CARATTERIZZAZIONE DI DUE ANTICORPI MONOCLONALI UMANI CROSS-NEUTRALIZZANTI DIRETTI CONTRO LA GLICOPROTEINA E2 DEL VIRUS DELL EPATITE C

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1 UNIVERSITA POLITECNICA DELLE MARCHE FACOLTA DI MEDICINA E CHIRURGIA Dottorato di Ricerca in Patologie Immunometaboliche, degenerative e infettive CARATTERIZZAZIONE DI DUE ANTICORPI MONOCLONALI UMANI CROSS-NEUTRALIZZANTI DIRETTI CONTRO LA GLICOPROTEINA E2 DEL VIRUS DELL EPATITE C Coordinatore: Prof. Pietro E. Varaldo Tutor: Prof.ssa Patrizia Bagnarelli Tesi di Dottorato di: ROBERTA ANTONIA DIOTTI Anno Accademico

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3 Per la mia famiglia

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5 CONSULTAZIONE TESI DI LAUREA La sottoscritta ROBERTA ANTONIA DIOTTI nata a TREVIGLIO (BG) il 11/10/1982 autore della tesi dal titolo CARATTERIZZAZIONE DI DUE ANTICORPI MONOCLONALI UMANI CROSS-NEUTRALIZZANTI DIRETTI CONTRO LA GLICOPROTEINA E2 DEL VIRUS DELL EPATITE C NON AUTORIZZA la consultazione della tesi stessa. Data... Firma

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7 UNIVERSITA' POLITECNICA DELLE MARCHE Facoltà di Medicina e Chirurgia Dottorato di Ricerca in Patologie Immunometaboliche, degenerative e infettive Tesi di Laurea di: Roberta Antonia Diotti Coordinatore: Prof. Pietro E. Varaldo Tutor: Prof.ssa Patrizia Bagnarelli CARATTERIZZAZIONE DI DUE ANTICORPI MONOCLONALI UMANI CROSS-NEUTRALIZZANTI DIRETTI CONTRO LA GLICOPROTEINA E2 DEL VIRUS DELL EPATITE C Nell 80% dei casi di infezione, il virus dell epatite C (HCV) supera le difese dell ospite e stabilisce un infezione persistente, che espone il paziente al rischio di sviluppare cirrosi e epatocarcinoma. La terapia basata su ribavirina e interferone è costosa, poco efficace e gravata da effetti collaterali. Nonostante la grande variabilità genetica del virus, concentrata soprattutto a livello delle glicoproteine E1E2 dell envelope, sono state descritte alcune regioni di E2 conservate tra i diversi genotipi, suggerendo che la scarsa variabilità di tali regioni è necessaria per mantenere alcune funzioni cruciali della glicoproteina nel ciclo virale. Pertanto l identificazione e la caratterizzazione di anticorpi diretti contro queste porzioni conservate di E2 potrebbe fornire un contributo per lo sviluppo di una valida immunoterapia passiva e per la realizzazione di un vaccino efficace. In questa tesi sono stati caratterizzati due frammenti anticorpali monoclonali umani (Fab e20 e Fab e137) diretti contro la glicoproteina E2. e20 ed e137 sono stati clonati dal repertorio linfocitario di una paziente infetta in modo cronico da HCV genotipo 1b. Per selezionare dei cloni potenzialmente cross-reattivi, la library anticorpale ottenuta dalla paziente è stata screenata contro una glicoproteina E2 ricombinante derivata da un sottotipo diverso: 1a. Tramite studi di binding, e20 ed e137 sono risultati in grado di legare E2 di tutti i genotipi (tranne il genotipo 5 per il Fab e137). Esperimenti condotti con peptidi lineari, saggi di competizione con anticorpi diretti contro epitopi noti e la generazione di mutanti sito-specifici di E2 hanno dimostrato che e20 ed e137 sono diretti contro un epitopo conformazionale. In particolar modo, l epitopo del Fab e20

