METADONE ed EDDP urinari in GC-MS Cod. GC Metodo di conferma in GC-MS

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1 METADONE ed urinari in GC-MS Cod. GC48010 Metodo di conferma in GC-MS INTRODUZIONE Il Metadone è una sostanza con una lunga storia di sostituto dell eroina. La sua determinazione di screening nei liquidi biologici (soprattutto in urina) viene generalmente effettuata usando tecniche immunometriche con l ausilio di anticorpi monoclonali e successiva marcatura con vari reagenti. Poiché tali tecniche non possono escludere falsi positivi, le positività allo screening devono essere confermate con tecnica alternativa, generalmente con tecnica cromatografia sia Gassosa (GC) che Liquida (LC) entrambe accoppiate con detector specifici e selettivi (UV, Fluorescenza, MS). Il presente metodo consente di determinare il Metadone ed il suo metabolita primario, l, previa estrazione solido-liquido e lettura in GC-MS. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Release N 003 Metadone ed urinari in GC/MS Settembre

2 Principio del metodo : CARATTERISTICHE DEL KIT Il presente metodo consente di determinare il Metadone ed il suo metabolita primario, l, previa estrazione SPE e lettura in GC/MS. Recupero del Metodo : circa 98 % Sensibilità del Metodo : Range Dinamico del Metodo : circa 20 ng/ml ng/ml Valore di cut-off : Metadone 100 ng/ml 100 ng/ml Rif. Procedure applicative del procedimento n.99/cu 30 ottobre 2007 Contenuto della Confezione : Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili 3 anni a 2 8 C. Reagente A Soluzione Condizionamento 1, 1 x 100 ml Reagente B Soluzione Condizionamento 2, 1 x 100 ml Reagente C Soluzione Tampone, 1 x 100 ml Reagente D Soluzione Lavaggio, 1 x 100 ml Reagente E Soluzione di Eluizione, 1 x 200 ml Reagente F Soluzione Diluente, 1 x 20 ml Reagente G Soluzione Test Metadone, 1 x 0,5 ml Reagente H Soluzione Test, 1 x 0,5 ml Reagente I1 Calibratore liofilo urinario Metadone Livello 1, 1 x 5 ml Reagente I2 Calibratore liofilo urinario Metadone Livello 2, 1 x 5 ml Reagente I3 Calibratore liofilo urinario Metadone Livello 3, 1 x 5 ml Reagente I4 Calibratore liofilo urinario Metadone Livello 4, 1 x 5 ml Reagente I5 Calibratore liofilo urinario Metadone Livello 5, 1 x 5 ml Reagente J1 Calibratore liofilo urinario Livello 1, 1 x 5 ml Reagente J2 Calibratore liofilo urinario Livello 2, 1 x 5 ml Reagente J3 Calibratore liofilo urinario Livello 3, 1 x 5 ml Reagente J4 Calibratore liofilo urinario Livello 4, 1 x 5 ml Reagente J5 Calibratore liofilo urinario Livello 5, 1 x 5 ml Reagente L Soluzione Stabilizzante, 1 x 10 ml Colonne di Clean-up, 100 pz 2

3 Dotazione strumentale minima richiesta : Dotazione opzionale : Strumento GC-MS Computer gestionale Autocampionatore Modalità di prelievo urinario : Prelevare 10 ml urina Stabile per circa 3 mesi a 20 C Release N 003 Metadone ed urinari in GC/MS Settembre

4 PROCEDURA PREANALITICA: FASE 1: In una provetta di vetro con tappo in teflon pipettare : 400 µl di Reagente F Soluzione Diluente 50 µl di Reagente G Soluzione Test Metadone 50 µl di Reagente H Soluzione Test Agitare al Vortex per 20 sec. FASE 2: Portare a secco l eluato con l ausilio di un flusso di elio o di azoto FASE 3: Riprendere con 100 µl di Reagente L - Soluzione Stabilizzante Agitare al Vortex per 20 sec. FASE 4: Trasferire tutto il campione in vials con riduttore di volume NOTA : Prima di iniziare la seduta analitica è consigliabile iniettare 1µl di questa soluzione in GC per identificare il tempo di ritenzione del Metadone e dell che devono essere simili a quelli riportati in Fig. 1. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. PROCEDURA ANALITICA FASE 1 : Condizionamento delle colonne di Clean-up Versare in colonna 1 ml di Reagente A Soluzione di Condizionamento 1 Scartare l eluato Versare in colonna 1 ml di Reagente B Soluzione di Condizionamento 2 Scartare l eluato Release N 003 Metadone ed urinari in GC/MS Settembre

