Remineralizzazione dello smalto esposto all azione erosiva delle bevande acide

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1 Ricevuto: 17 luglio 2009 Accettato: 4 settembre 2009 Disponibile online: 31 dicembre 2009 Disponibile online su C. Poggio*, M. Lombardini, A. Dagna, F. Porro, M. Chiesa Insegnamento di Odontoiatria Restaurativa, Dipartimento di Discipline Odontostomatologiche Silvio Palazzi, Università degli Studi di Pavia Remineralizzazione dello smalto esposto all azione erosiva delle bevande acide Conservativa Remineralization of enamel exposed to the erosive action of acid soft drinks Riassunto Obiettivi: Scopo di questo studio è stato valutare l efficacia di una crema a base di caseino-fosfopeptidi (CPP-ACP) nel favorire la remineralizzazione delle superfici dentarie prodotta dalle bevande acide con microscopio a forza atomica (AFM). Materiali e metodi: Sono stati utilizzati 24 incisivi centrali umani, suddivisi in quattro gruppi di 6 campioni ciascuno; i denti dei quattro gruppi sono stati esposti all azione erosiva di due bevande acide (Coca-Cola e Gatorade) per 10 minuti, due volte al giorno, per due settimane. Per ogni bevanda, ogni giorno, ai campioni di due gruppi è stata applicata la crema CPP-ACP per 10 minuti. I campioni sono stati osservati con AFM. Risultati: Tutti i campioni hanno dimostrato un incremento dei valori di ruvidità di superficie dopo esposizione alle bevande. Nei campioni trattati con la pasta CPP-ACP si è osservata una riduzione significativa dei valori di ruvidità (p < 0,01). Conclusioni: Questo studio in vitro ha dimostrato che l uso della crema CPP-ACP è in grado di favorire la remineralizzazione dello smalto. ß 2010 Elsevier Srl. Tutti i diritti riservati. Abstract Objectives: Aim of this in vitro study was to evaluate the effect of a calcium-phosphate based (CPP-ACP) paste in remineralisation of enamel surfaces eroded by acid soft drinks by atomic force microscopy (AFM). Materials and methods: Twenty-four human caries-free central incisors were randomly and equally divided into four groups; teeth were exposed to the erosive action of two different acid soft drinks (Coca Cola and Gatorade) for 10 minutes twice a day for two weeks. After the second exposure, the teeth of two groups were covered with CPP-ACP paste for 10 minutes every day. Then, the samples were observed under AFM. Results: All samples revealed increased values of surface roughness after exposure to acid soft drinks. Samples treated with CPP-ACP paste showed a significative reduction of roughness values (p < 0,01). Conclusions: This study showed that acid soft drinks could erode tooth enamel surface; the use of CPP-ACP paste can enhance enamel remineralization. ß 2010 Elsevier Srl. All rights reserved. Parole chiave: Bevande acide, Caseino-fosfopeptidi (CPP-ACP), Erosione, Remineralizzazione, Smalto Keywords: Acid soft drinks, Calcium-phosphate (CCP-ACP), Erosion, Remineralisation, Enamel Introduzione L erosione delle superfici dentali può essere definita come la dissoluzione chimica dei tessuti duri del dente a opera di acidi, * Autore di riferimento: Università degli Studi di Pavia - piazzale Golgi Pavia. c.poggio@unipv.it (C. Poggio) /$ - see front matter ß 2010 Elsevier Srl. Tutti i diritti riservati /j.pad Prevenzione & Assistenza Dentale 2010;36:51-56 senza il coinvolgimento di batteri e microrganismi patogeni [1,2]. Nell ambiente orale, i tessuti dentari vanno incontro a continui processi di demineralizzazione e remineralizzazione; se questo equilibrio viene alterato, la demineralizzazione porterà a un progressivo deterioramento delle superfici dentali [3,4]. Gli acidi responsabili dei processi erosivi possono essere di origine estrinseca (derivanti da dieta, cure mediche, esposizioni legate all attività lavorativa e stili di vita) [5] o di origine 51