8 coinvolge i residui aminoacidici: W437, F442, W529, G530 e D535; mentre quello del Fab e137 coinvolge: T416, W420, W437, L438, L441, F442, W529, G530 e D535. I residui W529, G530, D535 risultano essere conservati fra i vari genotipi e coinvolti nel legame di E2 al CD81. Saggi di competizione fra il Fab e20 o il Fab e137 e CD81 confermano che i Fab sono diretti contro una regione di E2 importante per il legame del virus al recettore cellulare. Si è osservato che i Fab riconoscono dei residui contenuti della porzione della glicoproteina E2 che va dall aminoacido 436 al 447, regione descritta in letteratura come quella riconosciuta dagli anticorpi non neutralizzati in grado di interferire con l attività dei cloni neutralizzanti. I nostri dati sembrerebbero contrastare questa affermazione, infatti i Fab e20 ed e137 non solo sono in grado di riconoscere alcuni residui contenuti in questa regione, ma possiedono anche un attività neutralizzante rilevante. Inoltre il legame del Fab e137 viene abrogato anche da due mutazioni a livello dell epitopo riconosciuto dall anticorpo murino AP33, descritto in letteratura come il clone con un ampia cross-reattività ed un elevata attività neutralizzante. I Fab e20 ed e137 possiedono una potente attività cross-neutralizzante. Nel saggio di neutralizzazione con pseudovirus, e20 ed e137 neutralizzano i genotipi 1a, 2a e 4 (IC 50 intorno ai 7 µg/ml) e meno efficientemente i genotipi 1b e 2b. L attività neutralizzante è stata confermata in un saggio di neutralizzazione basato sull uso di un particolare isolato virale in grado di replicare in vitro (IC 50 intorno ai 2 µg/ml). Grazie agli studi di cinetica di neutralizzazione è emersa la capacità dei Fab e20 ed e137 di inibire l infettività virale agendo dopo il binding del virus alle cellule bersaglio; in particolare interferiscono con gli eventi immediatamente successivi al legame tra virus e recettori a bassa affinità. Analizzando questi dati, possiamo concludere che abbiamo identificato e caratterizzato due frammenti anticorpali con un ampia cross-reattività ed una potente attività cross-neutralizzante, in quanto sono in grado di legare dei residui aminoacidici sulla glicoproteina E2 che svolgono un ruolo chiave nel ciclo virale e che risultano essere conservati tra i vari genotipi. Per cui questi Fab risultano essere fondamentali per lo sviluppo di una immunoterapia passiva efficace e per lo studio dell interazione virusospite.

9 UNIVERSITA' POLITECNICA DELLE MARCHE Facoltà di Medicina e Chirurgia Dottorato di Ricerca in Patologie Immunometaboliche, degenerative e infettive Tesi di Dottorato di: Roberta Antonia Diotti Coordinatore: Prof. Pietro E. Varaldo Tutor: Prof.ssa Patrizia Bagnarelli CHARACTERIZATION OF TWO HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES CROSS-NEUTRALIZING DIRECTED AGAINST THE E2 ENVELOPE GLYCOPROTEIN OF HEPATITIS C VIRUS In approximately 80% of the cases of infection, hepatitis C virus (HCV) overcomes the host immune response, leading to a chronic infection associated with an increased risk of severe liver diseases. Current therapy (ribavirin and interferon) is expensive, can have adverse side effects and is ineffective for approximately 50% of patients. Despite the genetic variability of the virus at the level of E1E2 envelope glycoproteins, some regions conserved among different E2 genotypes have been described, suggesting that no variability at this level is required to maintain critical functions of the glycoprotein in the life cycle of the virus. Therefore, the identification and characterization of antibodies directed against these regions can theoretically provide a valuable contribution to the creation of an effective vaccine and to the development of passive immunotherapy. In this thesis, two human monoclonal antibody fragments (Fab e20 and Fab e137) directed against the HCV E2 glycoprotein, have been characterized. The antibodies were cloned from lymphocytes of a patient chronically infected with HCV genotype 1b. In order to select cross-reactive clones, the library obtained from the patient was screened against a recombinant glycoprotein E2 derived from a different subtype: 1a. In binding experiment, e20 and e137 are capable of binding E2 of all genotypes (e137 is not able to bind genotype 5). Several studies with linear peptides representing different portions of E2, competition assays with antibodies directed against known epitopes and the generation of site-specific mutants of E2 showed that e20 and e137 are directed against a conformational epitope. In particular, the epitope of Fab e20 includes the