5 FASE 2 : Preparazione del Campione Fare una Curva di Calibrazione su 5 punti : Campione Calibratore Metadone + Livello 1 Campione 1000 µl Reagente I1 Calibratore Metadone Livello 1 Reagente J1 Calibratore Livello 1 Reagente I2 Calibratore Metadone Livello 2 Reagente J2 Calibratore Livello 2 Reagente I3 Calibratore Metadone Livello 3 Reagente J3 Calibratore Livello 3 Reagente I4 Calibratore Metadone Livello 4 Reagente J4 Calibratore Livello 4 Reagente I5 Calibratore Metadone Livello 5 Reagente J5 Calibratore Livello 5 Calibratore Metadone + Livello 2 Calibratore Metadone + Livello 3 Calibratore Metadone + Livello 3 Calibratore Metadone + Livello 5 Controllo Metadone + Controllo Metadone Controllo Reagente C Sol. Tampone 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl 1000 µl Controllare che il ph sia compreso tra 6,5 e 7,5 Eventualmente correggerlo Agitare al Vortex N.B. I valori dei Calibratori Metadone ed mixati insieme avranno come concentrazione la META di quella riportata nella tabella delle Avvertenze!!! FASE 3 : Versare tutti i campioni precedentemente preparati (mediante due aggiunte successive da 1 ml ognuna) nelle colonne di Clean-up e scaricare ad un flusso di 1 ml/ minuto. Scartare l eluato FASE 4 : Lavaggio delle colonne di Clean-up: Lavare con 1 ml di Reagente D Soluzione di Lavaggio Scartare l eluato e portare a secco con un leggero flusso d aria Release N 003 Metadone ed urinari in GC/MS Settembre

6 FASE 5 : Eluizione rigorosamente in provette di vetro con tappo in pyrex Eluire con 2 ml di Reagente E Soluzione di Eluizione Raccogliere l eluato in provette di vetro ed agitare accuratamente al vortex Se si crea un intorbidimento o un precipitato nell eluato, centrifugare a 4000 rpm per 2 minuti. FASE 6 : Portare a secco l eluato con l ausilio di un flusso di elio o di azoto FASE 7: Riprendere con 100 µl di Reagente L - Soluzione Stabilizzante Agitare al Vortex per 20 sec. FASE 8: Trasferire tutto il campione in vials con riduttore di volume. N.B.: il campione così preparato è stabile 1 giorno a 2-8 C INIEZIONE : Iniettare 1 µl nel sistema GC. Release N 003 Metadone ed urinari in GC/MS Settembre

