BANDI DI RICERCA ED INTERNAZIONALIZZAZIONE DELLA SOCIETA ITALIANA DI NEFROLOGIA (Expression of interest) SEZIONE 1
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1 BANDI DI RICERCA ED INTERNAZIONALIZZAZIONE DELLA SOCIETA ITALIANA DI NEFROLOGIA (Expression of interest) SEZIONE RICERCATORE DEL PROPONENTE Nome: Ariela Cognome: Benigni Nata a: Bergamo il: 16/12/ abenigni@marionegri.it Tel: ISTITUZIONE PROPONENTE (Gruppo di Studio di Immunopatologia) Istituzione: Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri Laboratori Negri Bergamo Via Gavazzeni, Bergamo Unità Operative: Unità di Terapia Genica e Laboratorio di Biofisica Renale 1.3. AREA TEMATICA Nefrologia 1.4. TITOLO DELLA PROPOSTA Titolo: Meccanismi di regolazione genica attraverso mirna nella progressione della malattia renale: effetto degli ACE inibitori. Running Title: MicroRNA e progressione della malattia renale 1.5. TIPO DI STUDIO Sperimentale traslazionale 1.6. STIMA DELLA DURATA DELLO STUDIO 3 anni 1.7. POPOLAZIONE IN STUDIO Ratti maschi Munich Wistar Fromter (MWF), ceppo che sviluppa spontaneamente danno glomerulare e ratti maschi Wistar (controllo) 1.8. VALUTAZIONE DEGLI ESITI Identificazione di microrna differenzialmente espressi nel rene di ratti MWF durante lo sviluppo della malattia renale. Identificazione dei geni target mediante in silico analisi e dei pathways di attivazione coinvolti. Modulazione dei mirna indotta da ACE inibitori e identificazione dei geni/pathways responsabili dell effetto renoprotettivo. 1
2 SEZIONE BACKGROUND I microrna (mirna) sono un gruppo di piccole molecole di RNA non codificanti conservate lungo la scala evolutiva, che regolano l espressione di geni inibendo la trascrizione di RNA messaggero in proteine o favorendo la degradazione dell RNA messaggero di specifici geni. I mirna sono formati a partire dal trascritto primario del locus genomico (pri-mirna) tagliato dall enzima Drosha in precursore immaturo (pre-mirna), che viene esportato nel citoplasma grazie alla esportina 5, proteina localizzata sulla membrana nucleare. Nel citoplasma il pre-mirna viene ulteriormente processato dall enzima Dicer che crea molecole lunghe nucleotidi, i mirna. L elica senso viene degradata mentre l antisenso o elica guida si lega al complesso proteico RISC e lo guida verso l RNA messaggero target determinando un blocco della sua traduzione. Centinaia di mirna sono già stati identificati nel genoma umano e si è ipotizzato che regolino almeno il 30% degli mrna. Poichè l appaiamento tra il mirna e il suo sito di riconoscimento è solo parziale, ciascun mirna può avere molti target. Identificare e quantificare l espressione dei mirna in diversi tessuti in condizioni fisiologiche e patologiche rappresenta il primo passo per capirne la funzione. Il confronto del profilo di espressione dei mirna in un determinato tessuto in condizioni patologiche e fisiologiche permette di identificare potenziali marcatori di malattia. Numerosi studi hanno dimostrato un coinvolgimento dei mirna in numerosi processi biologici quali lo sviluppo, la proliferazione cellulare e l apoptosi ma anche in condizioni patologiche quali le malattie cardiovascolari e tumori. Non ci sono studi riguardo ai cambiamenti trascrizionali nella malattia renale progressiva e se eventuali cambiamenti nell espressione genica siano legati a mirna. I ratti Munich Wistar Fromter (MWF) rappresentano un modello di danno glomerulare spontaneo, geneticamente determinato, caratterizzato da un elevato numero di glomeruli superficiali, ridotto numero di nefroni, ipertrofia glomerulare ed elevata escrezione urinaria di proteine, specialmente albumina, rispetto ad altri ceppi. I ratti maschi MWF sviluppano con l età ipertensione, massiva proteinuria e sclerosi glomerulare. La progressiva perdita del numero di podociti con l avanzare dell età contribuisce al difetto di selettività della membrana glomerulare ed ha un ruolo importante nella progressione della nefropatia. Questi animali sono particolarmente sensibili agli inibitori dell enzima di conversione dell angiotensina (ACE) che, se somministrati in giovane età, prevengono lo sviluppo di proteinuria ed il danno renale. In ratti MWF con nefrectomia unilaterale gli ACE inibitori aumentano la sopravvivenza degli animali. Recentemente