The role of microrna-29a in the regulation of myogenic progenitor proliferation and adult skeletal muscle insulin sensitivity

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1 Diss. ETH no The role of microrna-29a in the regulation of myogenic progenitor proliferation and adult skeletal muscle insulin sensitivity A thesis submitted to attain the degree of DOCTOR OF SCIENCES OF ETH ZURICH (Dr.Sc. ETH Zurich) presented by Artur Galimov M.Sc. in bioengineering, Lomonosov Moscow State University born on October 15, 1984 citizen of Russian Federation Accepted on the recommendation of Prof. Dr. Christian Wolfrum Prof. Dr. med. Jan Krützfeldt Prof. Dr. med. Michael Ristow Prof. Dr. med. Daniel Konrad May, 2015

2 SUMMARY SUMMARY Skeletal muscle represents one of the key tissues responsible for metabolic, cardiovascular and overall health. Abnormalities in skeletal muscle metabolism are considered as a primary event in the development of type 2 diabetes. At the same time muscle possesses a prominent capacity to regenerate and adapt to required loads. The regeneration process largely relies on muscle stem cells, which are activated in response to injury and exercise, massively proliferate and rebuild new myofibers, as well as provide nuclei for regenerating ones. Growth factors, such as growth hormone (GH), insulin growth factor 1 (IGF1) and fibroblast growth factor (FGF) have been repeatedly reported to have an important role in different aspects of muscle physiology, including both muscle regeneration and metabolism. MicroRNAs have been demonstrated to be crucial regulators evolved to fine-tune gene expression and to have an established role in tissue development and regeneration. Many micrornas, including muscle specific micrornas, so called myomirs, have been shown to regulate muscle function. The work presented in this thesis focuses on the role of the microrna pathway, namely microrna-29a, in mediation of physiologic functions of soluble growth factors: growth hormone and fibroblast growth factor. Chapter I provides broad introduction into skeletal muscle physiology (section 1.1) and microrna function in relation to skeletal muscle (section 1.2). Within this chapter, different relevant aspects of skeletal muscle biology are discussed, including satellite cell biology, markers of muscle development, role of growth factors, aspects of muscle metabolism, and pathophysiology of type 2 diabetes. Chapter II presents our study on the role of the microrna pathway in mediation of instructing signal of FGF for satellite cells to proliferate and maintain uncommitted state. MiR-29a was observed to be upregulated by FGF in myogenic progenitors both in vitro and in vivo. We demonstrated that deletion of mir-29 in primary myoblasts (in vitro) or myogenic progenitors (in vivo) decreased their proliferation and led to premature differentiation. In vivo mir-29a deletion blunted both injury and exercise-induced muscle regeneration. Regenerating muscles in mir-29a knocked-out (KO) animals were characterized with increased fibrosis and reduced muscle mass, and this phenotype was present after 4 weeks of regeneration, when muscle regenerates completely in control animals. Chapter III presents our study on the role of micrornas in GH mediated skeletal muscle insulin resistance. We have demonstrated that GH downregulates mir-29a in skeletal muscle of human patients and GH deficient mice, and that this regulation is mediated by IGF1. Furthermore, changes in mir-29a expression in muscle during GHRT correlated with changes in insulin sensitivity iii

3 SUMMARY in human patients. Besides, mirna-29a downregulation reciprocally correlated with induction of its targets, associated with tissue inflammation and insulin resistance. Chapter IV provides information about material and methods used Overall, our findings highlight the importance of mir-29a for different aspects of muscle physiology, such as myogenic progenitor function during muscle regeneration and control over insulin resistance in adult tissue. Further research is needed in order to uncover details of mir-29a functioning in skeletal muscle and develop therapeutic approaches. iv