10 amino acids: W437, F442, W529, G530 e D535; whereas the epitope of Fab e137 includes the amino acids: T416, W420, W437, L438, L441, F442, W529, G530 e D535. The residues W529, G530, D535 are conserved between different genotypes and involved in the binding of E2 to CD81. Additional tests of competition, between e20 or e137 and CD81, confirmed that the Fabs are directed against a region of E2 important for the binding of virus to cellular receptor. Fab e20 and e137 are able to recognize amino acids within the region , that is described to bind unneutralizing antibodies, that interfere with the neutralizing antibodies. Furthermore, the data highlight that the epitope of e137 includes two conserved residues (aa 416 and 420) that were described to be within the epitope recognized by mouse monoclonal antibody AP33. The Fab e20 and Fab e137 have a potent cross-neutralizing activity. In the neutralization assay with pseudovirus e20 and e137 neutralize genotypes 1a, 2a and 4 (IC 50 approximately 7 µg/ml) and less efficiently genotypes 1b and 2b. The neutralizing activity was also confirmed in a different neutralization assay based on a particular virus isolate that can replicate in vitro (IC 50 approximately 2 µg/ml). Finally, the kinetic of neutralization study has shown the ability of the Fab e20 and Fab e137 to inhibit viral infectivity by acting after viral binding to target cells, in particular they are capable of interfering with the events immediately after the binding between virus and low affinity receptor. The data highlight that we identified and characterized two different broadly crossreacting and neutralizing human monoclonal antibody fragments direct against highly conserved residues of E2 glycoprotein, that are crucial for CD81 binding and HCVpp infectivity. Overall, the availability of cross-reactive monoclonal antibodies with strong neutralizing activity (i) allows a better understanding of the virus-host interplay, (ii) provides new opportunities to develop antigens potentially able to elicit a broadly neutralizing immune response, and (iii) may assist in the development of an effective passive immunotherapy for HCV infection.

11 SOMMARIO 1. INTRODUZIONE Il virus dell epatite C (HCV) Il ciclo replicativo di HCV Variabilità genetica di HCV Storia naturale dell epatite C Epidemiologia dell epatite C Diagnostica dell infezione da HCV Trattamento farmacologico dell epatite C Modelli in vitro utilizzati per lo studio di HCV La risposta immunologica nei confronti delle infezioni virali Gli anticorpi: struttura e funzione La risposta immunitaria nei confronti del virus dell epatite C Razionale dello studio MATERIALI E METODI Costruzione della library anticorpale Panning della library anticorpale fagica Produzione dei Fab e20 ed e Purificazione dei Fab e20 ed e Titolazione e calcolo dell affinità dei Fab e20 ed e137 mediante ELISA Valutazione del legame dei Fab e20 ed e137 sulla glicoproteina E2 derivante dai diversi genotipi di HCV Determinazione dell epitopo riconosciuto dai Fab e20 ed e Valutazione della capacità dei Fab e20 ed e137 di inibire il legame fra il recettore CD81 e la glicoproteina E Valutazione dell attività biologica dei Fab e20 ed e Saggio di cinetica di neutralizzazione dei Fab e20 ed e RISULTATI Panning della library su HCV/E

12 3.2 Analisi di sequenza dei Fab e20 ed e Valutazione della cross-reattività dei Fab e20 ed e Studio dell affinità dei Fab e20 ed e137 mediante saggio ELISA Definizione dell epitopo riconosciuto dai Fab e20 ed e Valutazione della capacità dei Fab e20 ed e137 di inibire il legame fra il CD81-LEL umano e la glicoproteina E2 ricombinante (genotipo 1a, H77) Valutazione della attività biologica dei Fab e20 ed e Valutazione della cinetica di neutralizzazione dei Fab e20 ed e137 su pseudovirus HCV/MLV esprimenti sulla superficie le glicoproteine E1E2 di genotipo 1a (isolato H77) DISCUSSIONE E CONCLUSIONI BIBLIOGRAFIA

