Perché considerare la struttura 3D di una proteina

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1 Modelling

2 Perché considerare la struttura 3D di una proteina Implicazioni in vari campi : biologia, evoluzione, biotecnologie, medicina, chimica farmaceutica... Metodi di studio della struttura di una proteina Metodi sperimentali: Xray, NMR Metodi computazionali: Da templato (C.M, F.R), senza Templato (N.F.) Vantaggi: Forniscono strutture affidabili Svantaggi: Non sempre applicabili Costosi e con tempi lunghi Vantaggi: Veloci Economici e sempre applicabili Svantaggi: Forniscono predizioni in cui il margine di errore può essere alto.

3 Structural Genomics Assegnare strutture 3D alle proteine codificate da genomi interi Grand goal : asssegnare una struttura ad ogni sequenza esistente. Combinazione di esperimenti & predizioni Structural genomics I metodi di predizione dovrebbero essere in grado di produrre strutture 3D per tutte le sequenze senza soluzione sperimentale Homology modelling & fold recognition 0 Sequenze Comparative Models Strutture

4 Metodi Computazionali: predizioni da templato. Comparative Modeling Fold Recognition Approccio Comune Individuazione struttura del templato o dei templati Allineamento del target con i templati. Costruzione modello. Valutazione del modello. Livello di predizione diverso

5 Risultati Ottenibili dai metodi Computazionali Necessaria una valutazione oggettiva dei metodi.

6 CASP: stato dell arte CASP Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction. CAFASP Critical Assessment of Fully Authomated Techniques for Protein Structure Prediction. Valutazione gruppi migliori Valutazione server automatici migliori Dall analisi dei metodi migliori e più innovativi partono nuovi filoni di ricerca per migliorare la capacità predittiva dei metodi bioinformatici.

7 CASP 6 (2004) Il problema del folding delle proteine è stato risolto??? Dichiarazioni contrastanti fino a circa dieci anni fa. Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction blind test che coinvolge tutti i principali gruppi, ripetuto ogni 2 anni CASP-6 (e CAFASP-4) nel 2004 Oltre 250 gruppi di predittori, oltre 85 targets Cerca di misurare lo stato dell arte ed i miglioramenti in tutti i maggiori settori della predizione di strutture proteiche (Stabilisce un ranking dei migliori gruppi)

8 CASP 6 Le principali categorie del CASP: Homology modelling Fold recognition Ab initio / novel folds Predizioni 1D Struttura secondaria Disordine Contatti domini Valutazione energetica modelli

9 T0137 Model Real Structure 135 residui. 40% di identità tra target e templato. L RMSD su tutta la struttura è di 0.98 A.

10 CASP4 Target T0100 Wrong Prediction from SAM-T99 Real Structure

11 COME COSTRUIRE UN MODELLO DELLA PROTEINA A PARTIRE DALLA SEQUENZA AMINOACIDICA

12 COME COSTRUIRE UN MODELLO DELLA PROTEINA A PARTIRE DALLA SEQUENZA AMINOACIDICA A seconda di quanto la nostra proteina è simile a qualche struttura già nota possiamo distinguere varie categorie per la predizione: 1. Comparative o homology modelling 2. Fold recognition e Threading 3. Ab initio

13 Target: Sequenza di cui si cerca la struttura Templato: Sequenza con struttura nota, stampo per il modello Comparative o homology modeling Ricerca in database Modello costruito da struttura omologa Fold recognition (Threading) Tenta di riconoscere omologie remote Approcci differenti che utilizzano struttura secondaria, profili di sequenza, funzioni energetiche specializzate,...

14 Target: Sequenza di cui si cerca la struttura Templato: Sequenza con struttura nota, stampo per il modello

15 Similarità di sequenza similarità di struttura? Coppie di proteine con struttura simile (Rost, 1999) Coppie di proteine con struttura diversa Osservazione: Se un allineamento contiene più del 30% ca. di residui identici, allora le strutture molto probabilmente apparterranno allo stesso fold. Per allineamenti più corti la soglia è più alta. Però: in alcuni casi proteine con meno del 20% di identità di sequenza appartengono alla stessa classe di fold ( twilight zone ).