abbiamo dimostrato che questi farmaci hanno un effetto terapeutico importante in animali con nefropatia avanzata; non solo inducono regressione delle lesioni glomerulari, ma sono anche in grado di rigenerare la matassa del capillare glomerulare. Scopo del presente studio è di identificare mirna associati alla progressione della malattia renale per indagare geni e meccanismi molecolari che predispongano al danno renale e di valutare se l effetto renoprotettivo degli ACE inibitori correli con la modulazione di mirna e di geni/meccanismi molecolari ad essi associati in animali geneticamente programmati a sviluppare danno renale OBIETTIVI Obiettivo primario - Identificazione di mirna differenzialmente espressi durante la progressione della malattia renale in ratti MWF rispetto ad animali di controllo - Valutazione della modulazione dei mirna indotta da ACE inibitori e identificazione dei geni/meccanismi molecolari responsabili dell effetto renoprotettivo. 2
3 Obiettivi secondari - Identificazione dei possibili geni target di mirna modulati nella malattia mediante in silico analisi. - Identificazione delle popolazioni cellulari glomerulari che esprimono i mirna. - Utilizzo di antagomir specifici in vivo DISEGNO DELLO STUDIO Obiettivo primario In questo progetto verranno utilizzati ratti maschi del ceppo MWF, che spontaneamente sviluppa malattia renale progressiva e ratti Wistar (controlli). Tre gruppi di animali verranno studiati: Gruppo 1: ratti MWF non trattati Gruppo 2: ratti MWF trattati con ACE inibitore ( 80mg/L) dalla 40 alla 60 settimana Gruppo 3: ratti Wistar Gli animali MWF verranno seguiti durante l evoluzione della malattia e sacrificati a vari tempi, prima della comparsa della proteinuria e della glomerulosclerosi e quando la malattia è severa. La severità della malattia verrà valutata attraverso la misura della proteinuria e della creatinina nel siero. Animali del gruppo di controllo selezionati per età saranno sacrificati in parallelo. Al sacrificio si procederà con la valutazione del profilo di espressione dei mirna. A tale scopo, sezioni di rene verranno utilizzate per microdissettare i glomeruli con la tecnica della laser capture. I glomeruli verranno lisati e sottoposti direttamente alla reazione di trascrizione inversa. Successivamente verrà eseguita la valutazione quantitativa dei mirna maturi presenti nei vari campioni mediante real-time PCR utilizzando il sistema TaqMan MicroRNA Array (Applied Biosystem). La stessa procedura verrà eseguita su campioni di rene ottenuti da ratti controllo del ceppo Wistar. Dal confronto tra i due gruppi sperimentali si otterranno i mirna differenzialmente espressi. Obiettivi secondari Identificati i mirna maggiormente espressi, si procederà con l analisi dei possibili RNA messaggeri target utilizzando software attualmente disponibili (miranda, TargetScan, PicTar, rna22). Lo stesso tipo di analisi condotta per l end-point primario verrà condotta su gruppi di ratti sacrificati a diversi tempi sperimentali allo scopo di capire se la modulazione del/i mirna identificati è parallela all aumento della glomerulosclerosi e, infine, se il trattamento con ACE inibitore può riportare la produzione di mirna a livelli misurati nei ratti Wistar. Per identificare quali cellule del glomerulo esprimono i mirna, verranno eseguiti esperimenti di ibridazione in situ su sezioni di rene provenienti dai vari gruppi sperimentali utilizzando una sonda specifica per ciascuno dei mirna identificati. Per confermare il diretto coinvolgimento del/i mirna nel processo di sviluppo della glomerulosclerosi, un nuovo gruppo di animali verrà trattato con somministrazioni ripetute nel tempo di antagomir specifico per il singolo microrna. Gli animali verranno monitorati nel tempo per i parametri di funzionalità renale. 3