13 1. INTRODUZIONE 1.1 Il virus dell epatite C (HCV) Flaviviridae Il virus dell epatite C (HCV, Hepatitis C virus), agente eziologico dell epatite non A, non B (NANB), (Feinstone et al., 1975), è stato identificato nel 1989 da Choo e colleghi grazie all impiego di tecniche di biologia molecolare. La disponibilità di grandi quantità di plasma di uno scimpanzé infetto con l agente eziologico di un epatite virale NANB, ha permesso di costruire, mediante l impiego del fago λ, una libreria di DNA complementare (cdna), a partire dagli acidi nucleici estratti dal plasma, e di identificare, successivamente, un clone di E. Coli che esprimeva una proteina ricombinante virus-specifica (Choo et al., 1989; Choo et al., 1991). In seguito è stato clonato l intero genoma virale, che attraverso analisi di sequenza, ha permesso di classificare HCV come membro di un distinto genere, chiamato Hepacivirus, all interno della famiglia delle Flaviviridae a cui appartengono anche il genere Flavivirus (virus della febbre gialla, virus della febbre Dengue, virus West Nile e virus dell encefalite giapponese), il genere Pestivirus (virus della diarrea virale bovina e virus della febbre classica suina) e i virus non classificati: il GB virus A (GBV-A), il GB virus B (GBV- B) e il GB virus C (GBV-C)/virus dell epatite G (HGV) (Figura 1) (Bartenschlager and Lohmann, 2000; Murphy, 1995). Il virus dell epatite C presenta un organizzazione genomica e un profilo di idrofobicità della poliproteina da esso codificata che sono simili a quelli dei Pestivirus e dei Flavivirus (Miller and Purcell, 1990). 3

14 Figura 1 Albero filogenetico della famiglia Flaviviridae basato sull analogia della regione dell elicasi NS3. In particolare sono mostrati i membri dei generi Flavivirus (YF: virus della febbre gialla; DEN-1 e DEN-2: Dengue virus 1 e 2; WN: virus West Nile; JE: virus dell encefalite giapponese), Pestivirus (BVDV: virus della diarrea virale bovina; CSFV: virus della febbre classica suina) e alcuni isolati degli Hepacivirus (HCV) e i virus non classificati GBV-A, GBV-B e GBV-C(Fields, 2001) Il virus dell epatite C La particella virale di HCV ha una morfologia sferica e un diametro di circa 55 nm, presenta un envelope, in cui sono inserite le glicoproteine di superficie virali E1 ed E2, che circonda un nucleocapside a simmetria icosaedrica costituito dalla proteina Core la quale racchiude il genoma virale (Figura 2). Figura 2 Particella virale di HCV, la quale presenta una densità di g/ml e una morfologia sferica con un diametro di circa 55 nm (Wakita et al., 2005). 4