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17 Ricerca in database Ricerca in database per trovare sequenze omologhe. Produce uno o più allineamenti tra le sequenze. Generalmente usato: PSI-BLAST I domini sono spesso identificabili dall allineamento multiplo.

18 Utilizzo di dati sperimentali Cosa si sa della proteina da modellare? Ci sono evidenze sperimentali utili? P.es. attività enzimatica, domini noti, residui funzionali, proteine omologhe, ecc. Queste ed altre informazioni si trovano nelle banche dati di sequenze, in particolare Swiss-Prot Pfam Prima di iniziare il modelling è buona norma raccogliere tutte le informazioni disponibili per semplificare il lavoro e validare al meglio il modello.

19 Il problema dei domìni Molte proteine sono composte da più di un dominio, che possono essere presenti in diverse combinazioni sia a livello di sequenza (p.es. in SWISS-PROT) che di struttura risolta con dati sperimentali (PDB). Molte strutture PDB contengono singoli domìni.

20 Comparative modelling

21 COME TROVARE UN TEMPLATO PER LA PROTEINA TARGET

22 PDB-BLAST (il protocollo più semplice di fold recognition ora utilizzato per trovare templati ovvi per il target) Il protocollo più semplice di fold recognition. Utilizza il fatto che PSI-BLAST permette di salvare il PSSM e ripartire con una nuova ricerca usando lo stesso PSSM. Per massimizzare l informazione su sequenze simili, si inizia con una ricerca contro NR (non-redundant, = tutte le sequenze note) per 4-5 iterazioni, costruendo un PSSM. Questo PSSM viene utilizzato per cercare strutture simili nel database PDBAA (= sequenze con struttura nota). Il metodo, chiamato PDB-BLAST, è molto più sensibile di PSI-BLAST contro PDBAA, dato il maggior numero di sequenze utilizzate per creare il PSSM. Allo stesso tempo permette una ricerca mirata di sequenze in PDB nel secondo passaggio. In pratica viene utilizzato per distinguere casi di fold recognition facili e difficili.

23 COME COSTRUIRE IL MODELLO

24 Dalla sequenza al modello

25 Comparative Modelling Schema classico: 1. Template 2. Alignment Raw model Loop modeling Side chain placement Refinement 3. Raw model (conserved regions) 4. Loop modeling (divergent regions) 5. Sidechain placement 6. Refinement

26 Scelta del templato Criteri: X-ray o NMR? flessibilità Qualità della struttura X-ray: Risoluzione e B- factor NMR: Numero di vincoli Similarità Percentuale di identità Punteggio dell allineamento X-ray Generalmente è preferibile utilizzare il templato più simile. A parità di similarità è buona norma, salvo alcune eccezzioni, scegliere la struttura X-ray con la risoluzione migliore. NMR

27 Allineamento delezione inserzione target templato Ricerca in database per trovare sequenze omologhe con struttura nota. Assegna le posizioni di residui equivalenti fra target e templato. Determina inserzioni e delezioni. L allineamento determina la qualità del modello che si sta costruendo. L allineamento di sequenza non è sempre ottimale per costruire i modelli. Generalmente usato: PSI-BLAST

28 Come migliorare l allineamento L allineamento detta la qualità del modello finale Errori commessi durante l allineamento non possono essere più corretti! problema: il migliore allineamento di sequenza spesso non è ottimale per la struttura Esperienza... Alcune buone regole: Mantenere la geometria di residui conservati Considerare la struttura secondaria Inserzioni e delezioni possono essere spostate Collar extension : è possibile estendere una -helix o -strand?

29 Conclusioni dal CASP6/CAFASP4 Non compatibile con legame peptidico Miglior allineameno fra sequenze Allineameno alternativo e subottimale Compatibile con legame peptidico