4 SEZIONE ENTITA DEL BUDGET PREVISTO Euro CURRICULUM VITAE Ariela Benigni è nata a Bergamo nel Si è laureata in Scienze Biologiche con pieni voti all'università degli Studi di Milano nel Dopo un'iniziale esperienza all'istituto Mario Negri di Milano, ha iniziato a collaborare con il gruppo del nefrologo Giuseppe Remuzzi presso gli Ospedali Riuniti di Bergamo nel Nel 1981 si è trasferita in Francia per un training post-laurea supportato dalla Comunità Economica Europea presso il Centre Regional de Transfusion Sanguigne de Strasbourg. Dal 1983 è ricercatrice dell'istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri di Bergamo, presso il quale dal 2000 svolge la funzione di Capo Dipartimento di Medicina Molecolare. Dal 1991 è Segretario Scientifico del Negri Bergamo e del Centro di Ricerche Cliniche per le Malattie Rare "Aldo e Cele Daccò" dell'istituto Mario Negri. Nel 2001 ha conseguito il dottorato di ricerca (Ph.D.) presso l'università di Maastricht - Academisch Ziekenhuis Maastricht. Collabora con l Organizzazione Mondiale della Sanità per un progetto multicentrico internazionale sui fattori angiogenici come causa di pre-eclampsia. È stata nel Senior Fellow in Obstetric Medicine presso l Università di Oxford, Nuffield Department of Obstetrics & Gynaecology. Dal 1996 al 1998 è stata Associate Editor del Journal of Nephrology. Dal 2003 al 2005 è Associate Editor della rivista Kidney International. L'interesse di ricerca riguarda i meccanismi di danno che portano alla perdita di funzionalità del rene nelle malattie renali progressive. L'attività scientifica si estende anche a ricerche nel campo del rigetto del trapianto e della terapia genica come strategia per prevenire il rigetto acuto del trapianto di organo solidi. Il suo impegno è rivolto anche al campo delle malattie rare, per una buona parte di origine genetica, con l'obiettivo di correggere anomalie genetiche con il trasferimento genico. La dottoressa Benigni ha tenuto numerose lezioni su invito a Congressi nazionali e internazionali ed è autrice di 185 pubblicazioni su riviste internazionali. Pubblicazioni: - A. Benigni, D. Corna, C. Zoja, A. Sonzogni, R. Latini, M. Salio, S. Conti, D. Rottoli, L. Longaretti, P. Cassis, M. Morigi, T.M. Coffman, G. Remuzzi. Disruption of the Ang II type 1 receptor promotes longevità in mice. J Clin Invest 2009 (In press) - N. Perico, A. Benigni, G. Remuzzi. Present and future drug treatments for chronic kidney diseases: evolving targets in renoprotection. Nature Reviews Drug Discovery 2008;7: M.H. de Borst, A. Benigni, G. Remuzzi. Primer: strategies for identifying genes involved in renal disease. Nat Clin Pract Nephrol 2008;4: A. Benigni, C. Caroli, L. Longaretti, E. Gagliardini, C. Zoja, M. Galbusera, D. Moioli, P. Romagnani, A. Tincani, L. Andreoli, G. Remuzzi. Involvement of renal tubular toll-like receptor 9 in the development of tubulointerstitial injury in systemic lupus. Arthritis & Rheum 2007;56: G. Remuzzi, A. Benigni, A. Remuzzi. Mechanisms of progression and regression of renal lesions of chronic nephropathies and diabetes. J Clin Invest 2006;116: A. Benigni, C. Zoja, S. Tomasoni, M. Campana, D. Corna, C. Zanchi, E. Gagliardini, E. Garofano, D. Rottoli, T. Ito, G. Remuzzi. Transcriptional regulation of nephrin gene by 4
5 peroxisome proliferators-activated receptor-γ agonist: molecular mechanism of the antiproteinuric effect of pioglitazone. J Am Soc Nephrol 2006;17: A. Remuzzi, E. Gagliardini, F. Sangalli, M. Bonomelli, M. Piccinelli, A. Benigni, G. Remuzzi. ACE inhibition reduced glomerulosclerosis and regenerates glomerular tissue in a model of progressive renal disease. Kidney Int 2006;69: M. Morigi, S. Buelli, S. Angioletti, C. Zanchi, L. Longaretti, C. Zoja, M. Galbusera, S. Gastoldi, P. Mundel, G. Remuzzi, A. Benigni. In response to protein load podocytes reorganize cytoskeleton and modulate endothelin-1 gene: implication for permselective dysfunction of chronic nephropathies. Am J Pathol 2005;166: A. Benigni, D. Corna, C. Zoja, L. Longaretti, E. Gagliardini, N. Perico, T.M. Coffman, G. Remuzzi. Targeted deletion of angiotensin II type 1A receptor does not protect mice from progressive nephropathy of overload proteinuria. J Am Soc Nephrol 2004;15: A. Benigni, E. Gagliardini, G. Remuzzi. Changes in Glomerular Perm-Selectivity Induced by Angiotensin II Imply Podocyte Dysfunction and Slit Diaphragm Protein Rearrangement. Sem Nephrol 2004;24: DICHIARAZIONE DI EVENTUALE CONFLITTO DI INTERESSE No 3.4. ELENCO DELLE POSSIBILI UNITA E RICERCATORI COINVOLTI Prof.ssa Paola Romagnani Excellence Center for Research, Transfer and High Education DENOthe (De Novo Therapies), Università di Firenze, V. le Morgagni 85, 50134, Firenze, Italia. 5
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