15 Ultracentrifugando il siero dei pazienti con epatite C acuta e cronica si rileva la presenza di una popolazione di particelle di HCV eterogenea con una densità che va da 1,03 a 1,34 g/ml (Andre et al., 2005). Le particelle di HCV a bassa densità sono associate principalmente alle lipoproteine e rappresentano il virus infettivo, mentre le particelle di HCV ad alta densità sono associate alle immunoglobuline, sottoforma di immunocomplessi che risultano essere meno infettive (Aiyama et al., 1996; Andre et al., 2002; Dienstag et al., 1979; Thomssen et al., 1993). Solo una piccola popolazione delle particelle sieriche ha proprietà corrispondenti al virione di HCV descritto precedentemente, poi troviamo altre forme del virus: le virolipoparticelle (LVPs) composte da virioni e lipoproteine ricche di trigliceridi, gli exosomi cioè vescicole membranose in cui si rilevano proteine dell envelope virale ed infine troviamo i nucleocapsidi di HCV non ricoperti da envelope (Andre et al., 2002; Diaz et al., 2006; Maillard et al., 2001; Masciopinto et al., 2004; Nielsen et al., 2006; Petit et al., 2005). Il genoma dell HCV è costituito da un singolo filamento di RNA a polarità positiva della lunghezza di circa nucleotidi che presenta alle estremità due regioni non tradotte (UTR, UnTranslated Region) e contiene un unica Open Reading Frame (ORF) che codifica per una poliproteina di circa aminoacidi (Choo et al., 1991; Feinstone and Purcell, 1983; Trestard et al., 1998; Yoshikura et al., 1996). La poliproteina virale è processata sia da proteasi cellulari che virali a formare 10 specifici prodotti genici virali: le proteine strutturali (Core, E1, E2 e p7) collocate nella porzione N-terminale della poliproteina e le proteine non strutturali (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A e NS5B) derivanti dalla rimanente porzione della poliproteina (Grakoui et al., 1993; Penin et al., 2004). Le proteine strutturali sono rilasciate dalla poliproteina dopo il taglio da parte da signal peptidasi presenti nel reticolo endoplasmatico della cellula ospite mentre le proteine non strutturali sono rilasciate dalla poliproteina dopo il clivaggio da parte delle proteasi virali (NS2-3 e NS3-4A) (Figura 3) (Reed and Rice, 2000). 5

16 Figura 3 Struttura del genoma di HCV. (A) Il genoma consiste in un unica ORF che codifica per una poliproteina di circa 3010 aminoacidi, fiancheggiata alle estremità da due sequenze non codificanti. La sequenza 5 -UTR contiene un Internal Ribosome Entry Site (IRES) ed insieme all estremità 3 -UTR è coinvolta nella traduzione dell RNA virale. (B) La poliproteina tradotta è processata da proteasi cellulari e virali. Nell immagine, i numeri al di sotto della poliproteina indicano i residui aminoacidici in cui avviene il clivaggio. (C) Rappresentazione delle risultanti 10 proteine virali: strutturali e non strutturali (Rehermann, 2009) La regione 5 -UTR La regione 5 -UTR di HCV è costituita dai primi 341 nucleotidi del genoma virale ed è una delle regioni più conservate tra i diversi genotipi del virus e tra i diversi generi della famiglia, sia in termini di sequenza nucleotidica sia in termini di struttura secondaria (Bukh et al., 1992; Choo et al., 1991; Han et al., 1991). La struttura di tale regione contiene 4 domini altamente strutturati che formano numerose conformazioni a forcina importanti sia per la traduzione sia per la replicazione del genoma virale (Brown et al., 1992; Wang et al., 1995). 6