2 C. Poggio et al. Prevenzione & Assistenza Dentale 2010;36:51-56 intrinseca (derivanti da succo gastrico in pazienti con problemi di reflusso gastroesofageo, anoressia, bulimia oppure prodotti da microrganismi acidogeni durante la metabolizzazione degli zuccheri). L incidenza dell erosione dentale è in continua crescita e rispecchia il diffuso consumo di bevande acide, quali succhi di frutta, bevande gasate, vino e sports drink [4,6]. La gravità dei fenomeni erosivi è correlata a molti fattori, quali la quantità complessiva di acidi contenuti nelle bevande, la frequenza di assunzione e le modalità di contatto tra l acido e i denti: il mantenimento prolungato in bocca protrae l esposizione dei denti all azione degli acidi, aumentando in tal modo il rischio di erosione. L erosione delle superfici dentali è anche legata all efficacia dei meccanismi di protezione dell ambiente orale, come ad esempio la composizione della saliva, la sua capacità tampone e l anatomia individuale dei denti [1,7]. La saliva, infatti, svolge un importante ruolo protettivo, che si esplica attraverso differenti meccanismi: diluizione e allontanamento delle sostanze erosive, neutralizzazione e tamponamento degli acidi e mantenimento di uno stato di sovrasaturazione in prossimità della superficie dei denti grazie al suo contenuto di calcio e fosfati. La saliva, inoltre, contribuisce a mantenere il ph del cavo orale intorno a un valore costante di circa 5,5, neutralizzando gli acidi (sia intrinseci sia estrinseci) e contrastando l eccessiva riduzione del ph della bocca (a un ph < 5,5 inizia il processo di demineralizzazione per la solubilizzazione dei cristalli di idrossiapatite dello smalto) [1,5]. L esposizione agli acidi determina un rammollimento temporaneo dello smalto e della dentina esposta per una profondità di alcuni micron, rendendoli altamente suscettibili all usura prodotta dalle successive manovre di igiene orale (effetto abrasivo dello spazzolamento dentale e dei dentifrici) [1,5]. Il latte e i suoi derivati, invece, hanno dimostrato proprietà anticariogene: tale attività sembra essere legata alla fosfoproteina caseina e alla presenza di ioni liberi di calcio e fosfato [8]. I fosfopeptidi della caseina (CPP) contengono una sequenza Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu con una spiccata capacità di stabilizzare il fosfato di calcio amorfo (ACP) in soluzione; questo favorisce la formazione di piccoli gruppi CPP-ACP che non hanno una grandezza tale da formare cristalli e precipitare come fosfato di calcio [9]. In modelli sperimentali di placca batterica colonizzata da streptococchi, il complesso CPP-ACP si lega alla placca, creando una riserva di calcio e favorendo la diffusione lenta di calcio libero: questa azione può ridurre la perdita di tessuto mineralizzato durante un processo carioso [10,11]. In uno studio clinico di Shen et al. [12] del 2001, una gomma da masticare senza zucchero contenente CPP-ACP ha dimostrato capacità di remineralizzazione delle lesioni superficiali dello smalto. Lo scopo della presente ricerca in vitro è stato di valutare l efficacia di una pasta a base di CPP-ACP nel prevenire l erosione dello smalto dentario prodotta da differenti bevande acide utilizzando il microscopio a forza atomica (AFM). In letteratura, i cambiamenti della struttura dei denti causati da fattori estrinseci sono solitamente studiati usando il microscopio elettronico a scansione (SEM): questo metodo richiede una preparazione specifica e una disidratazione dei campioni che può alterarne le condizioni [13]. Nella presente ricerca è stato utilizzato il microscopio a forza atomica, che richiede una preparazione minima dei campioni ed è in grado di fornire immagini a elevata risoluzione fornendo un immagine molto dettagliata [14,15]. Materiali e metodi Preparazione dei campioni di smalto Sono stati utilizzati 24 incisivi centrali umani estratti per motivi parodontali, privi di carie e di difetti dello smalto. Dopo l estrazione, i denti sono stati disinfettati in una soluzione di ipoclorito di sodio al 5% per 24 ore [13] e conservati in soluzione fisiologica per l intera durata dell esperimento. I denti sono quindi stati sezionati longitudinalmente con una fresa diamantata ad alta velocità sotto irrigazione, in modo da isolare la superficie vestibolare della corona. I campioni sono quindi stati posizionati in stampi di teflon (di dimensioni mm) e incorporati in resina epossidica, lasciando priva di resina solo la superficie vestibolare [16]. Metà della superficie vestibolare di ciascun campione è stata successivamente ricoperta con due strati di vernice per prevenire il contatto con le bevande. I campioni così allestiti sono stati suddivisi in quattro gruppi di sei. Sono quindi state scelte due bevande acide di largo consumo: un soft drink (Coca Cola, The Coca Cola Company, Italia) e uno sports drink (Gatorade al limone, Pepsico