Journal club 12 giugno 2012 Dott.ssa Livia Bernardi Biologo genetista Centro Regionale di Neurogenetica Laboratorio di Genetica Formale e Molecolare

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Severina Vacca
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1 Journal club 12 giugno 2012 Dott.ssa Livia Bernardi Biologo genetista Centro Regionale di Neurogenetica Laboratorio di Genetica Formale e Molecolare

INTRODUZIONE (1) La malattia di Alzheimer è caratterizzata dalla presenza di betaamiloide (Aβ) extracellulare in placche e da «tangle» di tau citoplasmatica, oltre che da perdita di neuroni in

2 INTRODUZIONE (1) La malattia di Alzheimer è caratterizzata dalla presenza di betaamiloide (Aβ) extracellulare in placche e da «tangle» di tau citoplasmatica, oltre che da perdita di neuroni in regioni specifiche del cervello. La connessione fra questi eventi non è ancora chiara, anche se è stato proposto che la formazione delle placche preceda quella delle «tangle» che, a loro volta, precedono la morte cellulare (Hardy and Allsop, 1991; Hardy and Higgins, 1992). MA: le placche non sono necessarie per la progressione della malattia e possono essere presenti correlate a normale invecchiamento. Inoltre, la Aβ solubile sembra essere più correlata alla malattia rispetto a quella insolubile delle placche.

3 INTRODUZIONE (2) E stato suggerito che il pathway fra Aβ e tau sia lineare nelle forme di Alzheimer ad esordio precoce, e che sia duplice nell Alzheimer ad esordio tardivo (Small and Duff, 2008). Per esaminare l ordine esatto degli eventi nella malattia l ideale è prevenire la formazione delle placche di Aβ e poi osservare se si formano le «tangle» o no. Procedure sperimentali già effettuate: immunizzazione alla Aβ in modello animale (topo) (porta a rimozione di aggregati iperfosforilati tau iniziali, ma non tardivi, Oddo et al., 2004) e in trial clinici (non c è riduzione di aggregati tau in regioni con riduzione delle placche di Aβ, Nicoll et al., 2003).

4 INTRODUZIONE (3) Il modello qui applicato va ad osservare l effetto di una aumentata rimozione di Aβ modificando la percentuale di Aβ solubile. Così, è possibile capire se il pathway fra Aβ e tau è un evento lineare o duplice. Se lineare: l aumento della rimozione di Aβ ridurrà la formazione di aggregati tau. Se duplice, l aumento della rimozione di Aβ non avrà effetti sulla formazione di aggregati tau. Terza possibilità: un pathway complesso, in cui Aβ non avrà un effetto lineare, diretto sugli aggregati tau, ma li può influenzare con effetti indiretti.

6 METODI (1) La metodologia descritta in questo articolo si basa sull applicazione di un modello matematico in grado di simulare cosa avviene in un sistema specificando i componenti molecolari del sistema e le interazioni fra i diversi componenti. Il modello si chiama Systems Biology Markup Language (SBML), esiste in formato leggibile al computer, ed è in grado di rappresentare reazioni e network biochimici. Questi modelli sono molto utilizzati dalla comunità scientifica e sono disponibili su web su BASIS website ( e su Biomodel database ( In particolare, questo modello utilizza un metodo di simulazione stocastico basato sull algoritmo di Gillespie (es. simulazioni numeriche basate sul campionamento dell istante in cui avviene una reazione).

7 METODI (2) MODELLO DI NETWORK CON INTERAZIONI p53 e GSK3β (1) P53 attiva la riparazione del DNA danneggiato (se il DNA è riparabile), inducendo la trascrizione di geni riparatori del DNA come GADD45; in seguito a danni del DNA p53 viene fosforilata e in tale forma può agire come fattore di trascrizione, migra nel nucleo, si lega a p21 inducendone la trascrizione e portando così al blocco del ciclo cellulare inibendo il complesso D/CDK4; può dare inizio all apoptosi, inducendo la trascrizione di BAX, nel caso il danno al DNA sia irreparabile; se il DNA viene riparato, p53 viene degradata via MDM2 e c'è la ripresa del ciclo cellulare. GSK3β (GLICOGENO SINTASI KINASI-3β) La sua attività porta a iperfosforilazione della proteina tau ed è responsabile dell aumentata produzione di Aβ (Sofola et al., 2010); Aβ provoca aumento dei ROS (radicali liberi Ossigeno) e aumenta la trascrizione di p53.

8 METODI (3) MODELLO DI NETWORK CON INTERAZIONI p53 e GSK3β (2) Danno sul DNA Elevati livelli di p53 P53 si lega a GSK3 Aumentata attività di entrambe le proteine Condizioni normali cellula p53 si lega alla ligasi Mdm2 ed è bersaglio per la degradazione (bassi livelli di p53) Cellula sotto stress + danno al DNA p53 viene fosforilata (GSK3), non lega Mdm2 e non viene degradata (alti livelli di p53 e aumento della sua fosforilazione)

9 RISULTATI (1) NORMALI LIVELLI DI RIMOZIONE DI Aβ Una certa % di cellule non accumula né placche, né tangle fino a 12 giorni.

10 RISULTATI (2) NORMALI LIVELLI DI RIMOZIONE DI Aβ Se c è danno al DNA si formano sia placche che tangle per attivazione di p53, GSK3 e fosforilazione di tau. Inoltre, l attivazione di p53 e GSK3 porta ad aumento di Aβ che forma le placche. Le tangle di tau precedono le placche di Aβ, facendo ipotizzare che vengano formate in due processi indipendenti. Aumento di Aβ aumentano ROS aumenta il danno attivazione di p53 ciclo.