17 La regione 3 -UTR A seguito del codone di stop della ORF si trova la regione non tradotta dell estremità 3, lunga 225 nucleotidi. Questa regione è coinvolta nella traduzione e nella replicazione attraverso l interazione con proteine cellulari e sembra essere molto importante per l infettività (Ito and Lai, 1997; Ito and Lai, 1999) La regione Core I primi 191 aminoacidi della poliproteina costituiscono il nucleocapside o Core (p21), che mostra un peso molecolare che va dai 17 ai 23 kda. Le varie isoforme sono dovute alla presenza di diverse forme immature della proteina e la forma maggiormente rappresentata è quella matura di 21 kda (Yasui et al., 1998). La proteina è molto conservata e include molti epitopi che vengono riconosciuti dalla risposta immune specifica (linfociti T e B) (Goeser et al., 1994). Il Core non solo è importante per la formazione del nucleocapside icosaedrico virale, ma è coinvolto anche in differenti processi cellulari quali: il metabolismo lipidico, l apoptosi, la trasformazione e la proliferazione cellulare ed è inoltre implicato nel danno tissutale e nella progressione della fibrosi (Fukutomi et al., 2005; McLauchlan, 2000; Nunez and Soriano, 2004; Suzuki et al., 1995). In particolare, la proteina può fungere da attivatore in trans di alcuni oncogeni cellulari (come ras) e può modulare in vivo l azione di p53 e di p73 nei meccanismi dell apoptosi epatocitaria (Chou et al., 2005; Kountouras et al., 2003; Meyer et al., 2005; Moriya et al., 1997) e questo potrebbe spiegare come un virus, quale HCV, incapace di integrarsi nel genoma cellulare possa essere coinvolto direttamente nell oncogenesi epatica in corso di infezione cronica (Moriya et al., 1998; Smirnova et al., 2006). La proteina del nucleocapside di HCV è composta da tre distinti domini: il dominio idrofilo D1 di 120 aminoacidi all N-terminale, il dominio idrofobico D2 di circa 50 aminoacidi al C-terminale e il peptide segnale (di circa 20 aminoacidi) per la proteina E1 (Grakoui et al., 1993; Harada et al., 1991; Santolini et al., 1994). Il dominio D1 è idrofilico e ricco di aminoacidi basici conservati. In questo dominio sono presenti: tre segnali di localizzazione nucleare, un motivo legante il DNA e un motivo legante l RNA; tutto questo potrebbe suggerire la traslocazione di questa proteina all interno del nucleo, ma non vi sono dati che confermano questa supposizione (Barba et al., 1997; 7

18 Chang et al., 1994; Suzuki et al., 1995; Suzuki et al., 2005). Il dominio D2 è principalmente responsabile dell associazione della proteina virale con alcune membrane cellulari, tra cui: le membrane del reticolo endoplasmatico, la membrana esterna dei mitocondri e le membrane delle vescicole lipidiche (Barba et al., 1997; Nolandt et al., 1997). Alcuni studi hanno evidenziato che nella porzione del dominio D2 (una regione compresa tra gli aminoacidi 82 e 102) è presente una sequenza ricca in triptofano, la quale sembra acconsentire l associazione di più proteine Core p21 e che quindi permetterebbe la formazione del capside virale (Nolandt et al., 1997). Altri studi hanno però dimostrato che l espressione in batteri dei primi 75 aminoacidi della porzione N-terminale (dominio D1) sono sufficienti per la formazione delle particelle nucleocapsidiche (Klein et al., 2005; Majeau et al., 2004). È ancora quindi da chiarire quali siano effettivamente i residui critici per la formazione delle particelle virali La regione F La regione F (dall inglese Frameshift) codifica per la alternate reading frame protein (ARFP) generata in seguito ad uno slittamento ribosomiale di -2/+1 nucleotidi a livello della regione codificante per la porzione N-terminale della proteina Core. ARFP è prodotta durante l infezione, infatti nei pazienti con infezione cronica da HCV sono stati rilevati anticorpi diretti verso questa proteina (Walewski et al., 2001). L esatto meccanismo traduzionale alla base della frequenza di slittamento e della produzione della proteina F durante le diverse fasi dell infezione sono ad oggi completamente ignote (Xu et al., 2003). Il ruolo di ARFP non è noto, si pensa che possa essere coinvolta nei meccanismi di persistenza del virus (Baril and Brakier-Gingras, 2005) Glicoproteine di superficie E1 ed E2 Il genoma di HCV codifica per le due glicoproteine dell envelope, denominate E1 ed E2, rispettivamente di e kda (Deleersnyder et al., 1997). Esse sono componenti essenziali dell envelope e sono necessarie per le prime fasi del ciclo virale (Bartosch et al., 2003c). Per lungo tempo non è stato possibile caratterizzare tali proteine a causa della mancanza di un sistema efficiente di coltura cellulare per la replicazione e 8