Beverages Srl, Italia). Sono stati misurati il ph a 20 8C, la capacità tampone, la concentrazione di calcio e quella di fosfato. Tutte le misure sono state effettuate tre volte ciascuna e sono stati poi calcolati ivalorimedi(tabella I). I campioni sono stati esposti all azione erosiva delle bevande alla temperatura di 20 8C per 10 minuti, due volte al giorno per due settimane [3], come segue: Gruppi 1 e 2: Coca Cola Gruppi 3 e 4: Gatorade. I campioni dei gruppi 2 e 4, dopo ogni immersione nelle bevande, sono stati lavati con acqua distillata e ricoperti con una crema a base di CPP-ACP per 10 minuti, rispettando le istruzioni del produttore. Al termine di ogni applicazione la crema è stata rimossa lavando la superficie dello smalto con acqua distillata e i campioni sono stati nuovamente immersi in soluzione fisiologica. Il prodotto a base di CPP-ACP utilizzato in questo studio è Tooth Mousse (GC Corp., Tokyo, Giappone), Tabella I Proprietà chimiche delle bevande utilizzate. Bevanda ph Capacità tampone PO 4 (mg/l) Ca (mg/l) Coca Cola 2,44 0, ,7 20,83 Gatorade 3,23 0, ,31 19,8 52

3 Remineralizzazione dello smalto esposto all azione erosiva delle bevande acide Tabella II Valori medi di ruvidità e profondità delle cavità. Gruppo Esposizione a bevande acide R rms (mm) Depressioni (mm) 1 Coca Cola 1a non esposto 0,05 0,01 1b esposto 0,26 0,04 0,61 0,21 2 Coca Cola + CPP-ACP 2a non esposto 0,06 0,02 2b esposto 0,14 0,02 0,19 0,09 3 Gatorade 3a non esposto 0,12 0,03 3b esposto 0,39 0,04 0,82 0,19 4 Gatorade + CPP-ACP 4a non esposto 0,07 0,01 4b esposto 0,29 0,02 0,26 0,07 una crema a base di acqua e di Recaldent, sostanza contenente la fosfoproteina caseina. Questa crema ha la capacità di legarsi all idrossiapatite naturale dello smalto e riparare le cavità prodotte dall usura meccanica e dagli agenti chimici, con lo scopo di ricostruire tessuti che da soli non si possono rigenerare. La capacità remineralizzante della sostanza è tanto migliore quanto più alto è il livello di ioni di calcio e fosfato liberi stabilizzati dal CPP. Il CPP, stabilizzando calcio e fosfato amorfi in soluzione, mantiene un alta concentrazione di questi ioni sulla superficie delle erosioni, aumentando il potenziale di remineralizzazione. Prima dell osservazione ultrastrutturale della superficie dello smalto tramite AFM, la vernice applicata inizialmente è stata rimossa dai campioni con un solvente a base di acetone. Analisi con AFM È stato utilizzato un microscopio a forza atomica Nanoscope III Digital (Veeco Digital Instruments, NY, USA), attrezzato con uno scanner piezoelettrico che è in grado di coprire un area di mm 2 con un range di 7 mm sull asse Z. Sono state realizzate scansioni di dimensioni mm 2 e70 70 mm 2 con il metodo del contatto (C-AFM). Il quadrato della ruvidità della superficie delle radici (R rms )èstato ottenuto dalle analisi con AFM, considerando per ogni campione almeno 10 differenti scansioni di aree di mm 2 con una risoluzione di pixel. In ogni immagine sono state fatte precise misurazioni. R rms è stato definito come la deviazione standard media: sffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi P N n¼1ð R rms ¼ z n z Þ 2 N 1 dove z è l altezza media e N è il numero totale dei punti. Dalle analisi dei profili di altezza è stato possibile stimare le cavità scavate dai processi erosivi sulla superficie dello smalto. I dati sono stati ottenuti unendo almeno 20 punti selezionati dell immagine. Analisi statistica Le differenze dei valori di R rms tra i gruppi sono state analizzate mediante test ANOVA. Risultati La tabella 2 riporta i valori di R rms e la profondità massima delle cavità prodotte dal processo di demineralizzazione. In tutti i gruppi si è osservato un incremento statisticamente significativo (p < 0,01) dei valori di ruvidità della superficie dopo esposizione alle bevande. Confrontando i gruppi 1 e 2 e i gruppi 3 e 4, si è rilevata un importante riduzione dei valori di R rms nei campioni trattati con la crema a base di CPP-ACP: questo suggerisce che il trattamento con tale prodotto riduce la demineralizzazione dello smalto. Le figure 1 e 3 mostrano immagini in 3D eseguite con AFM delle superfici di smalto non esposte alla Coca Cola (in quanto protette dalla vernice): le superfici non trattate appaiono discretamente lisce, eccetto che per alcune graffiature. Le figure 2 e 4 mostrano immagini