. 58-6, ISSN: Ziviello C, Simonelli F, Testa F, Anastasi M, Marzoli SB, Falsini B, Ghiglione D, Macaluso C, Manitto MP, Garre C, Ciccodicola A, Rinaldi E, BANFI S. (25). Molecular genetics of autosomal dominant retinitis pigmentosa (ADRP): a comprehensive study of 43 Italian families. JOURNAL OF MEDICAL GENETICS, vol. 42; p. e47-, ISSN: Conte I, Lestingi M, den Hollander A, Alfano G, Ziviello C, Pugliese M, Circolo D, Caccioppoli C, Ciccodicola A, BANFI S. (23). Identification and characterisation of the retinitis pigmentosa 1-like1 gene (RP1L1): a novel candidate for retinal degenerations. EUROPEAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS, vol. 11; p , ISSN: Barbieri AM, Broccoli V, Bovolenta P, Alfano G, Marchitiello A, Mocchetti C, Crippa L, Bulfone A, Marigo V, Ballabio A, BANFI S. (22). Vax2 inactivation in mouse determines alteration of the eye dorsal-ventral axis, misrouting of the optic fibres and eye coloboma. DEVELOPMENT, vol. 129; p , ISSN:

4 6 - Abstract dei compiti svolti dall'unità di Ricerca Le distrofie retiniche ereditarie sono un gruppo di patologie gravi che rappresentano una delle piu' frequenti cause di cecita' di origine genetica nel mondo occidentale. Da un punto di vista clinico, si possono presentare o in forma isolata o in forma sindromica in cui la compromissione retinica si accompagna ad altre manifestazioni extra-oculari. Le forme isolate comprendono, tra le altre, la retinite pigmentosa e l'amaurosi congenita di Leber. La notevole eterogeneita' genetica di queste condizioni ha finora seriamente ostacolato la definizione delle cause molecolari di queste condizioni nei pazienti affetti. Inoltre, rimangono ancora molte incertezze sui meccanismi molecolari che dalla mutazione nel gene responsabile portano poi alla degenerazione dei fotorecettori, le cellule retiniche che costituiscono il bersaglio primario di queste patologie. Una migliore conoscenza dei meccanismi alla base del processo degenerativo retinico potrebbe portare ad un migliore disegno di strategie terapeutiche, attualmente molto carente per queste condizioni. In questo progetto, ci proponiamo di realizzare due principali obiettivi: 1) Definire in modo piu' efficace le basi molecolari delle forme isolate di distrofie retiniche autosomiche recessive (ARRD). Per questo obiettivo, utilizzeremo la procedura del sequenziamento dell'intero esoma, vale a dire dell'intera collezione degli esoni codificanti per proteine presenti nel genoma umano tramite l'utilizzo della emergente tecnologia del Sequenziamento di Nuova Generazione (NGS). Applicheremo questa procedura a un sottogruppo di pazienti ARRD per cui e' gia' disponibile una preliminare ma approfondita caratterizzazione sia clinica che molecolare. Tramite questa strategia, sara' possibile sia identificare nuove mutazioni all'interno di geni ARRD gia' noti che identificare nuovi geni responsabili per queste patologie. Per il successo di questa procedura ci avvarremo sia della stretta collaborazione con la Unita' Operativa 1 che di collaborazioni con altre Istituzioni europee. 2) Studio del ruolo di microrna selezionati nella funzione retinica e valutazione del loro possibile effetto protettivo in processi di degenerazione retinica. I microrna (mirna) sono una classe di piccoli RNA non codificanti che controllano i livelli di espressione dei loro geni bersaglio. Nonostante sia noto il contributo dei mirna nella regolazione di processi biologici importanti, e' ancora poco chiaro il ruolo esercitato da mirna specifici nell'ambito dello sviluppo e della funzione oculare. Utilizzando tecniche sia di inattivazione che di sovraespressione negli organismi modello di medaka e di topo, ci proponiamo di ottenere in vivo, in collaborazione con la Unita' Operativa 2, informazioni sul contributo di mirna selezionati alla funzione retinica, sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Ci proponiamo inoltre di valutare in modelli murini di degenerazione retinica il possibile utilizzo di questi mirna come agenti terapeutici in grado di esercitare un'azione protettiva nelle ARRD. Riteniamo che questo progetto possa portare da un lato ad una migliore definizione delle basi molecolari delle ARRD isolate e a un miglioramento delle relative procedure diagnostiche e, dall'altro lato, a una migliore comprensione dei meccanismi molecolari alla base della degenerazione retinica che rappresenta l'elemento caratteristico di questo gruppo di patologie. Inherited retinal dystrophies are a group of severe conditions that represent the most frequent causes of genetic blindness in the western world. From the clinical point of view, they can be either isolated or syndromic, in which the retinal dysfunction is associated with extra-ocular manifestations. Isolated forms of inherited retinal dystrophies include retinitis pigmentosa and Leber Congenital Amaurosis, among the others. The significant genetic heterogeneity of these conditions has so far hampered a comprehensive definition of the molecular defects underlying these conditions in the patients. Moreover, also the entire cascade of molecular events that are triggered by the causative mutations and that eventually lead to the degeneration of photoreceptors, i.e., the primary cellular targets in these diseases has not been properly elucidated yet. A better knowledge of the mechanisms underlying retinal degeneration processes is expected to allow a more efficient design of therapeutic strategies which are currently limited for these conditions. In this project we propose to achieve two main objectives: 1) Define in a more efficient manner the molecular basis of isolated forms of autosomal recessive inherited retinal dystrophies (ARRD). To achieve this goal, we will use whole exome sequencing, i.e., the sequencing of the entire repertoire of protein-coding exons in the human genome, by taking advantage of the emerging technology of Next Generation Sequencing (NGS). We will apply this procedure to a subgroup of ARRD patients that already underwent a preliminary but detailed clinical and molecular characterization. By this strategy, it will be possible both to identify previously undescribed mutations in known ARRD genes and to uncover novel genes responsible for these diseases. For a susscessful outcome of this task, we will exploit a close and longstanding collaboration with Unit 1 and with other European Institutions. 2) Study of the role of selected micrornas in retinal function and evaluation of their putative protective role in retinal degeneration processes. MicroRNAs (mirnas) are a class of short non-coding RNAs that control the expression levels of their target genes. Despite their established contribution in the regulation of basic biological processes, the role of specific mirnas in controlling ocular development and function remains largely elusive. By means of inactivation and overexpression assays in the medaka and mouse model organisms, we propose, in close collaboration with Unit 2, to gain information on the contribution of selected mirnas in retinal function, in both physiological and pathological conditions. We will also aim at evaluating, through the use of mouse models of retinal degeneration, the potential use of the above mirnas as therapeutic agents capable of exerting a protective action in ARRD. We believe that this project will lead, on one hand, to a better definition of the molecular basis of isolated ARRD and to an improvement of the related diagnostic procedures and, on the other hand, to a better understanding of the molecular mechanisms underlying the retinal degeneration, which represents the hallmark of this group of diseases. 7 - Settori di ricerca ERC (European Research Council) LS Life Sciences LS5 Neurosciences and neural disorders: neurobiology, neuroanatomy, neurophysiology, neurochemistry, neuropharmacology, neuroimaging, systems neuroscience, neurological disorders, psychiatry LS5_4 Sensory systems (e.g. visual system, auditory system) LS2 Genetics, Genomics, Bioinformatics and Systems Biology: genetics, population genetics, molecular genetics, genomics, transcriptomics, proteomics, metabolomics, bioinformatics, computational biology, biostatistics, biological modelling and simulation, systems biology, genetic epidemiology LS2_1 Genomics, comparative genomics, functional genomics 8 - Collaborazioni con altri organismi di ricerca pubblici e privati, nazionali e internazionali, e indicazione degli eventuali collegamenti con gli obiettivi di Horizon 22 Allegato 1 Lettera di intenti con Fondazione Telethon (italiano) Allegato 2 Letter of intent with Telethon Foundation (english) Allegato 3 Lettera di intenti con Fundacion Jimenez Diaz Madrid, Spain (italiano) Allegato 4 Letter of intent with Fundacion Jimenez Diaz Madrid, Spain (english)