19 l assemblaggio delle particelle virali. Sistemi di espressione transiente hanno permesso di analizzare le fasi della biogenesi di tali glicoproteine e i primi stadi dell ingresso nel ciclo vitale virale (Op De Beeck, 2001). Grazie allo sviluppo delle pseudoparticelle retrovirali esprimenti sull envelope le glicoproteine native di HCV è stato possibile, per la prima volta, caratterizzare l assemblaggio e la funzionalità di tali glicoproteine (queste particelle sono state denominate HCV pseudovirus, HCVpp) (Bartosch et al., 2003b; Drummer et al., 2003; Flint et al., 1999a; Hsu et al., 2003) Traduzione e folding delle glicoproteine E1 ed E2 sono glicoproteine transmembrana di tipo I e sono indirizzate al reticolo endoplasmatico da peptidi segnale presenti nella porzione N-terminale (Dubuisson et al., 1994; Grakoui et al., 1993). È stato dimostrato che tali proteine vengono tradotte a livello dei ribosomi associati al reticolo endoplasmatico, dove vengono processate. Le due glicoproteine presentano a livello della porzione C-terminale un dominio idrofobico transmembrana lungo circa 30 aminoacidi, mentre all N-terminale posseggono un dominio extracellulare lungo 160 e 334 aminoacidi rispettivamente per la glicoproteina E1 ed E2 (Figura 5) (Flint et al., 1999a; Flint et al., 1999b). I domini transmembrana delle due glicoproteine sono composti da due segmenti idrofobici separati da una corta regione polare, che contiene residui aminoacidici carichi conservati. I domini transmembrana sono importanti per l ancoraggio alle membrane, la localizzazione e ritenzione a livello del reticolo endoplasmatico e l assemblaggio in eterodimeri tra E1 ed E2. Questo è stato dimostrato grazie a studi in cui la regione transmembrana viene deleta o mutagenizzata (Cocquerel et al., 1998; Cocquerel et al., 2000). Le glicoproteine dell envelope di HCV si assemblano in modo non covalente formando eterodimeri di E1-E2 (Deleersnyder et al., 1997). Il folding di E1 dipende dalla co-espressione di E2 e viceversa, quindi il corretto ripiegamento di E1 e di E2 dipende dalla espressione reciproca delle due glicoproteine, indicando che entrambe cooperano per la formazione di un complesso funzionale (Cocquerel et al., 2003; Duvet et al., 1998; Michalak et al., 1997; Patel et al., 2001). È stato dimostrato che il processo di ripiegamento delle glicoproteine procede lentamente e che grazie ai glicani interagiscono con la calnexina, una proteina chaperone del reticolo endoplasmatico 9

20 (Brazzoli et al., 2005; Deleersnyder et al., 1997; Dubuisson and Rice, 1996; Duvet et al., 1998; Merola et al., 2001) Glicosilazione delle glicoproteine I domini extracellulari delle glicoproteine E1 ed E2 di HCV sono altamente N- glicosilati. La N-glicosilazione è una delle modificazioni post-traduzionali più frequenti delle proteine e avviene attraverso il trasferimento di un oligosaccaride da un intermedio lipidico ad un residuo di asparagina a livello della sequenza consenso Asn-X-Thr/Ser di una proteina neosintetizzata, dove X può essere qualsiasi aminoacido eccetto la prolina (Gavel and von Heijne, 1990; Kornfeld and Kornfeld, 1985). La catena polipeptidica in via di sintesi emerge all interno del lume del reticolo endoplasmatico ed è in tale sede che avviene questa modificazione post-trascrizionale catalizzata da oligosaccaril transferasi (Silberstein and Gilmore, 1996). La glicoproteina E1 presenta 4 siti di glicosilazione altamente conservati tra i diversi genotipi di HCV e un quinto sito di glicosilazione (in posizione 250) poco conservato, presente solo nei genotipi 1b e 6. La glicoproteina E2 presenta invece 11 siti di glicosilazione, 9 di questi siti sono altamente conservati, mentre i 2 rimanenti (N5 e N7) presentano dei livelli di conservazione rispettivamente del 75% e dell 89% tra i vari genotipi (Figura 4) (Goffard and Dubuisson, 2003; Zhang et al., 2004b). Il processo di glicosilazione esercita un ruolo importante nel folding corretto della proteina, nella sua funzione e nel modulare la risposta immunitaria (Hebert et al., 1997; Ohuchi et al., 1997a; Ohuchi et al., 1997b; van Kooyk and Geijtenbeek, 2003; von Messling and Cattaneo, 2003). Come detto precedentemente, la glicosilazione modula il ripiegamento delle glicoproteine permettendo l interazione con la calnexina nel reticolo endoplasmatico durante la maturazione. Studi di mutagenesi sito-diretta hanno dimostrato che l'assenza di alcuni glicani in E1 (posizione N1 e N4) ed E2 (posizione N8 e N10) porta ad un misfolding delle glicoproteine (Goffard et al., 2005; Meunier et al., 1999). È stato sottolineato il fatto come questa alterazione non sia dovuta alla mancata interazione tra le glicoproteine e la calnexina, suggerendo l effetto diretto della glicosilazione sul corretto ripiegamento delle glicoproteine. Infatti la presenza di un saccaride polare ad 10

21 alto peso molecolare legato ad un segmento peptidico influenza almeno localmente il ripiegamento di tale segmento (Imperiali and O'Connor, 1999; Wormald and Dwek, 1999). La mutazione di alcuni siti di glicosilazione nelle glicoproteine dell envelope di HCV può ridurre o abolire l infettività degli HCVpp apparentemente senza incidere sul ripiegamento e sull'incorporazione delle glicoproteine nelle pseudoparticelle. I glicani in posizione N2 e N4 di E2 hanno effettivamente dimostrato di essere essenziali per le funzioni di entry svolta dalle glicoproteine virali. Altri glicani (N2 di E1 e N5, N6 e N11 di E2) sembrano modulare l ingresso degli HCVpp (Goffard et al., 2005). Infine la glicosilazione permette di mascherare alcuni epitopi conservati nei vari genotipi virali a livello delle glicoproteine importanti per la fitness virale, rendendoli inaccessibili agli anticorpi e permettendo quindi al virus di evadere la risposta umorale. 11

22 Figura 4 Rappresentazione schematica delle glicoproteine E1 e E2. I siti di N-glicosilazione sono indicati dalla lettera N a livello dell aminoacido target di questa modifica post-traduzionale. I glicani coinvolti nell entry di HCVpp sono evidenziati da un quadrato nero mentre i siti di glicosilazione che mutati alterano il ripiegamento di E1-E2 sono evidenziati da un cerchio grigio (Goffard et al., 2005). La regione ipervariabile 1 (HVR1) di E2 è rappresentata dal box grigio. Le sequenze dei domini transmembrana delle glicoproteine dell envelope di HCV sono indicati nelle corrispondenti regioni C- terminali di E1 e E2 (TMD), i due segmenti idrofobici interni a tali domini sono sottolineati. In ultimo le frecce indicano le posizioni dove l inserzione di alanina blocca l eterodimerizzazione fra E1 e E2 (Op De Beeck, 2001) Regioni funzionali delle glicoproteina E2 Le attuali conoscenze sulla fisiologia del virus suggeriscono che la glicoproteina E2 potrebbe essere il principale anti-recettore di HCV (la principale molecola virale che interagisce con i recettori cellulari per permettere al virus di infettare le cellule target). Le regioni funzionali di E2 importanti in quanto capaci di interagire con le molecole cellulari finora definite sono due. La prima regione è rappresentata da almeno tre segmenti discreti della proteina E2 (aminoacidi , e ) che durante il ripiegamento di questa glicoproteina si uniscono a formare un unico dominio importante per l interazione tra E2 e il CD81 (Clayton et al., 2002; Flint et al., 1999a; Forns et al., 2000a; Forns et al., 2000b; Hsu et al., 2003; Owsianka et al., 2001; Yagnik et al., 2000). La seconda regione dotata di un ruolo fondamentale nel legame alla cellula ospite è situata nella porzione N-terminale della proteina E2. Questa regione è caratterizzata da un alta variabilità aminoacidica, denominata per questo motivo HVR1 (dall inglese 12