delle superfici di smalto degli stessi campioni esposte all azione acida della Coca Cola. Nella figura 2 si osserva un incremento importante di ruvidità per perdita di materiale dalla superficie: la morfologia dello smalto richiama una tipica struttura prismatica, i cui prismi misurano 3-5 mm; il processo di corrosione coinvolge soprattutto le aree interne dei prismi, creando una struttura a nido d ape. La figura 4 mostra la superficie dello smalto esposta all azione della Coca Cola e successivamente trattata con la crema in esame: l erosione appare sostanzialmente riparata, con le cavità quasi totalmente riempite e un sostanziale decremento della ruvidità superficiale; la superficie mostra ancora una struttura prismatica, ma il profilo delle cavità è basso e simile a quello dei campioni prima dell esposizione. L esposizione dei denti all azione erosiva del Gatorade ha fornito quadri analoghi (figg. 5 8). Discussione L AFM è uno strumento utile per studiare la superficie dello smalto dentale [13]: esso garantisce alle immagini grande contrasto e alta risoluzione. Nel 1999, Hegedus et al. [14] hanno utilizzato l AFM per studiare gli effetti degli agenti sbiancanti sullo smalto: gli autori sottolineano che, in contrasto con altri studi che si sono serviti del SEM, l AFM consente di osservare 53

4 C. Poggio et al. Prevenzione & Assistenza Dentale 2010;36:51-56 Figura 1. Immagine in 3D con AFM (area della scansione mm 2 ): smalto non esposto a Coca Cola (campione del sottogruppo 1a). Figura 4. Immagine in 3D con AFM (area della scansione mm 2 ): smalto dopo l esposizione a Coca Cola e successivo trattamento con la crema a base di CPP-ACP (campione del sottogruppo 2b). Figura 2. Immagine in 3D con AFM (area della scansione mm 2 ): smalto dopo l esposizione a Coca Cola (campione del sottogruppo 1b). Figura 5. Immagine in 3D con AFM (area della scansione: mm 2 ): smalto non esposto a Gatorade (campione del sottogruppo 3a). Figura 3. Immagine in 3D con AFM (area della scansione mm 2 ): smalto non esposto a Coca Cola (campione del sottogruppo 2a). Figura 6. Immagine in 3D con AFM (area della scansione mm 2 ): smalto dopo l esposizione a Gatorade (campione del sottogruppo 3b). 54

5 Remineralizzazione dello smalto esposto all azione erosiva delle bevande acide Figura 7. Immagine in 3D con AFM (area della scansione mm 2 ): smalto non esposto a Gatorade (campione del sottogruppo 4a). presente studio, le bevande sono state mantenute a una temperatura costante di 20 8C. Bisogna inoltre tenere presente che l erosione può essere molto più lenta e meno marcata in vivo che in vitro, a causa dell effetto protettivo della saliva (effetto tampone) [10]. Nel 2003, Reynolds et al. [17] hanno dimostrato che la pasta CPP-ACP ha la funzione di legare l ACP alla superficie dentale e favorire la stabilizzazione degli ioni liberi di calcio e fosfato, permettendo così di mantenere uno stato di sovrasaturazione vicino alla superficie dei denti che arresti la demineralizzazione e favorisca la remineralizzazione. Altri studi hanno dimostrato come la presenza di CPP-ACP in un collutorio faccia aumentare notevolmente il livello di calcio e di ioni di fosfato inorganico nella placca sopragengivale attraverso il legame di CPP alla pellicola salivare e alla superficie dei batteri: nel biofilm creato dalla placca, Shen et al. [12] hanno dimostrato che CPP-ACP è in grado di remineralizzare le lesioni degli strati profondi dello smalto in situ; questi risultati sono stati confermati da Ijima et al. [8], che hanno dimostrato come le lesioni demineralizzate dello smalto siano più resistenti all azione degli acidi. Conclusioni Figura 8. Immagine in 3D con AFM (area della scansione mm 2 ): smalto dopo l esposizione a Gatorade e successivo trattamento con la crema a base di CPP-ACP (campione del sottogruppo 4b). superfici dentarie non disidratate e non appositamente preparate. Nel 2004, Lippert et al. [16] hanno usato l AFM per studiare la demineralizzazione e la remineralizzazione della superficie dello smalto in quanto in grado di fornire una misurazione molto precisa. Nel presente studio sono state valutate solo le facce vestibolari degli incisivi; la superficie non è stata alterata da nessun processo di lucidatura o di rifinitura. Per verificare l assenza di smalto aprismatico sono state osservate le superfici dentali con l AFM prima dell