7 REAGENTE G SOLUZIONE TEST METADONE METADONE ed urinari - Avvertenze METADONE ~ ng/ml REAGENTE H SOLUZIONE TEST ~ ng/ml REAGENTI I1-I2-I3-I4-I5 CALIBRATORI LIOFILI URINARI METADONE Lot. METADONE Modalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema GC. Aggiungere esattamente 5 ml di H 2 O di grado HPLC e agitare delicatamente per 20 min. fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Prima del campionamento rimescolare gentilmente per assicurarne l omogeneità. Conservazione e stabilità: i Calibratori sono stabili 36 mesi se conservati a 2 8 C. Una volta ricostituiti 7 giorni se conservati a 2 8 C e 1 mese a 20 C. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : 1 x 5 x 5 ml Precauzioni: questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo. N.B.: una volta ricostituiti i calibratori vanno stoccati separatamente. Livello 1 Livello 2 Livello 3 Livello 4 Livello5 ng / ml REAGENTI J1-J2-J3-J4-J5 CALIBRATORI LIOFILI URINARI Lot. Modalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema GC. Aggiungere esattamente 5 ml di H 2 O di grado HPLC e agitare delicatamente per 20 min. fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Prima del campionamento rimescolare gentilmente per assicurarne l omogeneità. Conservazione e stabilità: i Calibratori sono stabili 36 mesi se conservati a 2 8 C. Una volta ricostituiti 7 giorni se conservati a 2 8 C e 1 mese a 20 C. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : 1 x 5 x 5 ml Precauzioni: questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo. N.B.: una volta ricostituiti i calibratori vanno stoccati separatamente. Livello 1 Livello 2 Livello 3 Livello 4 Livello5 ng / ml SETTAGGIO DEL GAS-CROMATOGRAFO : Colonna VF-5ms 30 m x 0,25 mm, 0,25 µm (condizionata) Temperatura iniettore 280 C Rapporto di Splittaggio Iniziale: OFF 0.1 min: ON 100 Temperatura forno colonna 50 C x 1 minuto + 20 C/min fino a 180 C x 0 minuti + 10 C/min fino a 300 C x 1.5 minuti (corsa 21 minuti) Flusso in Colonna: 1 ml/min 7

8 SETTAGGIO DETECTOR DI MASSA : Range di Massa Temperatura della Massa: 180 C; Temperatura Transfer Line: 270 C; Temperatura Manifold: 80 C Filamento on: 6 minuti Modo operativo in Impatto Elettronico (EI) CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA VF-5 MS E DELLA SIRINGA Lavare la siringa prima e dopo dell iniezione con ETIL ACETATO. Per la colonna seguire le prescrizioni del costruttore. Non condizionare la (le) colonna/e se attaccata al Detector di Massa. All inizio di ogni seduta analitica effettuare la calibrazione delle masse e delle RF. PULIZIA DELLA COLONNA Disconnettere il detector. Al termine di ogni seduta analitica portare il gradiente alla massima temperatura della colonna (consigliata dal costruttore) con una velocità di 30 C/minuto. ( Vedere istruzioni del costruttore ) ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE CC48016 Calibratore urinario per Metadone 2 x 5 x 5 ml CC48116 Calibratore urinario per 2 x 5 x 5 ml CC43017 Controllo multiparametrico per Droghe d abuso Livello 1 6 x 5 ml CC43018 Controllo multiparametrico per Droghe d abuso Livello 2 6 x 5 ml CC43019 Controllo multiparametrico per Droghe d abuso Livelli 1 e 2 2 x 6 x 5 ml CC48017 Controllo urinario per, 6-MAM e Cocaina Livello 1 6 x 5 ml CC48018 Controllo urinario per, 6-MAM e Cocaina Livello 2 6 x 5 ml CC48019 Controllo urinario per, 6-MAM e Cocaina Livelli 1 e 2 2 x 6 x 5 ml Z Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 144 Pz S Riduttori di volume per vials da 2 ml 1 x 100 Pz 8

9 Metadone ed urinari (Cromatogrammi e Spettri di riferimento) M Counts Ionization Off 100: Soluzione Test.SM S TIC Filtered 100% Spectrum 1A BP: m in, Scan: 1923, 100:320, Ion: 214 us, RIC: 1.293e+6, BC % min min METADONE % % % minutes m/z Fig. 1 Soluzione Test R.T R.T METADONE Fig. 2 Spettro di Massa del Test Metadone IONI MOLECOLARI:

10 Metadone ed urinari (Cromatogrammi e Spettri di riferimento) MCounts Ionization Off 100: C a m p io ne U rina rio.s M S T IC Filtere d 100% S p e ctru m 1 A BP: m in, Scan: 1751, 100:320, Ion: 204 us, RIC: 1.612e+6, BC % min min METADONE 50% % % minutes m/z Fig. 3 Campione urinario R.T ng/ml R.T METADONE 250 ng/ml Fig. 4 Spettro di Massa del Test IONI MOLECOLARI:

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