5 Allegato 5 Lettera di intenti con Blindness Genetic Unit, Radboud University Nijmegen (italiano) Allegato 6 Letter of intent with Blindness Genetic Unit, Radboud University Nijmegen (english) 9 - Parole chiave MALATTIE EREDITARIE RETINICHE MICRORNA RETINAL DEGENERATION INHERITED RETINAL DISEASES MICRORNA RETINAL DEGENERATION 1 - Stato dell'arte Definizione delle cause molecolari delle forme isolate di distrofie retiniche ereditarie ad ereditarieta' autosomica recessive (ARRD) Le distrofie retiniche ereditarie rappresentano una delle piu' frequenti cause di cecita' di origine genetica nel mondo occidentale. Esse comprendono, tra le altre, la retinite pigmentosa (RP) e l'amaurosi congenita di Leber (LCA). La RP e' la forma piu' frequente con un'incidenza approssimativa di circa 1 caso su 4 individui(3). Essa e' caratterizzata da cecita' notturna e progressiva degenerazione della retina nelle regioni periferiche con accumuli di pigmento tipo osteoblasti e marcate alterazioni elettroretinografiche. La RP si puo' presentare in forma isolata o puo' essere sindromica, vale a dire associata a manifestazioni extra-oculari come nel caso della sindrome di Usher o nella sindrome di Bardet-Biedle. Da un punto di vista genetico, la RP e' altamente eterogenea, con modalita' di trasmissione autosomica dominante, autosomica recessiva o associata al cromosoma X. Una significativa percentuale di pazienti con RP e' apparentemente sporadica. Negli ultimi anni, piu' di 1 loci genetici implicati nella patogenesi della RP sono stati individuati e localizzati in specifiche regioni cromosomiche ( e sono stati identificati piu' di 5 geni responsabili. I geni piu' frequentemente responsabili di RP sono rodopsina (RHO) ed RP1 per quanto concerne le forme autosomiche dominanti(4); CRB1, PDE6A, PDE6B e USH2A per le forme autosomico recessive; ed RPGR per le forme legate al cromosoma X. Tra le RP, le forme autosomiche recessive sono solitamente caratterizzate dal fenotipo piu' severo, da un'eta' di insorgenza piu' precoce e da una piu' rapida progressione verso la cecita'. Spesso, non e' possibile differenziare, da un punto di vista clinico, le RP autosomiche recessive gravi dalla LCA e' caratterizzata da un severo deficit della visione a esordio nei primissimi anni di vita(5). Anche essa e' normalmente ereditata come un tratto autosomico recessivo: a tutt'oggi, mutazioni in almeno 15 geni si sono rivelate essere alla base di questa condizione ( Alcuni dei geni implicati in RP autosomiche recessive (ARRP), tra cui RPE65, CRB1 e TULP1, sono anche responsabili di LCA, a ulteriore conferma del fatto che le due condizioni possano spesso rappresentare un continuum piuttosto che due entita' nettamente distinte. A causa del progressivo aumento del numero dei geni implicati in ARRP ed LCA, e'stato molto difficoltoso, fino a questo momento, potere disegnare un protocollo efficace per il riconoscimento delle cause molecolari di queste condizioni nei pazienti affetti. Tuttavia, una classificazione molecolare corretta sia delle ARRP che delle LCA e', mai come oggi, particolarmente necessaria, dal momento che protocolli di trattamento di queste condizioni, basate sulla terapia genica, potrebbero rendersi disponibili nella pratica clinica nell'immediato future come suggerito dagli ottimi risultati recentemente ottenuti in pazienti LCA con mutazioni nel gene RPE65 (6-1). Alla luce di questi risultati, cosi' come anche di future ulteriori estensioni ad altre forme di LCA e ARRP, si rende pertanto necessario migliorare le procedure di analisi molecolari per questo gruppo di patologie. Purtroppo, pero', al momento, il riconoscimento dei difetti molecolari responsabili di distrofie retiniche ereditarie (ARRD) nel singolo paziente rimane un processo molto complesso. Da studi effettuati sia dal nostro gruppo che da altri laboratori, emerge l'evidenza che e' possibile determinare la causa molecolare di ARRD solamente nel 3-5% dei pazienti, anche quando si analizzino con le tecniche di analisi mutazionale piu' comunemente usate (sequenziamento diretto e/o analisi di microchip) tutti i geni causativi attualmente noti. A titolo di esempio, il nostro gruppo ha negli ultimi anni effettuato il piu' ampio studio genetico su pazienti italiani affetti da ARRD. In particolare, abbiamo analizzato una casistica di 5 pazienti ben caratterizzati clinicamente, comprendente casi di RP, LCA e syndrome di Usher(11, 12). L'analisi mutazionale, effettuata tramite analisi di microchip e sequenziamento diretto, ha permesso di riconoscere il difetto molecolare in solo il 3% dei casi. I dati di cui sopra sono fortemente suggestivi per la presenza di nuovi geni, non ancora al momento identificati, responsabili di ARRD. Fortunatamente, la recente introduzione di una nuova e rivoluzionaria metodologia di sequenziamento, la cosiddetta Next Generation Sequencing (NGS) sembra in grado di offire la soluzione ideale ai problemi connessi all'analisi molecolare di patologie monogeniche altamente eterogenee quali appunto le ARRD. Ruolo dei microrna nella funzionalita' retinica I microrna (mirna) sono una classe di piccoli RNA non codificanti che controllano i livelli di espressione dei loro geni bersaglio. A livello molecolare, essi esercitano la loro funzione in cellule animali legandosi, con appaiamento imperfetto, a siti specifici nella regione del 3' non tradottto (3'-UTR) di RNA messaggeri (mrna) che rappresentano i loro bersagli. Questo legame ha come conseguenza o l'inibizione della traduzione o la degradazione dell'mrna bersaglio (target) (13, 14). Attualmente, oltre 1 mirna sono stati identificati nel genoma umano (database mirbase, (15). Tenendo conto del fatto che ogni mirna può regolare, in media, l'espressione di 1-2 geni bersaglio (16, 17), l'intero apparato dei mirna sembra in grado di esercitare un ruolo fondamentale nel controllo dell'espressione genica per una porzione significativa del trascrittoma nei mammiferi. Di conseguenza, i mirna rappresentano mediatori chiave di processi biologici fondamentali. Nell'uomo, la alterazione della espressione dei mirna, che puo' derivare sia da mutazioni nei mirna stessi che nei loro gene bersaglio, è stata correlata con molte condizioni patologiche quali il diabete, malattie neurodegenerative, insufficienza cardiaca, alcune forme di sordità ereditaria (18, 19), tra le altre. Inoltre, vi è un progressivo aumento delle evidenze a supporto di un ruolo dei mirna nella patogenesi del cancro nell'uomo (2). Recentemente, i mirna stanno emergendo anche come nuovi possibili bersagli di interventi terapeutici per una varietà di malattie. Un ruolo terapeutico dei mirna è stato già descritto in un gran numero di modelli di cancro (21), in malattie cardiache (22), nella distrofia muscolare (23) e in patologie epatiche (24). Ne consegue che l'uso terapeutico dei mirna rappresenti un argomento molto promettente nell'ambito della moderna ricerca medica anche se una sua più ampia applicazione richiede una piu' completa e adeguata comprensione del ruolo dei mirna nel controllo dell'espressione genica. La perturbazione globale della biogenesi e della funzione dei mirna in topi con inattivazione specifica nell'occhio del gene Dicer è stata riscontrata essere associata a grossolano sviluppo di varie strutture oculari quali la retina, il cristallino, la cornea e il chiasma ottico (25-28). Tuttavia, e' ancora poco chiaro il ruolo esercitato da specifici mirna nell'ambito dello sviluppo e della funzione oculare eccetto che per alcune osservazioni, alcune delle quali riportate da questa stessa Unita' Operativa(29, 3). In particolare, siamo stati in grado di generare il piu completo atlante di espressione di mirna in tessuti oculari attualmente disponibile. Lo studio di tale atlante, denominato mirneye(31, 32), ha portato all'identificazione di un cospicuo numero di mirna che presentano significativi livelli di espressione in uno o più tipi diversi di cellule retiniche. Questi ultimi rappresentano mirna potenzialmente in grado di esercitare un controllo importante della funzionalita' retinica sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Study of the molecular basis of isolated forms of autosomal recessive retinal dystrophies (ARRD) Inherited retinal dystrophies represent one of the most frequent causes of genetic blindness in the western world. They include retinitis pigmentosa and Leber Congenital Amaurosis, among the others. Retinitis pigmentosa (RP) is the most frequent form of retinal dystrophies with an approximative incidence of about 1 in 4 individuals (3). At its clinical onset, RP is characterized by night blindness and progressive degeneration of the peripheral retina accompanied by bone spicule-like pigmentary deposits and a reduced or absent electroretinogram (ERG). RP can be isolated or syndromic, i.e., associated to extra-ocular manifestations such as in Usher syndrome or in Bardet-Biedle syndrome. From a genetic point of view, RP is highly heterogeneous, with autosomal dominant, autosomal recessive and X-linked patterns of inheritance. A significant percentage of RP patients, however, are apparently sporadic. Over the last few years, more than 1 genes causing inherited retinal diseases have been mapped to chromosomal locations (see RETnet web site: and over fifty responsible genes

6 have been identified. The genes most frequently involved in RP pathogenesis are Rhodopsin (RHO) and RP1 for the autosomal dominant forms(4); CRB1, PDE6A, PDE6B, EYS and USH2A for the autosomal recessive forms; RPGR for the X-linked forms. Autosomal recessive forms of RP are usually characterized by a more severe phenotype, by an earlier age of onset (even in the early infancy) and by a more rapid progression towards complete blindness. Often, it is not easy to distinguish, from a purely clinical point of view, autosomal recessive RP from another severe form of retinal dystrophy, i.e., Leber congenital amaurosi (LCA). LCA is characterized by a severe visual impairment that manifest in the first years of life(5) and is usually transmitted in an autosomal recessive manner. To date, mutations in at least 15 genes have been shown to be involved in the pathogenesis of this condition ( Some of the genes involved in autosomal recessive RP (ARRP), among which RPE65, CRB1 and TULP1, may also be responsible for LCA, which further highlights that the two conditions may not constitute two clearly distinct clinical entities but rather a continuum of phenotypes. Due to the progressive increase in the number of genes implicated in ARRP and LCA, the design of an effective protocol for the identification of the molecular basis of these conditions in patients turned out to be quite difficult until now. However, a correct molecular classification both of ARRP and LCA patients is necessary, particularly at the present time due to the fact that therapeutic protocols for these conditions based on gene therapy may become available in the clinical practice in the near future, as suggested by the excellent results recently obtained in LCA patients with RPE65 mutations (6-1). Due to the successful outcome of the latter efforts, as well as of other future applications to other forms of LCA and ARRP, the improvement of the procedures for the molecular characterization of this group of diseases is highly desirable. Unfortunately, however, the recognition of the molecular defect leading to autosomal recessive forms of isolated retinal dystrophies (ARRD), including RP and LCA remains a very complex process in each patient. Based on results obtained both by a number of research groups including ours, it is evident that it is currently possible to determine the molecular defect underlying ARRD in only 3-5% of patients even when one analyzes, using standard procedures for mutation analysis (i.e., direct Sanger sequencing and/or microchip procedures) all currently known causative genes. As a matter of example, our group has undertaken, in the past few years, the most comprehensive genetic study on Italian ARRD patients. In particular, we have analyzed a collection of 5 patients well characterized from the clinical point of view, including RP, LCA and Usher syndrome patients. The mutation analysis of the above patients, carried out by microchip analysis and standard direct sequencing, allowed us to pinpoint the molecular defect in only 3% of cases. L'analisi mutazionale, effettuata tramite analisi di microchip e sequenziamento diretto, ha permesso di riconoscere il difetto molecolare in solo il 3% dei casi (11, 12) and Banfi, unpublished data). The above data are highly suggestive for the presence of new ARRD genes, yet to be identified, that may account for a significant percentage of patients. Fortunately, the recent development of a new and revolutionary sequencing methodology, the so-called Next Generation Sequencing (NGS), seems to provide and effective solution to the problems related to the molecular characterization of highly genetically heterogeneous disorders, such as ARRD. Role of micrornas in retinal function MicroRNAs (mirnas) are a class of short non-coding RNAs that control the expression levels of their target genes. At the molecular level, they exert their function in animal cells by binding, with imperfect base pairing, to target sites in the 3' UTR of messenger RNAs. This binding either causes the inhibition of translational initiation or leads to mrna degradation (13, 14). Currently, over 6 mirnas have been identified in mouse and about 1 in human (mirbase database, (15). Taking into account the fact that each mirna can regulate, on average, the expression of 1-2 target genes (16, 17), the whole mirna apparatus seems to participate in the control of gene expression for a significant proportion of the mammalian gene complement. As a consequence, mirnas represent key mediators of basic biological processes. In humans, deregulation of mirna expression caused by mutations in either the mirna itself or its target gene has been correlated with a number of pathological conditions such as diabetes, neurodegenerative diseases, heart failure, hereditary deafness (18, 19), among others. Moreover, there is growing evidence supporting a role of mirnas in human cancers (2). Recently, mirnas are emerging also as new targets of therapeutic interventions for a variety of diseases. A therapeutic role of mirnas was already described in a number of cancer models (21), in heart diseases (22), in muscular dystrophy (23) and in liver disorders (24). Therefore, the therapeutic use of mirnas represents a promising field of research in modern medicine although its more extensive application requires an adequate understanding of the gene expression changes controlled by mirnas. Global perturbation of mirna function in the eye of conditional Dicer mouse mutants has been reported to impair the normal development of the retina, lens, cornea and optic chiasm (25-28). However, the precise role of individual mirnas and their specific influences on given mrna targets and biological pathways that are important for vertebrate eye development and function remained largely elusive until recently, apart from a few notable exceptions, including also work form our group (29, 3). We have also generated the most comprenhensive to date atlas of mirna expression in ocular tissues, using both microarray and RNA in situ hybridization (ISH) procedures (31, 32). As a result, we have identified a number of mirnas with significant expression levels in one of more retinal cell layers Riferimenti bibliografici 1. D. Bandah-Rozenfeld et al., Mutations in IMPG2, encoding interphotoreceptor matrix proteoglycan 2, cause autosomal-recessive retinitis pigmentosa. 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Hurley, Leber congenital amaurosis linked to AIPL1: a mouse model reveals destabilization of cgmp phosphodiesterase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 11, (Sep 21, 24) Descrizione dei compiti dell'unità di Ricerca I compiti principali di questa Unita' Operativa saranno i seguenti: 1) Definizione delle basi molecolari di forme isolate di distrofie retiniche autosomiche recessive (ARRD) tramite l'utilizzo del Sequenziamento di Nuova Generazione (NGS). 