Le proteine che legano l ossigenol

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1 Le proteine che legano l ossigenol

2 Protoporfirina IX

3 EME (Fe-protoporfirina IX)

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5 L atomo di ferro del gruppo eme può formare sei legami

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9 Struttura della mioglobina di capodoglio (J. Kendrew, anni 50)

10 Struttura della mioglobina di capodoglio (J. Kendrews) > 70% in α-elica La maggior parte dei gruppi R idrofobici sono all interno della molecola, lontano dal contatto con l acqua; Tutti i gruppi polari, meno 2, sono localizzati sulla superficie; I residui di prolina sono localizzati in corrispondenza di un cambio di direzione; La molecola è così compatta che nel suo interno vi è posto per solo 4 molecole di acqua. In questo ambiente così compatto le interazioni deboli sono più salde. Le catene laterali non polari nel nucleo della proteina sono così vicine che le interazioni a breve raggio di van der Waals stabilizzano le interazioni idrofobiche; Il gruppo eme è confinato in una tasca della molecola.

11 Rappresentazione in grafico del legame di un ligando θ = siti di legame occupati/totale dei siti di legame

12 Curva di legame dell ossigeno alla mioglobina

13 Gli ostacoli intorno all eme sono essenziali per avere una ossigenazione reversibile Il gruppo eme inserito nella mioglobina è molto meno ossidabile. Quando l eme non è legato a proteine, la reazione dell ossigeno con uno dei due siti di coordinazione del ferro genera l ossidazione irreversibile del Fe 2+ a Fe 3+. Difficilmente due molecole di mioglobina potranno associarsi per consentire la formazione di complessi eme - O 2 -eme

14 La specificità del gruppo eme per ligandi diversi dall ossigeno è diversa quando la molecola è libera in soluzione o è inserita all interno della mioglobina Il CO si lega alla molecola di eme libero circa volte meglio dell ossigeno, ma si lega solo 200 volte meglio quando l emel è presente all interno della mioglobina. Questa differenza è dovuta essenzialmente a interferenze steriche.

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17 L ossigeno si adatta perfettamente alla tasca presente intorno al gruppo eme. Il legame del monossido di carbonio è inibito dalla presenza dell istidina distale.

18 Struttura quaternaria delle proteine L emoglobina è una proteina tetramerica contenente 4 gruppi eme prostetici, uno per ciascuna subunità. L emoglobina A (dell adulto) contiene due tipi di globina, 2 catene α (141 residui) e 2 catene β (146 residui).

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21 Sequenze amminoacidiche della mioglobina di capodoglio e delle 2 catene α e β dell emoglobina umana

22 La mioglobina ha un affinità per l ossigeno maggiore di quella dell emoglobina. Il legame dell ossigeno all emoglobina è cooperativo.

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25 Alla pressione parziale di O 2 presente nei polmoni l emoglobina è satura con l O 2 per circa il 98%. Alla pressione parziale di O 2 presente nei muscoli in attività l emoglobina è satura con l O 2 per circa il 55-65%. L emoglobina è molto efficiente nel trasporto di O 2

26 La mioglobina non sarebbe in grado di rilasciare l O 2 ai tessuti periferici.

27 Effetto Bohr L aumento della concentrazione degli ioni H + (riduzione del ph) e della CO 2 stimolano il rilascio di O 2 da parte dell emoglobina (effetto Bohr). CO 2 + H 2 O H 2 CO 3 H+ + HCO 3 - Anidrasi carbonica

28 L affinità dell emoglobina per l ossigeno dipende dal ph

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30 L affinità dell emoglobina per l ossigeno è regolata da composti organici contenenti gruppi fosforici come il 2,3 bisfosfoglicerato 2,3 - Bisfosfoglicerato (BPG)

31 Il BPG (2,3 - bisfosfoglicerato) si lega all emoglobina e ne riduce l affinità per l O 2 Questo composto organico è presente nei globuli rossi umani alla stessa concentrazione dell emoglobina. In assenza di BPG l emoblobina avrebbe un affinità per l O 2 troppo alta e l ossigeno non potrebbe essere scaricato nei capillari tissutali.

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34 La struttura quaternaria dell emoglobina si modifica con l ossigenazione La ossi- e la deossiemoglobina hanno diversa struttura quaternaria La struttura quaternaria della deossiemoglobina è chiamata forma T (Tesa o Rigida), quella della ossiemoglobina forma R (Rilassata) Durante la transizione da ossi a deossiemoglobina avvengono numerose modificazioni strutturali, prevalentemente a livello delle regioni di contatto α 1 β 2 La coppia α 1 β 1 ruota di 15 0 rispetto all altra coppia

35 15 0 α 1 α 2 β 2 β 1 Durante l ossigenazione una coppia di subunità αβ ruota rispetto all altra di 15 gradi.

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37 Interazioni tra le subunità dell emoglobina

38 Alcune coppie saline (ponti salini) che stabilizzano la forma deossi dell emoglobina I legami salini tra le subunità presenti nella deossiemoglobina vengono spezzati durante l ossigenazione

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40 L interfaccia tra le subunità dell emoglobina è in diretta connessione con il gruppo eme. Modificazioni strutturali in questa zona possono influenzare il gruppo eme, viceversa modificazioni nel gruppo eme vengono trasmesse all interfaccia tra le subunità.

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42 L atomo di ferro si sposta all interno del piano dell eme durante l ossigenazione

43 Le modificazioni conformazionali vicino al gruppo eme in seguito al legame dell ossigeno

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45 Le modificazioni conformazionali vicino al gruppo eme vengono trasmesse al resto della proteina.

