Popolazioni sperimentali in genetica delle piante per mappare loci di interesse

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Tommasa Turco
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1 Popolazioni sperimentali in genetica delle piante per mappare loci di interesse

2 Tipi di popolazioni sperimentali F 2 e BC 1 (Backcross) RIL (Recombinant Inbred Lines) DH (Double Haploids) IRIL (Intermated Recombinant Inbred Lines) Altri materiali NIL tramite reincrocio e tramite HIF

3 Derivate da genitori che siano linee pure, e che si autofecondano Popolazioni BC 1 ed F 2 Popolazioni di tipo classico derivate da incrocio tra due linee pure. Utilizzabili per mappaggio di marcatori molecolari (per. es. nella costruzione di mappe genetiche di linkage) e per il mappaggio di geni ad effetto mendeliano. Essendo basate su piante singole, sono popolazioni effimere (almeno nelle specie annuali che non si propagano vegetativamente) e non consentono l analisi di fenotipi di tipo quantitativo (cioè fortemente influenzati dall ambiente) che richiedono prove replicate dello stesso genotipo per avere una buona stima del valore fenotipico. Sono quindi inadatte per l analisi QTL. A parità di numero di individui una pop F 2 è circa due volte più informativa di una BC 1 in termini di precisione di mappa, essendo in gioco, nella prima, il doppio di cromosomi segreganti. vedi Cap. 3, pag 85-97, vol. I; e Cap pag vol III, Barcaccia e Falcinelli

4 Popolazioni BC 1 ed F 2 A B Figura 20.9 Segregazione indipendente di alleli marcatori a due loci genomici nella F 2 (A) e nel reincrocio (B). Pag. 966, Vol III, Barcaccia e Falcinelli

5 RILs (Recombinant Inbred Lines: linee inbred ricombinanti) Tipo di popolazione molto diffuso in genetica molecolare dei cereali Richiede 5-6 cicli di autofecondazione dopo la produzione di una popolazione F 2 a partire da genitori omozigoti (linee pure). La presenza di parziali regioni in eterozigosi nelle prime generazioni e gli ulteriori eventi di ricombinazioni nei cicli di autofecondazione consentono di aumentare il numero di meiosi informative e quindi la risoluzione di mappa. In F 6 le piante sono praticamente omozigoti. Ciascuna pianta può quindi essere utilizzata per produrre, tramite moltiplicazione, seme di una linea che può essere riprodotta in maniera indefinita (= la popolazione è immortalizzata), e consente di effettuare prove replicate nello spazio (localita diverse) e nel tempo (annate successive).

6 RILs (Recombinant Inbred Lines = linee inbred ricombinanti) Figura 20.10A Schema per l ottenimento di linee inbred ricombinanti (RIL), modificato da Burr et al., 1988 (A). Pag 967, Vol III, Barcaccia e Falcinelli

7 DH (Doubled Haploids = aploidi raddoppiati) Come si ottengono: a partire da gameti aploidi di piante F 1 si producono tramite colture in vitro le piante aploidi (salto di generazione ma non di fase), e successivamente se ne raddoppia il genoma. Si utilizzano varie tecniche, le più diffuse sono: coltura di antere o di polline (androgenesi), coltura di ovuli (ginogenesi), incrocio interspecifico. Antere, pollini, o gli ovuli, sono coltivati in vitro per produrre piante aploidi Le piantine aploidi sono trattate con colchicina (inibitore del fuso mitotico), che induce il raddoppiamento del numero cromosomico. La produzione di DH consente di raggiungere velocemente lo stadio di omozigosi a tutti i loci. Si velocizza così la produzione di linee pure, utili direttamente nel miglioramento genetico. Consentono di raggiungere velocemente lo stadio di linee ricombinanti omozigoti che possono essere utilizzate per il mappaggio di geni e di QTL.

DH (Doubled Haploids = aploidi raddoppiati) Figura 16.

8 DH (Doubled Haploids = aploidi raddoppiati) Figura Rappresentazione schematica della coltura di antere per l ottenimento di piante omozigoti. Pag 763, Vol III Barcaccia e Falcinelli Figura 20.10B Schema per l ottenimento di linee DH Pag 967, Vol III, Barcaccia e Falcinelli

9 IRIL: Intermated Recombinant Inbred Lines (RIL interincrociate) Tipo di popolazione simile alle RIL, ma prodotto con ulteriori cicli di incroci casuali (interincroci) dopo la generazione F 2 e prima dei cicli di autofecondazione. Gli ulteriori cicli di interincrocio mantengono elevato il livello di eterozigosi e aumentano il numero di meiosi informative che quindi consentono una maggiore risoluzione di mappa. Utilizzata in mais, dove ha consentito di produrre popolazioni che uniscono i vantaggi delle RIL (omozigosi) con una elevata informatività di mappa. Esempio è la popolazione IBM (intermated B73 x Mo17) ottenuta a partire dall incrocio tra le linee pure B73 ed Mo17, produzione della popolazione F 2 ed ulteriori 4 cicli di incrocio casuale.

10 RILs vs. IRILs RILs IRILs Notare il maggior numero di eventi di crossing-over presenti nelle linee IRIL rispetto alle RIL Mod. da Cavanagh et al. Current Opinion in Plant Biology 2008, 11:

11 IRIL: Intermated Recombinant Inbred Lines Esempio: popolazione IBM (Intermated B73 x Mo17)

12 IRIL: Intermated Recombinant Inbred Lines F 2 B73 x Mo17, Chrom. 2 IRIL4 Esempio di espansione della mappa genetica di mais (nell esempio il cromosoma 2) quando calcolata su una popolazione F 2 (a sinistra) o su una popolazione IRIL4 (4 cicli di interincrocio). Da Lee et al., 2002, Plant Mol Biol

13 Analisi QTL: popolazioni da incroci sperimentali Da Alonso-Blanco C and Koornneef M (2000) TPS

14 NILs = Nearly Isogenic Lines: linee quasi isogeniche Definizione generica che identifica due o più materiali a genotipo identico a tutti i loci ad eccezione di una regione, più o meno limitata e demarcta da marcatori genetici, alla quale presentano alleli diversi. Le NILs sono prodotte in maniera specifica a regioni cromosomiche d interesse. Coppie di NILs consentono di valutare con precisione l effetto, su un carattere fenotipico, della sostituzione di un allele con un altro. Sono spesso utilizzate quindi per valutare e/o confermare l effetto di un QTL su un carattere d interesse. La produzione di NILs richiede diversi cicli di reincrocio assistito con marcatori, a partire dall incrocio tra due linee pure (ricorrente e donatore) che portano i due alleli alternativi (es. AA e aa). Ad ogni reincrocio, le piante vengono saggiate per la presenza dell allele di interesse al locus target e, in tale ambito, si scelgono le linee con la maggiore % di genoma del genitore ricorrente. Infine si applicano 1-2 cicli di autofecondazione per fissare in omozigosi le NILs con gli alleli alternativi (AA e aa).

15 NILs per Vegetative to generative transition 1 (Vgt1) Gaspé Flint N28E N28 Salvi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 104: N28E N28

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