2) Studio del ruolo di microrna selezionati nella funzione retinica e valutazione del loro possibile effetto protettivo in processi di degenerazione retinica. PIANO SPERIMENTALE 1) Definizione delle basi molecolari di forme isolate di distrofie retiniche autosomiche recessive (ARRD) tramite l'utilizzo del Sequenziamento di Nuova Generazione (NGS). I recenti progressi delle tecnologie basate sul Sequenziamento di nuova generazione (NGS) stanno portando ad una evoluzione e alla semplificazione delle strategie per l'identificazione di geni malattia. In particolare, l'approccio che nell'ambito delle procedure basate sull'ngs ha dato luogo ai migliori risultati e' senza dubbio il sequenziamento dell'intero esoma, vale a dire dell'intera collezione degli esoni codificanti per proteine presenti nel genoma umano. Il sequenziamento esomico ha infatti portato all'identificazione di un numero considerevole di nuovi geni responsabili di malattie ereditarie negli ultimi anni (33-36). L'utilizzo del sequenziamento esomico e' particolarmente promettente nel campo delle malattie monogeniche caratterizzate da elevate eterogeneita' genetica, come appunto nel caso delle ARRD. Proponiamo di usare metodiche di sequenziamento esomico ai fini di una maggiore comprensione delle basi molecolari delle ARRD e in particolare per identificare nuovi geni responsabili di queste condizioni. Piu' specificamente, applicheremo questa procedura a una collezione di pazienti italiani ben caratterizzati dal punto di vista clinico. In particolare, selezioneremo un sottogruppo di 6 campioni di DNA da una casistica a noi disponibile di oltre 8 pazienti con ARRD che hanno gia' ricevuto un dettagliato inquadramento oftalmologico da parte della Unita' Operativa 1 (Prof. Simonelli) e una caratterizzazione molecolare preliminare da parte della nostra Unita' Operativa. I nostri criteri di selezione per la scelta dei 6 pazienti da sottoporre al sequenziamento esomico saranno i seguenti: 1) pazienti in cui, tramite l'utilizzo di un microchip di genotipizzazione basato sulla tecnologia APEX, non e' stata identificata alcuna mutazione precedentemente descritta in in geni gia' noti essere coinvolti nella patogenesi delle ARRD; 2) pazienti che facciano parte di famiglie in cui siano presenti e disponibili I DNA di altri individui affetti in modo da facilitare gli studi di segregazione delle putative mutazioni; e infine 3) pazienti in cui sia gia' stata da noi effettuata un'analisi di genotipizzazione tramite microchip di Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) ad alta risoluzione. Tale analisi e' mirata all'identificazione di regioni di omozigosita' genomica che costituiscono loci genomici con le maggiori probabilita' di ospitare la mutazione causativa e quindi eventuali nuovi geni responsabili di ARRD (Banfi, unpublished data). Quest'ultima procedura e' stata applicata con successo a pazienti da famiglie sia con alto che basso tasso di consanguineita' ed ha portato al riconoscimento di un numero significativo di nuovi geni ARRD (37). Sulla base delle considerazioni di cui sopra, il questo sottogruppo selezionato di pazienti rappresenta una risorsa straordinaria per la possibile identificazione di nuovi geni ARRD. Per questa analisi, daremo piu alta priorità ai casi di ARRD (il cui numero' e all'incirca di 4) in cui l'analisi di genotipizzazione tramite SNP abbia precedentemente rivelato la presenza di regioni di omozigosita' altamente significative, vale a dire regioni con dimensione superiore a 1 megabase (Mb). L'analisi dell'esoma sarà effettuata nel seguente modo: i campioni di DNA saranno arricchiti per sequenze esoniche utilizzando il kit di arricchimento esomico TruSeq (Illumina, San Diego, CA, USA). Per ogni prodotto arricchito sara' generato un numero di sequenze mappabili sul genoma umano sufficiente a garantire una copertura di almeno 5x tramite la piattaforma di sequenziamento NGS Illumina Hiseq 1. I dati generati saranno mappato sulla versione di riferimento hg19 del genoma umano tramite il software BowTie. Variazioni di sequenza saranno quindi identificate utilizzando gli algoritmi SAMtools o GATK, utilizzando parametri di stringenza conservativi. Per una piu' efficiente analisi dei risultati, analizzeremo il database dbsnp e una banca dati interna di sequenze esomiche ottenute da soggetti italiani (n=4) per filtrare tutte le variazioni di sequenza con le minori probabilita' di avere un ruolo patogenetico. Successivamente, procederemo con la ricerca di variazioni di sequenza potenzialmente deleterie all'interno di geni gia' noti essere coinvolti nella patogenesi delle ARRD. Le possibili mutazioni identificate saranno convalidate tramite: 1) un metodo di sequenziamento indipendente rispetto all'ngs, cioe' lo standard sequenziamento con il metodo Sanger; 2) analisi di segregazione su altri membri della famiglia; e 3) verificando la presenza della variazione di sequenza in almeno 2 individui di controllo. Nei casi rimanenti, vale dire in quei pazienti in cui non ci sara' alcuna evidenza per la presenza di mutazioni in geni noti di ARRD, andremo alla ricerca di nuovi geni ARRD estendendo l'analisi all'intero esoma. In particolare, daremo priorita' piu' alta a geni candidati con una o piu' delle seguenti caratteristiche: a) geni contenenti variazioni di sequenza con potenziale effetto deleterio che saranno localizzati all'interno di regioni di significativa omozigosita' nel paziente in questione, come evidenziato da analisi di genotipizzazione tramite SNP; b) geni che presenteranno diverse variazioni di sequenza con potenziale ruolo patogenetico in diversi pazienti ARRD esaminati; c) geni con un ruolo gia' precedentemente individuato, tramite analisi della letteratura, nello sviluppo e funzionalita' retinica e/o con una precedente evidenza di significativi livelli di espressione nell'occhio. Le variazioni di sequenza che saranno identificate nei possibili nuovi geni ARRD saranno successivamente sottoposti a protocollo di convalidazione simile a quello precedentemente descritto per la valutazione della patogenicita' delle nuove mutazioni riscontrate in geni ARRD gia' noti. Infine, trarremo vantaggio da una collaborazione con due Istituzioni di Ricerca europee, vale a dire l'instituto de Investigacion Sanitaria-Fundacion Jimenez Diaz (IIS-FJD) di Madrid, Spagna, e il Dipartimento di Genetica Umana dellla Radboud University Nijmegen Medical Centre di Nijmegen, Paesi Bassi, per approfondire ulteriormente la potenziale patogenicita' dei nuovi geni candidate per ARRD identificati. Le due summenzionate istituzioni hanno anch'esse un forte interesse nella delucidazione delle basi molecolari delle ARRD e hanno avuto un ruolo importante negli ultimi anni nella identificazione di diversi nuovi geni responsabili di ARRD tramite utilizzo di genotipizzazione con SNP e procedure di NGS (2, 38). Condivideremo, su base collaborativa, i dati che otterremo sui nuovi geni candidate di ARRD con le due istituzioni di cui sopra. Queste ultime, innanzitutto controlleranno innanzitutto i loro precedenti dati di genotipizzazione mediante SNP su pazienti con ARRD per verificare la presenza di regioni di omozigosita' che possano includere i loci dei geni candidati identificati dalla nostra Unita' Operativa, come precedentemente descritto. In secondo luogo, le due Istituzioni procederanno ad analisi mutazionali per i nuovi geni candidati di ARRD nei pazienti apppropriati. Grazie a queste preziose collaborazioni, saremo in grado di determinare in modo piu' efficace la patogenicita' e la rilevanza dei nuovi possibili geni ARRD che identificheremo nel corso di questo progetto. Inoltre, e' importante sottolineare che queste collaborazioni si esplicheranno anche nella direzione opposta, vale a dire che la nostra Unita' Operativa sara' informata circa nuovi geni candidati per ARRD identificati dalle due Istituzioni collaboranti e che quindi avremo la possibilita' di analizzare questi nuovi geni nelle nostre collezioni di pazienti, qualora appropriato. Tutte le informazioni sui nuovi geni ARRD identificati dalla nostra Unita' nel corso del progetto saranno immediatamente condivisi con la Unita' Operativa 1 (Prof.ssa Simonelli) che effettuera' ulteriori approfondimenti clinici dei pazienti con mutazioni in quei geni per stabilire possibili correlazioni genotipo-fenotipo e per valutare la possibile presenza di caratteristiche cliniche specifiche che possano essere usate per selezionare piu' facilmente altri pazienti con mutazioni negli stessi geni o in geni altamente correlati. Riteniamo che questa parte del progetto, grazie anche alla rete di collaborazioni proposta, dovrebbe portare ad una migliore definizione delle basi molecolari delle ARRD e a un miglioramento delle procedure diagnostiche per questo gruppo complesso ed eterogeneo di malattie. 2) Studio del ruolo di microrna selezionati nella funzione retinica e valutazione del loro possibile effetto protettivo in processi di degenerazione retinica.