46 Movimenti all interfaccia α 1 -β 2 durante la transizione T R

47 Le modificazioni conformazionali in seguito al legame dell ossigeno, quando sono trasmesse alle interfaccie provocano la rottura dei ponti salini.

48 La struttura quaternaria dell emoglobina si modifica con l ossigenazione Il legame dell ossigeno ad un gruppo eme viene messo in comunicazione con parti della molecola lontane. Una modificazione strutturale (ossigenazione) all interno di una subunità viene trasferita, mediante modificazioni conformazionali alle interfaccie tra le subunità, anche alle altre subunità. Un numero maggiore di legami elettrostatici devono essere rotti per permettere il legame della prima molecola di ossigeno L aumento dell affinità per la molecola di O 2 successiva dipende dal fatto che il numero di legami salini che devono essere rotti diminuisce progressivamente dopo il legame della prima, seconda, terza e quarta molecola di O 2.

49 Gli effetti della concentrazione degli H +, della CO 2 (HCO 3- ) e BPG sull affinità dell emoglobina per l O 2 sono dovuti agli effetti stabilizzanti sulla conformazione della deossiemoglobina (forma T)

50 Alcuni residui di istidina nella forma carica (+ H + ) sono coinvolti in legami salini che stabilizzano la forma deossi dell emoglobina. Abbassando il ph (= aumentando al concentrazione degli ioni H + ) le istidine tendono ad essere protonate e quindi si stabilizza la forma deossi.

51 Curva di titolazione dell Istidina (un amminoacido con R contenente un gruppobasico). Il pi = 7,59 (la media dei valori di pk a dei gruppi amminico e imidazolico) A questo valore di ph i due gruppi basici contribuiscono con una carica netta di +1 che bilancia la carica netta -1 del gruppo -COO -

52 Tipici valori di pk a dei gruppi ionizzabili presenti nelle proteine L istidina ha un gruppo R con pk a di 6,0 che può comportarsi da tampone a un ph vicino alla neutralità

53 Ponti salini che stabilizzano la struttura T dell emoglobina emoglobina

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55 Gli ioni bicarbonato si legano ai gruppi α-amminici amminoterminali dell emoglobina. Il carbamato legato forma interazioni elettrostatiche che stabilizzano la forma deossi ( T ) dell emoglobina. Residuo ammino - terminale Residuo carbammino - terminale In questo modo l emoglobina serve da trasportatore di CO 2 dai tessuti ai polmoni.

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57 Il BPG stabilizza la struttura quaternaria della deossiemoglobina formando legami trasversali tra le catene β.

58 Il 2,3 bisfosfoglicarato si lega nella larga cavità centrale presente nella deossiemoglobina

59 Legame del BPG alla deossiemoglobina Il BPG, che ha carica pari a -5 in condizioni fisiologiche, è circondato da otto gruppi cationici (in blu) che appartengono alle due catene β

60 Il legame del BPG stabilizza lo stato T della deossiemoglobina

61 In blu i diversi gruppi carichi positivamente che circondano la tasca tra le due subunità β nello stato T (deossi)

62 Nello stato R la cavità centrale è troppo stretta per contenere il BPG

63 Il gruppo dei geni della famiglia della β-globina nell uomo

64 L emoglobina fetale (α 2 γ 2 ) ha un affinità per l ossigeno più elevata di quella materna (α 2 β 2 ). Questa caratteristica dell emoglobina fetale rende possibile il trasferimento dell O 2 dal circolo materno a quello fetale L emoglobina fetale lega meno saldamente il BPG e quindi presenta una affinità maggiore per l O 2.

65 Nelle catena γ un residuo di serina sostituisce l istidina 143 della catene β.

66 I due modelli generali per spiegare l interconversione l di forme inattive e di forme attive in proteine con un legame cooperativo. a) Modello concertato b) Modello sequenziale

67 Durante l evoluzione l dalla mioglobina all emoglobina è stata creata una proteina capace di ricevere informazioni dal suo ambiente (O 2, H +, CO 2, BPG)

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69 L anemia a cellule falciformi: una malattia molecolare

70 WT Glu Val Posizione 6 delle due subunità β

71 Quando l emoglobina S è deossigenata, diventa insolubile in acqua e forma polimeri che si aggregano in fibre tubulari. Le fibre insolubili di emoglobina S deformano l eritrocita facendogli assumere la forma a falce. La percentuale di cellule falciformi aumenta man mano che il sangue perde ossigeno.

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73 Fotografia al microscopio elettronico di fibbre di deossiemoglobina che stanno uscendo da un eritrocita rotto.

74 Residui conservati nelle catene α e β dell emoglobina dei mammiferi In blu sono indicati le posizioni dei residui invariabili, che si localizzano intorno al gruppo eme ed all interfaccia α 1 β 2. Questi residui sono stati identificati in circa 60 specie. Nella molecola dell emoglobina vi sono 43 posizioni invariabili.

75 Posizioni delle mutazioni nell emoglobina emoglobina che producono una condizione patologica Se questa figura viene confrontata con la figura precedente si nota che queste mutazioni presentano un pattern simile a quello delle posizioni invariabili.

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80 Il legame cooperativo dell ossigeno aumenta le capacità di trasporto dell emoglobina Alla pressione parziale di O 2 presente nei polmoni l emoglobina è saturacon l O 2 per circa il 98%. Alla pressione parziale di O 2 presente nei muscoli in attività l emoglobina è satura con l O 2 per circa il 32%. L emoglobina è molto efficiente nel trasporto di O 2