11 RISULTATI (3) AUMENTATA RIMOZIONE DI Aβ di due ordini di grandezza DAL GIORNO 0 Si previene l accumulo di placche e tangle, p53 rimane bassa anche dopo 12 giorni.

12 RISULTATI (4) AUMENTATA RIMOZIONE DI Aβ A TEMPI DIVERSI (2, 4 GIORNI) L aumento della rimozione di Aβ precocemente (fino al 4 giorno) porta alla non formazione di placche, formazione di meno tangle e livelli bassi di p53.

RISULTATI (5) AUMENTATA RIMOZIONE DI Aβ A TEMPI DIVERSI (6, 8 GIORNI) L aumento della rimozione di Aβ dal 6 giorno in poi porta a livelli di placche simili a quelli visti senza intervento, ma a

13 RISULTATI (5) AUMENTATA RIMOZIONE DI Aβ A TEMPI DIVERSI (6, 8 GIORNI) L aumento della rimozione di Aβ dal 6 giorno in poi porta a livelli di placche simili a quelli visti senza intervento, ma a livelli di tangle maggiori che senza intervento. Questo è dovuto alla formazione di monomeri e oligomeri di Aβ prima dell intervento, che portano ad aumento di ROS, attivazione di GSK3 e aumentata fosforilazione di tau che poi va a formare le tangle. Basta un piccolo aumento di monomeri e oligomeri di Aβ per aumentare i ROS che a loro volta vanno ad attivare p53.

14 RISULTATI (6) INIBIZIONE DI PRODUZIONE DI ROS VIA Aβ (AUMENTATA RIMOZIONE DI Aβ AL GIORNO 8 E SETTANDO A 0 IL PARAMETRO PRODUZIONE DI ROS Aβ-MEDIATA) Dopo 12 giorni tutte le molecole (ad eccezione di p53) sono prossime allo 0. Il modello predice che questo intervento previene del tutto il danno al DNA, l aumento di p53, l aumento dell attività di GSK3 e la formazione di placche e tangle con risultati simili alla aumentata rimozione di Aβ al giorno 0).

15 RISULTATI (7) INIBIZIONE DI LEGAME GSK3/p53 (SETTANDO IL PARAMETRO LEGAME GSK3/P53 a 0 e aumentando la rimozione della Aβ al giorno 8 con ripresa produzione di ROS Aβ-mediata) Il modello predice che questo intervento previene la formazione di placche e tangle, anche se i livelli di p53 aumentano durante la simulazione. Quindi, la rimozione di Aβ in tempi tardivi può avere effetti SOLO con interventi aggiuntivi, come la riduzione dei livelli di ROS o la prevenzione dell attivazione di GSK3.

16 RISULTATI (8) EFFETTI DELL IMMUNIZZAZIONE DI Aβ SULLA PERDITA NEURONALE La morte neuronale non è inclusa espressamente nel modello, ma si può utilizzare il livello soglia di p53 che dà il via all apoptosi con simulazioni di livelli diversi di p53. Si considera che le cellule comincino a morire quando viene superata la soglia. Il modello predice che le cellule restano vitali e non muoiono se la rimozione di Aβ avviene precocemente e che rimandare la rimozione aumenta progressivamente la percentuale di cellule che vanno a morire. Quindi, la rimozione di Aβ deve avvenire precocemente, prima che si verifichi qualunque accumulo di Aβ.

17 DISCUSSIONE (1) PATHWAY LINEARE, DUPLICE, O.? PATHWAY DUPLICE? NO, perché se la rimozione di Aβ avviene in stadi precoci, c è sia una diminuzione di placche che di tangle (rimozione di Aβ ridotti ROS ridotto danno DNA bassa attività p53 bassa attività GSK3 ridotta fosforilazione di tau.) PATHWAY LINEARE? NO, perché se la rimozione di Aβ avviene in stadi tardivi, c è una diminuzione di placche MA NON di tangle. PATHWAY COMPLESSO!!

19 DISCUSSIONE (2) PATHWAY COMPLESSO!! Placche e tangle si formano indipendentemente per eventi a monte, ma la formazione di tangle aumenta in presenza di Aβ, attraverso l azione dei ROS, p53 e GSk3.

CONCLUSIONI (1) FORME FAMILIARI DI AD: VERA l ipotesi della cascata dell amiloide, quando il ciclo inizia con aumentata produzione di Aβ dovuta alle mutazioni nei geni che coinvolgono la

20 CONCLUSIONI (1) FORME FAMILIARI DI AD: VERA l ipotesi della cascata dell amiloide, quando il ciclo inizia con aumentata produzione di Aβ dovuta alle mutazioni nei geni che coinvolgono la processazione del precursore della Aβ. In questo caso il ciclo inizia con la Aβ e porta ad aumento dei ROS, danno al DNA, aumentati livelli di p53, aumentata attività di GSK3 e iperfosforilazione della tau (tangle) secondo un pathway lineare. FORME SPORADICHE DI AD: VERA l ipotesi del pathway complesso, che spiega la presenza della tangle prima o in assenza delle placche, quando il ciclo inizia dalla aumentata attività di GSK3 o dai ROS o da p53.

21 CONCLUSIONI (2) LIMITAZIONI DELLO STUDIO Il modello matematico è una semplificazione delle complicate reazioni biochimiche e biomolecolari che avvengono in natura, ma può essere esteso ad includere altri dettagli nel sistema SBML (esempio azione dei mitocondri, molecole chaperon di GSK3 come Hsp90, azione del pathway dell insulina, pathway di segnale di wnt, e tanti altri).

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