8 Come risultato dei nostri precedenti studi sistematici di espressione dei microrna (mirna) nell'occhio (31, 32), abbiamo identificato un sottogruppo ristretto di mirna con alti livelli di espressione nella retina. Questi ultimi potrebbero non solo rappresentare elementi chiave nel controllo dei pathway molecolari che presiedono alla funzione retinica ma potrebbero anche essere analizzati come possibili agenti terapeutici in processi patologici a carico della retina. Riteniamo infatti che le malattie oculari, e in principal modo la retinite pigmentosa (RP), siano condizioni che potrebbero beneficiare grandemente dall'uso di terapie basate sui mirna. Questo perche' innanzitutto l'occhio è un bersaglio ideale per la terapia genica. Trattandosi di un organo piccolo e compartimentalizzato, richiede basse dosi di somministrazione di vettori virali/transgeni mentre la presenza della barriera ematoretinica previene la diffusione del vettore alla circolazione generale. E' pertanto facile modificare l'espressione di un dato mirna specificamente nell'occhio o nella retina, persino in un particolare tipo cellulare senza minimamente interferire con la sua funzione in altri tessuti. In questa parte del progetto, ci proponiamo di identificare mirna con un ruolo rilevante nel controllo dei pathway funzionali alla base della funzionalita' retinica e/o capaci di modulare i processi degenerativi che si verificano nella RP con la possibilita' quindi di disegnare nuove strategie terapeutiche. Per la realizzazione di questa parte del progetto, ci avvarremo di: a) la notevole competenza presente all'interno della rete proposta di Unita' operative (in particolare la nostra Unita' e quella della Prof.ssa Franco nella Unita' 2) nell'utilizzo dell'organismo modello di Oryzias latipes (medakafish), che consente di eseguire in modo efficiente e rapido studi di manipolazione genica; e b) la significativa competenza della Unita' 2 (Prof. Auricchio) nell'uso di vettori Virali Adeno-Associati (AAV) come strumenti efficaci per effettuare trasferimento genico nella retina murina. Per questa analisi, proponiamo di selezionare tra i 5 e i 1 mirna con i piu' alti livelli di espressione nell'occhio di topo e di effettuare sia studi di inattivazione che di sovraespressione in vivo in embrioni di medaka. Tra i mirna candidati da sottoporre a questa analisi, possiamo menzionare mir-124, mir-182, mir-183, mir-96, mir-181a e mir-24. Per quest'ultimo, abbiamo gia' prodotto alcuni dati che hanno dimostrato il suo ruolo in processi di base dello sviluppo oculare in generale (3). Effettueremo, in collaborazione con la Prof.ssa Franco, Unita' Operativa 2, la seguente caratterizzazione funzionale dei mirna selezionati utilizzando il sistema modello di medakafish: a) Innanzitutto, accerteremo la conservazione in medaka dei mirna selezionati (la sequenza genomica e' disponibile al sito Convalideremo poi la conservazione dei mirna di interesse anche a livello di espressione, mediante ibridazione in situ (ISH) con sonde a RNA. b) Approcci di inattivazione. Inietteremo specifici oligonucleotide morpholino multibloccanti (Gene Tools LLC) insieme con gli appropriati controlli, allo stadio di una cellula nell'embrione di medaka. Gli oligo morpholino sono molto stabili e possono esercitare la loro funzione inibitoria fino a stadi molto tardivi di sviluppo dei pesci, quando cioe' la retina e' completamente matura e ha raggiunto la piena funzionalita'. c) Approcci di sovraespressione. Ci avvarremo soprattutto della iniezione di mirna a doppio strand ( mirna mimics ) negli embrioni di medaka. Sia negli studi di inattivazione che di sovraespressione, effettueremo un'analisi dettagliata delle conseguenze delle perturbazioni di espressione dei mirna a livello del fenotipo della retina. L'analisi standard prevedera' l'ispezione morfologica e l'analisi istologica della retina nei principali stadi dello sviluppo oculare nel medaka, cioe' agli stadi (st) 24, st3, st34, st38 e nello stadio di larva post-schiusa delle uova per identificare possibili anomalie nella organizzazione delle cellule della retina. Gli effetti delle manipolazioni dei mirna saranno valutati anche a livello molecolare mediante ISH a RNA, immunofluorescenza e immunoistochimica e analisi di proliferazione cellulare (tramite incorporazione di Bromodeoxyuridine (BRDU) e analisi con anticorpi anti-phh3), e di morte cellular (colorazione con TUNEL). Inoltre, valuteremo la presenza di possibili difetti della funzione visiva negli animali iniettati utilizzando test comportamentali standard, quali il test della risposta visuomotoria (basata sulla capacita' dei pesci di modificare la loro attivita' motoria a seconda della quantita' di luce presente nell'ambiente) (39) e il test di risposta optocinetica che misura i movimenti oculari in risposta a oggetti in movimento che attraversino il campo visivo (4). Tramite l'attuazione del sovradescritto piano sperimentale, ci attendiamo di identificare mirna che non soltanto rappresentino elementi chiave nel controllo dei pathway molecolari alla base della funzione oculare ma che possano anche essere valutati come possibili agenti terapeutici in processi patologici a carico della retina, ed in particolare in processi correlate alla degenerazione retinica (RD). Tuttavia, per meglio verificare queste ipotesi, sara' necessario testare la funzione di questi mirna in vivo in sistemi di mammifero, e in modo particolare nella retina murina. Come gia' precedentemente menzionato, effettueremo questa analisi su non piu' di due mirna selezionati, utilizzando un approccio di trasferimento genico alla retina di topo tramite l'utilizzo di vettori AAV, in collaborazione con il Prof. Auricchio (Unita' Operativa 2). Piu' in dettaglio, procederemo all'iniezione, nello spazio subretinico di topi a stadi postnatali, di costrutti basati su AAV che consentano o la sovraespressione o il silenziamento dei mirna selezionati. Per generare tali costrutti, ci avvarremo preferenzialmente del sierotipo AAV2/8 che e' al momento considerato il piu' efficace veicolo AAV per il trasferimento genico ai fotorecettori della retina (41, 42). Per la sovraespressione dei mirna, useremo costrutti AAV esprimenti il mirna di interesse (un frammento genomico generato per PCR comprendente la sequenza del precursore del mirna) sotto il controllo o di un promotore costitutivo o di un promotore specifico di un tipo cellulare retinico (ad esempio, i promotori per i geni Rodopsina o Rodopsina chinasi nel caso dei fototrecettori (41)). Per il silenziamento dei mirna, utilizzeremo costrutti AAV esprimenti short-hairpin (sh)rna che riconoscano in modo specific la regione dell'ansa (loop) del corrispondente precursore di mirna e che sia dotato di un' appropriata sequenza per l'innesco della polimerasi III, quali ad esempio le sequenze H1 o U6 (43). Inietteremo i costrutti per questi mirna in un solo occhio degli animali insieme con un costrutto simile che esprima il gene reporter EGFP (enhanced green fluorescent protein) al fine di valutare l'efficacia e la distribuzione della trasduzione, come precedentemente descritto (44). L'occhio controlaterale dello stesso animale sara' iniettato unicamente con il costrutto esprimente la EGFP come controllo. Tali studi saranno effettuati sia su topi normali che su modelli murini di degenerazione retinica (RD) disponibili nel laboratorio del Prof. Auricchio (Unit 2). Tra i modelli murini di degenerazione retinica, focalizzeremo la nostra attenzione su due modelli autosomico recessivi, cioe' il mutante Rd1, causato da una mutazione da perdita di funzione nel gene Pde6b (45), e il topo knockout per il gene Aipl1 (46). Nel caso dei modelli mutanti, inietteremo i costrutti AAV nei primi stadi della degenerazione dei fotorecettori e di conseguenza selezioneremo il giorno 16 dalla nascita (P16) per il mutante Rd1 mice e lo stadio P4 per i topi knockout Aipl1-/-. Valuteremo gli effetti della perturbazione dell'espressione dei mirna iniettati a livello morfologico, molecolare e funzionale. Effettueremo, a cominciare da due settimane dopo le iniezioni, un'analisi elettroretinografica (ERG) per verificare la presenza di possibili variazioni della funzione visiva. Allo stesso tempo, un esame istologico degli occhi iniettati ci