allestimento dei campioni e sono stati scelti solo i denti con superficie pulita, integra e con prismi. I campioni sono stati detersi con una soluzione di ipoclorito di sodio al 5% che non altera la superficie dello smalto [13]. Sono state scelte due delle più diffuse bevande acide presenti in commercio in analogia con altri lavori presenti in letteratura [9]; si tratta di alcune delle bevande con il più basso ph (<4) e una simile concentrazione di calcio. Come dimostrato in studi precedenti, esiste una chiara correlazione tra l erosione e la temperatura delle bevande [4]. Nel Il nostro studio in vitro con AFM conferma i dati della letteratura: le due bevande acide testate hanno mostrato un elevato potenziale erosivo nei confronti dello smalto. Con l utilizzo della crema a base di CPP-ACP la ruvidità delle superfici dei campioni si è ridotta significativamente e le cavità derivanti dai processi erosivi sono state quasi completamente riempite. È statopertantoconfermatoche l impiego di una crema contenente caseino-fosfopeptidi (CPP-ACP), dopo l esposizione dello smalto alle bevande acide, è in grado di favorire la remineralizzazione delle superfici dentali. Conflitto di interessi Gli autori dichiarano di non aver nessun conflitto di interessi. Finanziamento allo studio Gli autori dichiarano di non aver ricevuto finanziamenti istituzionali per il presente studio. Bibliografia 1. Hemingway CA, Parker DM, Addy M, Barbour ME. Erosion of enamel by non-carbonated soft drinks with and without toothbrushing abrasion. Brit Dent J 2006;201: Lussi A, Hellwig E, Zero D, Jaeggi T. Erosive tooth wear: diagnosis, risk factors and prevention. Amer J Dent 2006;19:

6 C. Poggio et al. Prevenzione & Assistenza Dentale 2010;36: Yamaguchi K, Miyazaki M, Takamizawa T, Inage H, Moore BK. Effect of CPP-ACP paste on mechanical properties of bovine enamel as determined by an ultrasonic device. J Dent 2006;34: Barbour ME, Finke M, Parker DM, Hughes JA, Allen GC, Addy M. The relationship between enamel softening and erosion caused by soft drinks at a range of temperatures. JDent2006;34: Lussi A, Jaeggi T, Zero D. The role of diet in aetiology of dental erosion. Caries Res 2004;38(Suppl. 1): Ramalingam L, Messer LB, Reynolds EC. Adding casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate to sports drinks to eliminate in vitro erosion. Ped Dent 2005;27: Barbour ME, Parker DM, Allen GC, Jandt KD. Human enamel erosion in costant composition citric acid solutions as a function of degree of saturation with respect to hydroxyapatite. J Or Rehab 2005;32: Ijima Y, Cai F, Shen P, Walker G, Reynolds C, Reynolds EC. Acid resistance of enamel subsurface lesions remineralized by a sugar-free chewing gum containing casein phosphopeptideamorphous calcium phosphate. Caries Res 2004;38: Reynolds EC. Remineralization of enamel subsurface lesions by casein phosphopeptide-stabilized calcium phosphate solutions. J Dent Res 1997;76: Rose RK. Effects of an anticariogenic casein phosphopeptide on calcium diffusion in streptococcal model dental plaques. Archives Oral Bio 2000;45: Schupbach P, Neeser JR, Golliard M, Rouvet M, Guggenheim B. Incorporation of caseinoglycomacropeptide and caseinophosphopeptide into the salivary pellicle inhibits adherence of mutans streptococci. J Dent Res 1996;75: Shen P, Cai F, Nowicki A, Vincent J, Reynolds EC. Remineralization of enamel subsurface lesions by sugar-free chewing gum containing casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate. J Dent Res 2001;80: Farina M, Schemmel A, Weissmuller G, Cruz R, Kachar B, Bisch PM. Atomic force microscopy study of tooth sufaces. J Struct Bio 1999;125: Hegedus C, Bistey T, Flora-Nagy E, Keszthelyi G, Jenei A. An atomic force microscopy study on the effect of bleaching agents on enamel surface. J Dent 1999;27: De-Deus G, Paciornik S, Pinho Mauricio MH, Prioli R. Real-time atomic force microscopy of root dentine during demineralization when subjected to chelating agents. Int End J 2006; 39: Lippert F, Parker DM, Jandt KD. In vitro demineralization/ remineralization cycles at human tooth enamel surfaces investigated by AFM and nanoindentation. J Colloid Interface Sci 2004;280: Reynolds EC, Cai F, Shen P, Walker GD. Retention in plaque and remineralization of enamel lesions by various forms of calcium in a mouthrinse or sugar-free chewing gum. J Dent Res 2003;82: