I GENI sono alla base delle Biotecnologie
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- Erica Gagliardi
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1 Corso di BIOTECNOLOGIE VEGETALI Introduzione alle Biotecnologie 2 parte A cura di Pierdomenico Perata & Elena Loreti I GENI sono alla base delle Biotecnologie Trasformazione Metodi principali di cellule in coltura in planta electroporation Agrobacterium tumefaciens tecnica bio -balistica 1
2 Trasformazione di cellule in coltura CELLULE IN COLTURA PROTOPLASTI ELECTROPORATION CALLO RIGENERAZIONE Tumori causati da Agrobacterium tumefaciens 2
3 sintesi citochinine sintesi opine RB sintesi auxine LB T-DNA Plasmide Ti coniugazione Ori catabolismo opine regione vir Agrobacteriumtumefaciens gene di interesse Marker di selezione vegetale Vettore binario RB LB marker di selezione Ori E.coli Ori batterico Agrobacterium regione T-DNA rimossa Plasmide Ti helper Regione vir Ori Agrobacterium 3
4 4
5 Screening per l individuazione delle plantule trasformate Screening per l individuazione delle plantule trasformate gene di interesse gene di resitenza all antibiotico Vettore binario RB LB marker di selezione Ori E.coli Ori batterico Agrobacterium 5
6 METODI DI SELEZIONE: antibiotici Non trasformato: Antibiotico Tossicità Trasformato: Antibiotico Gene resistenza Resistenza METODI DI SELEZIONE: antibiotici Gene di resistenza ad antibiotici piu usato: Neomycin phosphotransferase (NPTII) Problematiche connesse: Trasferimento resistenza a microrganismi intestinali Non esistono evidenze sperimentali a supporto L eventuale microrganismo resistente non si diffonderebbe in assenza di continua pressione selettiva (antibiotico) Se avvenisse: scarso impatto, già esistono numerose popolazioni di microrganismi resistenti a questi antibiotici Promotore vegetale, non funzionerebbe in batteri Proteina NPT prodotta dalla pianta rapidamente degradata nell intestino; Cofattori necessari al funzionamento di NPT assenti in giusta concentrazione Kanamicina e Neomicina sono scarsamente usati in medicina METODI DI SELEZIONE: mannosio Non trasformato: M6P ATP ADP M6P M6P Mannosio M6P M6P HXK M6P M6P M6P Tossicità da carenza di P Trasformato: ATP ADP Mannosio HXK M6P MPI F6P Glicolisi 6
7 METODI DI SELEZIONE: resistenza a erbicidi Preferiti agli antibiotici: maggior tossicità inserimento carattere agronomicamente utile Il gene Bar (da Streptomyces hygroscopicus) conferisce resistenza agli erbicidi a base di Phosphynothricin: Basta (registered in Europe) Bialaphos (registered in Japan) Ignite (registered in the USA). La proteina Bar inattiva la Phosphynothricin aggiungendole un gr uppo acetile preso dal Acetyl-CoA Problematiche: Piante resistenti a erbicidi possono indurre l agricoltore ad un maggior uso di erbicidi (maggiori residui nei prodotti alimentari) Sviluppo di piante resistenti in seguito all eccessivo uso di diserbanti Costrutto genico PROMOTORE REGIONE CODIFICANTE TERMINATORE TRASCRIZIONE 5 mrna AAAAAAA 3 TRADUZIONE PROTEINA Costrutto genico PROMOTORE TERMINATORE REGIONE CODIFICANTE GENOMA TRASFORMAZIONE (INSERIMENTO TRANSGENE NEL GENOMA) L INSERZIONE DEL TRANSGENE PUO INTERROMPERE LA SEQUENZA DI UN GENE DELLA PIANTA RICEVENTE 7
8 Costrutto genico TIPOLOGIE DI PROMOTORE COSTITUTIVO: GARANTISCE UNA ELEVATA ESPRESSIONE IN TUTTI I TESSUTI DELLA PIANTA A TUTTI I SUOI STADI DI SVILUPPO ESEMPIO: PROMOTORE 35S DEL VIRUS del MOSAICO DEL TABACCO (CaMV) TESSUTO SPECIFICO: GARANTISCE L ESPRESSIONE IN ALCUNI TESSUTI DELLA PIANTA ESEMPIO: PROMOTORE PEP-CARBOSSILASI, ESPRESSO IN FOGLIE DI PIANTE A FOTOSINTESI C4 TESSUTO -TEMPO SPECIFICO: GARANTISCE L ESPRESSIONE IN ALCUNI TESSUTI DELLA PIANTA AD UNO SPECIFICO STADIO DI SVILUPPO ESEMPIO: PROMOTORE LEA (Late Embyogenesis Abundant), ESPRESSO IN EMBRIONI ALLO STADIO TERMINALE DI SVILUPPO INDUCIBILI: GARANTISCE L ESPRESSIONE IN RISPOSTA AD UN TRATTAMENTO CHIMICO ESEMPIO: PROMOTORE INDUCIBILE DA ANTIBIOTICI Controllo inserzione del transgene Controllo inserzione del transgene 8
9 PCR Annealing a 55 Denaturazione a 95 PCR Controllo inserzione del transgene genoma pianta CaMV35S gene di interesse T-nos genoma pianta 9
10 Controllo inserzione del transgene CTRL T 1-1 T T Controllo espressione del transgene tramite Northern Blot wt wt tr tr Trasformazione metodo biolistico PROIETTILI DNA-COATED GAS VUOTO MATERIALE VEGETALE 10
11 Trasformazione metodo biolistico Trasformazione metodo biolistico Trasformazione metodo biolistico Trasformazione di genoma del cloroplasto 11
12 Trasformazione di genoma del cloroplasto VANTAGGI I GENI CLOROPLASTICI NON SONO TRASMESSI MEDIANTE IL POLLINE (MINOR RISCHIO DI FLUSSO GENICO) ELEVATI LIVELLI DI ESPRESSIONE DEL TRANSGENE DOVUTI ALLA PRESENZA DI MOLTI CLOROPLASTI NELLA CELLULA (CONTRO UN SOLO NUCLEO) IL DNA INSERITO NEL GENOMA DEL CLOROPLASTO E COPIATO VOLTE (NEL NUCLEO SOLO 1-4 VOLTE) Trasformazione 12
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