consentira' di valutare possibili difetti nella organizzazione cellulare retinica. In particolare, focalizzeremo la nostra attenzione sulla valutazione della progressione della degenerazione retinica a cominciare dalla conta del numero delle file di nuclei di fotorecettori superstiti che e' tradizionalmente usato come parametro generale per la valutazione della progressione della degenerazione nella retina di topo. Ci aspettiamo di ottenere da questa parte del progetto una piu' ampia conoscenza del ruolo di selezionati mirna nella funzionalita' retinica nei vertebrati cosi' come una prima valutazione sul loro possibile utilizzo come agenti terapeutici nei processi di degenerazione retinica. This Research Unit will be involved in the following two tasks: 1) Definition of the molecular basis of isolated forms of autosomal recessive retinal dystrophies by means of Next Generation Sequencing (NGS)-based approaches 2) Dissection of the role of selected micrornas in retinal function and evaluation of their putative protective role in retinal degeneration processes DETAILED WORKPLAN 1) Definition of the molecular basis of isolated forms of autosomal recessive retinal dystrophies by means of Next Generation Sequencing (NGS)-based approaches The recent advancements in Next Generation Sequencing (NGS) technologies are revolutionizing and simplifying the strategies for disease gene identification. In particular, the NGS approach that turned out to be more successful in that respect is represented by whole-exome sequencing, i.e., the sequencing of the entire repertoire of protein-coding exons in the human genome. Exome sequencing has been instrumental for the identification of a remarkable number novel genes responsible for inherited disorders in the past few years(33-36). The exploitation of whole-exome sequencing is particularly promising in the field of monogenic disorders characterized by high genetic heterogeneity, such as ARRD. We plan to use exome sequencing to gain further insight into the elucidation of the molecular basis of ARRD and in particular to identify novel genes responsible for these conditions. More specifically, we will apply this procedure to a set of well-characterized Italian patients. In particular, we will select a subset of sixty DNA samples from the collection of over 8 ARRD patients, available in our laboratories, who have already received an extensive ophthalmological characterization by Research Unit 1 (Prof. Simonelli) and a preliminary molecular characterization by our Research Unit. Our selection criteria for the 6 patients to undergo whole exome sequencing will be the following : 1) patients not found to harbor any previously described mutations in genes already known to be involved in the pathogenesis of ARRD, as assessed by using an APEX-based genotyping microarray; 2) patients belonging to families with other affected individuals and 3) patients who had already undergone a high-resolution Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) genotyping analysis aimed at identifying regions of genomic homozygosity that represent genomic loci potentially harboring novel genes responsible for ARRD (Banfi, unpublished data). The latter procedure has been successfully applied to both consanguineous and non-consanguineous patients and led to the identification of a number of novel ARRD genes (37). Based on the above considerations, the latter subset of patients represents an extraordinary resource for the possible identification of novel ARRD genes. We will prioritize for this analysis ARRD cases (n=4) in which the SNP genotyping analysis revealed the presence of highly significant homozygosity regions, i.e., regions with a size of at least 1 megabase (Mb). The whole exome analysis will be carried out as follows: DNA samples will be enriched for exon sequences using the TruSeq Exome Enrichment kit (Illumina, San Diego, CA, USA). For each enriched product we will generate a number of mappable sequence sufficient to guarantee a coverage of at least 5x using an Illumina Hiseq 1 platform. The data generated will be mapped to the hg19 reference genome with the BowTie software. Single-nucleotide variants will be subsequently called by using either the SAMtools or the GATK packages with a conservative call stringency. For data analysis and interpretation, we will analyze both the dbsnp database and an in-house database of whole exome sequences (n=4) generated from Italian individuals to filter out previously reported benign variations. We will first search for newly-described potentially deleterious sequence variants in genes already known to be involved in ARRD pathogenesis. We will validate the putative mutations identified by 1) an alternative sequencing method, namely standard Sanger sequencing, 2) by carrying out segregation analysis on other members of the patient family and 3) by evaluating the presence of the sequence variants in at least 2 control individuals. In the remaining cases, i.e., in those patients with no evidence of mutations in known ARRD genes, we will search for novel ARRD genes by analyzing the whole exome. In particular, we will prioritize for further analysis the genes with one of more of the following features: a) genes carrying putatively deleterious sequence

9 variants that will be localized within regions of homozygosity, as assessed by SNP genotyping analysis; b) genes that will share potentially pathogenic sequence variants among different ARRD patients; c) genes with a previously established role in retinal development and function, as assessed from extensive literature analysis, and/or with previous evidence of significant expression in the eye. The sequence variants which will be identified in putative novel ARRD gene will then be validated similar to what above described for the pathogenicity assessment of novel mutations identified in known ARRD genes. Finally, we will exploit a collaboration with two European Institutions, i.e., the Instituto de Investigacion Sanitaria-Fundacion Jimenez Diaz (IIS-FJD), based in Madrid, Spain and the Division of Molecular Genetics at the Radboud University Nijmegen Medical Centre in Nijmegen, The Netherlands to further evaluate the putative pathogenicity of the candidate ARRD genes identified. The two above institutions are also focusing their research efforts in the elucidation of the molecular basis of ARRD and have contributed in the past few years to the identification of several novel ARRD genes by means of SNP genotyping and NGS procedures (2, 38). We will share on a collaborative basis the data we will obtain on novel ARRD candidate genes in our patients with the two above institutions. They will first check their previous SNP genotyping data in ARRD patients to verify whether they have already evidence for the presence of homozygosity regions overlapping the genomic locations of the candidate genes identified by our Research Unit, as previously described. They will then carry out focused mutation analysis for the novel ARRD candidate genes in the appropriate patients. Thanks to these cooperative efforts, we will be able to more efficiently assess the pathogenicity and the relevance of the ARRD candidate genes we will identify in the course of this project. On the other hand, the collaboration will also work in the opposite directions, i.e., we will be informed about novel ARRD candidate genes identified by the two collaborating institutions and we will have the possibility to test them in our cohorts of patients, if appropriate. All the information on the newly-identified ARRD candidate genes identified by our Research Unit during the project will be immediately given to Research Unit 1 (Prof. Simonelli), which will perform further clinical evaluation of the patients harboring mutations in those genes to perform genotype-phenotype studies and to evaluate the presence of specific clinical features that can be used to more easily pinpoint other patients with mutations in the same or highly related genes. Overall, this part of the project, also thanks to the proposed network of collaborations, should lead to a better definition of the molecular basis of ARRD and to an improvement of the diagnostic procedures for this heterogeneous group of diseases. 