4 SOMMARIO SOMMARIO ll muscolo scheletrico rappresenta uno dei tessuti principali responsabili per la salute metabolica, la salute cardiovascolare e la salute in generale. Anomalie nel metabolismo del muscolo scheletrico sono considerate come l evento primario nello sviluppo del diabete di tipo 2. Allo stesso tempo, il muscolo scheletrico possiede una prominente capacità di rigenerarsi ed ad adattarsi ai carichi richiesti. Il processo di rigenerazione si affida principalmente sulle cellule staminali muscolari, che si attivano in risposta a lesioni ed esercizio fisico. In seguito, esse proliferano massicciamente andando a ricostruire nuove fibre muscolari. I fattori di crescita, come l'ormone della crescita (GH), il fattore di crescita insulino-simile (IGF1) ed il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) sono conosciuti per a vere un ruolo importante in diversi aspetti della fisiologia muscolare, tra cui la rigenerazione ed il metabolismo muscolare. I microrna giocano un importante ruolo nella regolazione dell espressione genica, inoltre contribuiscono significativamente allo sviluppo e nella rigenerazione dei tessuti. Molti microrna, inclusi microrna specifici muscolari, i cosiddetti myomers, hanno dimostrato di regolare la funzione muscolare. Il lavoro presentato in questa tesi si concentra sul ruolo del microrna-29a, nella mediazione delle funzioni fisiologiche di fattori di crescita solubili, come l ormone della crescita (GH) ed il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF). Il Capitolo I fornisce un'ampia introduzione sulla fisiologia del muscolo scheletrico (sezione 1) e la funzione dei microrna in relazione al muscolo scheletrico (sezione 2). All'interno di questo capitolo sono trattati diversi aspetti riguardanti la biologia del muscolo scheletrico: la biologia delle cellule satelliti, i marcatori di sviluppo muscolare, il ruolo dei fattori di crescita, aspetti del metabolismo muscolare e la fisiopatologia del diabete di tipo 2. Il Capitolo II presenta il nostro studio sul ruolo dei microrna nella mediazione di segnale FGF per istruire le cellule satelliti a proliferare e mantenere il loro stato uncommitted. Si è potuto dimostrare che MiR-29a viene upregulated da FGF nei progenitori miogenici sia in vitro che in vivo. Abbiamo dimostrato che la delezione di mir-29 in mioblasti primari (in vitro) o progenitori miogenici (in vivo) diminuisce la proliferazione e porta a differenziazione prematura. La delezione in vivo di mir-29a diminuisce la rigenerazione muscolare, indotta da lesioni ed esercizio fisico. I muscoli rigeneranti di topi Knock out per mir-29a sono caratterizzati da una maggiore fibrosi e da una massa muscolare ridotta. Questo fenotipo era presente ancora dopo 4 settimane di rigenerazione, ossia ad un punto dove il muscolo di topi normali è già rigenerato completamente. Il capitolo III presenta il nostro studio sul ruolo dei microrna sulla resistenza all'insulina del muscolo scheletrico mediata dall ormone della crescita (GH). Abbiamo dimostrato, che l ormone della v

5 SOMMARIO crescita (GH) downregulates mir-29a nel muscolo scheletrico in pazienti umani e topi che non producono l ormone della crescita. Questo effetto è mediato da IGF1. Abbiamo inoltre scoperto che mir-29a è l'unico mirna a correlare con la sensibilità all'insulina in pazienti umani. Inoltre, la downregualtion di mirna-29 causa l'induzione dei suoi targets, associati a fibrosi dei tessuti e la resistenza all'insulina. Nel capitolo IV sono descritti i materiali ed i metodi utilizzati. Nel complesso, i nostri risultati rilevano l importanza di mir-29a per diversi aspetti della fisiologia muscolare, come il controllo della funzione delle cellule miogeniche progenitrici durante la rigenerazione muscolare ed il controllo sulla resistenza all'insulina nel tessuto muscolare adulto. Tuttavia, sono necessarie nuove ricerche per scoprire ulteriori dettagli riguardante il funzionamento di mir-29a nel muscolo scheletrico, in modo da poter sviluppare approcci terapeutici. vi