2) Dissection of the role of selected micrornas in retinal function and evaluation of their putative protective role in retinal degeneration processes Based on the results of our previous systematic studies on microrna expression in the eye (31, 32), we identified a small subset of highly retina-expressed mirnas that may not only represent key players in the control of the molecular pathways underlying reinal function but could also be tested as putative therapeutic tools for retinal pathological processes. We believe that eye diseases, and in particular retinitis pigmentosa (RP), are conditions that can greatly benefit from the use of mirna-based therapies. The eye is an ideal target for gene therapy. Being a small, compartmentalized organ, it requires low doses of viral vectors/transgenes administered while the presence of the blood-retinal barrier prevents unintentional spreading of the vector to the general circulation. Therefore, it is feasible to restrict the desired changes in expression of a given mirna, specifically to the eye or to the retina, even with cell-type selectivity, without interfering with its function in other districts. In this part of the project, we aim at identifying mirnas with a relevant role in the control of the functional pathways underlying retinal function and/or able to modulate the degenerative processes occurring in RP with the possibility of opening new avenues for the design of effective therapeutic strategies. For this part of the project, we will take advantage of a) the strong expertise within the proposed Consortium (our own Unit as well as Prof. Franco in Research Unit 2) in the use of the Oryzias latipes (medakafish) organism, which allows to efficiently perform gene manipulation studies and b) the strong expertise of Research Unit 2 (Prof. Auricchio) in the use of Adeno-Associated Viral (AAV) vectors as effective tools to perform gene delivery studies in the mouse retina. We will select for this analysis about 5-1 mirnas showing the strongest expression levels in the mouse eye, and we will specifically perform either inactivation or overexpression studies in vivo in the medakafish embryos. Among the candidate mirnas to be tested, we can mention mir-124, mir-182, mir-183, mir-96, mir-181a, and mir-24. For the latter mirna, we already generated some data concerning its role in basic processes of eye development (3). We will carry out, in collaboration with Prof. Franco, Research Unit 2, the following functional characterization using the medakafish model system for the selected mirnas: a) We will first assess the conservation in medaka of the selected mrnas by sequence comparison (genome is accessible at We will also validate the conservation of the selected mirnas at the expression level, i.e., by RNA in situ hybridization (ISH). b) Loss-of-function approaches. We will inject mirna-specific multi-blocking morpholinos (Gene Tools LLC) along with the appropriate controls, at the one-cell stage. Morpholino oligonucleotides are very stable and can exert their inhibitory effects even at late stages of fish pre-hatching development, i.e., when the retina is completely formed and functional c) Gain-of-function approaches. We will mostly rely on the injection of mirna duplexes (mirna mimics) in medaka embryos, We will carry out a careful analysis of the retinal phenotypic consequences of mirna expression perturbation in the above-described models. The standard analysis will include morphological inspection and histological analysis of the retina at the main stages of eye development in medaka, i.e., stage(st)24, st3, st34, st38 and post-hatching larvae to detect possible abnormalities in retinal cell organization. The effect of these manipulations will be determined also at the molecular level by RNA ISH, immunofluorescence and immunohistochemistry and analysis of cell proliferation (BrdU incorporation analysis and phh3), and cell death (TUNEL staining). In addition, we will search for possible visual deficits in injected animals using standard behavioral tests, such as the visual motor response test (based on the capacity of fish to modify the extent of their motor activity based on the amount of light present in the environment) (39) and the optokinetic response assay, which measures eye movements in response to moving objects across the visual field (4). Based on the results of the above studies, we expect to identify mirnas that may not only represent key players in the control of the molecular pathways underlying eye function but could also be tested as putative therapeutic tools for retinal pathological processes, and in particular for retinal degeneration (RD) processes. However, to verify these hypotheses, we will need to test their function in vivo in mammalian systems, and in particular in the mouse retina. As previously mentioned, we will carry out this work on one or two selected mirnas by using an AAV-mediated gene delivery approaches in the murine retina in collaboration with Prof. Auricchio (Research Unit 2). More in detail, we will inject in the sub-retinal space of postnatal mice AAV constructs for either overexpression or silencing of the selected mirnas. To generate such constructs, we will preferentially use the AAV2/8 serotype that is currently considered the most efficient AAV delivery vehicle for photoreceptor gene transfer (41, 42). For mirna overexpression, we will use AAV constructs expressing the mirna of interest (a PCR-generated genomic fragment spanning the precursor mirna sequence) under the control of either a constitutive or a retinal cell-type specific promoter (e.g., the Rhodopsin or the Rhodopsin kinase promoters in the case of photoreceptors (41)). For mirna silencing, we will use AAV constructs expressing short-hairpin (sh)rna constructs that specifically recognize the loop region of the respective mirna precursor and bearing appropriate polymerase III promoters, such as H1 or U6 (43). We will inject the mirna constructs in one eye of the animals along with a similar construct expressing the EGFP (enhanced green fluorescent protein) reporter in order to assess the efficiency and the distribution of transduction, as we previously reported (44). The contralateral eye will be injected only with the EGFP-expressing construct as control. We will carry out these studies on both wild-type and retinal degeneration mouse models available in the laboratory of Prof. Auricchio (Research Unit 2). The latter include two autosomal recessive mouse models, i.e., Rd1, which is caused by a mutation in the Pde6b gene (45), and the mouse knockout for the Aipl1 gene (46). We will inject the constructs before the onset or in the first stages of photoreceptor degeneration and therefore we will select the P16 stage for the Rd1 mice and the P4 stage for the Aipl1-/- mice. We will assess the effects of expression perturbation of the injected mirnas at the morphological, molecular and functional level. We will carry out, starting two weeks after the injections, electroretinographic (ERG) analysis to identify possible variations of the visual function along with histological examination of the injected eyes to detect possible changes in retinal cell organization. In particular, we will focus our attention on the evaluation of the progression of degeneration in the case of injected RD models. We will count the number of retained rows of photoreceptor nuclei, which is used as a general assessment of degeneration progression in the mouse retina. We expect to obtain from this part of the project a more detailed knowledge on the role of selected mirnas in retinal function in vertebrates as well as a first insight into their possible use as therapeutic agents in retinal degeneration processes Descrizione delle attrezzature già disponibili ed utilizzabili per la ricerca proposta nº anno di acquisizione Descrizione Sequenziatore 313xl (AppliedByosystems, ABI) (procedura di sequenziamento con il metodo Sanger) Accesso al Sequenziatore Hyseq 1 Illumina per le procedure di sequenziamento bastae su NGS. Tale accesso e' garantito tramite convenzione con la Fondazione Telethon (vedere sezione 8). nº anno di acquisizione Descrizione xl DNA sequencer (AppliedByosystems, ABI) (Sanger sequencing procedure).

10 Access to the Hyseq 1 sequencing platform (Illumina) for the NGS-based sequencing procedures. Such an access is granted through an agreement with the Telethon Foundation (see Section 8) Elenco dei partecipanti all'unità di Ricerca 14.1 Personale dipendente dall'ateneo/ente cui afferisce l'unità di ricerca 14.1.a - Docenti / ricercatori / tecnologi nº Cognome Nome Qualifica costo annuo lordo (a) mesi/persona previsti (b) costo attribuito al progetto ((a/12)*b) 1. BANFI Sandro Ricercatore non confermato , TOTALE , b - Altro personale tecnico nº Cognome Nome Qualifica costo annuo lordo (a) mesi/persona previsti (b) costo attribuito al progetto ((a/12)*b) TOTALE 14.2 Personale dipendente da altri Atenei/Enti 14.2.a - Docenti / ricercatori / tecnologi Nessuno 14.2.b - Altro personale tecnico nº Cognome Nome Università/Ente Qualifica costo annuo lordo (a) mesi/persona previsti (b) costo attribuito al progetto ((a/12)*b) TOTALE 14.3 Personale non dipendente già presente presso l'ateneo/ente cui afferisce l'unità di Ricerca alla data di presentazione del progetto (da inserire a costo zero): nº Cognome Nome Università/Ente Tipologia costo annuo lordo (a) mesi/persona previsti (b) costo attribuito al progetto ((a/12)*b) 1. BUONAIUTO Marianna Seconda Università degli Studi di NAPOLI Dottorando SAIDE Assunta Seconda Università degli Studi di NAPOLI Dottorando 18 TOTALE Personale dipendente e non dipendente da destinare a questo specifico Progetto: Nessuno

11 14.5 Personale di Enti/Istituzioni straniere nº Cognome Nome Qualifica (Università/Ente) Dipartimento/Istituto 15 - Mesi persona complessivi dedicati al Progetto Mesi/Persona 15.1 Personale dipendente dall'ateneo/ente cui afferisce l'unità di ricerca a) docenti / 3,39 ricercatori / tecnologi b) altro personale tecnico 15.2 Personale dipendente da altri Atenei/Enti a) docenti / ricercatori / tecnologi b) altro personale tecnico 15.3 Personale non dipendente già presente presso l'ateneo/ente cui afferisce l'unità di ricerca alla a) assegnisti data di presentazione del progetto (da inserire a costo zero) b) dottorandi 36 c) professori a contratto d) co.co.co (solo per EPR) 15.4 Personale dipendente o non dipendente da destinare a questo specifico Progetto a) assegnisti b) ricercatori a tempo determinato c) dottorandi d) co.co.co. TOTALE 66, Costo complessivo dell'unità di Ricerca Voce di spesa A - Spese di personale (cofinanziamento ateneo/ente; punti 14.1 (A.1) (A.2); non superiore al 3% del costo del progetto) A - Spese di personale non dipendente da destinare a questo specifico progetto - punto 14.4 (A.4) B - Spese generali (quota forfettaria pari al 6% del costo totale del personale, spesa A) C - Attrezzature, strumentazioni e prodotti software D - Servizi di consulenza e simili E - Altri costi di Spesa in Euro Descrizione dettagliata (in italiano) Costo necessario a coprire il salario del responsabile di Unita' Operativa Descrizione dettagliata (in inglese) Cost of the salary of the Principal Investigator of the Research Unit Spese generali (quota forfettaria pari al 6% del costo totale del personale, spesa A) Costi per materiali di consumo: a) reagenti di biologia molecolare tra cui kit per Next Generation Sequencing (necessari per circa 6 Cost for general supplies: a) molecular biology reagents including kits for Next Generation Sequencing (necessary for

12 esercizio reazioni di sequenziamento esomico nel corso dell'intero del progetto), reagenti per sequenziamento con metodo Sanger (validazioni), kit per preparazione di RNA, oligonucleotidi morfolino per esperimenti di inattivazione di mirna in medaka, mirna mimic per esperimenti di sovraespressione di mirna in medaka, kit per trascrizione in vitro di templati e acquisizione di sonde con aggiunta di gruppi LNA per esperimenti di ibridazione in situ a RNA, Taq and nucleotide per reazioni di PCR, enzimi di restrizione; b) plastica di laboratorio; c) reagenti chimici e per elettroforesi; d) generazione di costrutti AAV per gli esperimenti di analisi funzionale di 1 o 2 mirna nella retina murina. about 6 whole exome sequencing in the course of the entire project), Sanger sequencing (for validation of NGS findings), kits for RNA preparation, morpholino oligonucleotides for mirna inactivation studies in medaka, mirna mimics for mirna overexpression studies in medaka, kits for in vitro transcription of templates for RNA ISH experiments, LNA-modified DNA oligonucleotide probes for RNA ISH on mirna, Taq and nucleotides for PCR reactions, restriction enzymes; b) laboratory plasticware; c) fine chemicals and electrophoresis reagents; d) generation of AAV constructs for the functional analysis of 1 or 2 selected mirna in the mouse retina. Costo 28. Complessivo dell'unità di Ricerca Finanziamento 196. MIUR Costo a carico 84. Ateneo / Ente N.B. - I costi relativi al personale dipendente già operante presso gli atenei e gli enti di ricerca alla data di scadenza del presente bando non possono superare il 3% del costo del progetto. I dati contenuti nella domanda di finanziamento sono trattati esclusivamente per lo svolgimento delle funzioni istituzionali del MIUR. Incaricato del trattamento è il CINECA- Dipartimento Servizi per il MIUR. La consultazione è altresì riservata agli atenei e agli enti di ricerca (ciascuno per le parti di propria competenza), al MIUR - D.G. per il Coordinamento e lo Sviluppo della Ricerca - Ufficio V, al CNGR e ai CdS. Il MIUR potrà anche procedere alla diffusione dei principali dati economici e scientifici relativi ai progetti finanziati. Firma Data (dal sistema alla chiusura della domanda)

13 Curricula scientifici dei componenti il gruppo di ricerca 1. BUONAIUTO Marianna Curriculum: pubblicazioni non disponibili 2. SAIDE Assunta Curriculum: Informazioni personali: Nome Indirizzo SAIDE Assunta VIA UMBRIA, NAPOLI (NA) Telefono Cittadinanza saide@tigem.it ITALIANA Data di nascita 4/11/1985 Titoli di studio: Data di conseguimento 29/1/21 Titolo conseguito Laurea specialistica/magistrale Voto conseguito 11/11 Classe di laurea 9/S Classe delle lauree specialistiche in biotecnologie mediche,veterinare e farmaceutiche. Nome e indirizzo Istituzione Universita` degli Studi di NAPOLI "Federico II"-C.so Umberto I,4-Napoli Esperienze: Periodo Posizione 1/3/211- oggi Dottorando Nome e indirizzo Istituzione Seconda Universita degli Studi di NAPOLI - Viale A. Beneduce, 1 - CASERTA Titolo dottorato GENETICA MEDICA Elenco dei prodotti della ricerca de Pablo-Latorre R, Saide A, Polishchuk, E., Nusco E, Fraldi A. and Ballabio A. Impaired parkin-mediated mitochondrial targeting to autophagosomes differentially contributes to tissue pathology in lysosomal storage disorders Hum Mol Genet. 212 Jan 3. [Epub ahead of print] Pubblicazioni: de Pablo-Latorre R, SAIDE A., Polishhuck EV, Nusco E, Fraldi A, Ballabio A. (212). Impaired parkin-mediated mitochondrial targeting to autophagosomes differentially contributes to tissue pathology in lysosomal storage diseases. HUMAN MOLECULAR GENETICS, ISSN: BUONAIUTO Marianna Curriculum: pubblicazioni non disponibili 2. SAIDE Assunta Curriculum: Pubblicazioni: de Pablo-Latorre R, SAIDE A., Polishhuck EV, Nusco E, Fraldi A, Ballabio A. (212). Impaired parkin-mediated mitochondrial targeting to autophagosomes differentially contributes to tissue pathology in lysosomal storage diseases. HUMAN MOLECULAR GENETICS, ISSN: