INGEZIM Gluten Quanti Test Guida all utilizzo

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Ruggero Deluca
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1 INGEZIM Gluten Quanti Test Guida all utilizzo

2 1 - INTRODUZIONE Il kit è basato su un saggio immunoenzimatico ELISA di tipo sandwich come dettato dal Codex Alimentarius. Ogni pozzetto è rivestito sul fondo dall anticorpo R5-Mendez, un monoclonale in grado di individuare un epitopo comune a gliadine, ordeine e secaline. R5 è l unico anticorpo ufficialmente riconosicuto dal Codex Alimentarius per la rilevazione di proteine del glutine. In pratica, quando un campione entra in contatto con i pozzetti della piastra, l anticorpo riconosce e lega le gliadine eventualmente presenti. Un anticorpo secondario coniugato alla perossidasi riconosce le gliadine precedentemente catturate dall anticorpo primario ed in presenza di un substrato sviluppa una reazione colorimetrica che è direttamente proporzionale alla quantità di gliadine presenti nel campione. Il contenuto di gliadine sarà determinato misurando la OD del campione e interpolando tale valore con una curva di calibrazione ottenuta tramite standard a concentrazione nota di gliadina. Il LOD del sistema è pari a 3 ppm di gliadina. 2 CONTENUTO DEL KIT Reagenti piastra da 96 pozzetti ricoperti con anticorpo Mab R5 Unità 1 Volume Controllo positivo (pronto all uso) 1 1,5 ml Controllo negativo (pronto all uso) 1 1,5 ml Punto di controllo (20X) ul Standard a concentrazione nota di gliadina - 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,12 ng/ml, 1,56 ng/ml - pronti all uso Anticorpo R5 coniugato con enzima HRP (pronto all uso) 5 1,5 ml 1 15 ml Tampone di estrazione (EB) pronto all uso ml Soluzione di lavaggio 25X (WB) 1 65 ml Tampone di diluizione 5X (DB) 1 65 ml Substrato (TMB) 1 15 ml Soluzione di Stop (H 2 SO 4 0,5M) 1 15 ml

3 3 - PRECAUZIONI Conservare il kit a 4 C Utilizzare tutti i reagenti dopo averli portati a temperatura ambiente (22 C-25 C) Non mescolare i reattivi di kit diversi anche se dello stesso lotto Evitare ogni contaminazione dei reattivi Non consumare o maneggiare alimenti mentre si maneggiano i reattivi Il reattivo di sviluppo (TMB) è sensibile alla luce, limitarne il più possibile l esposizione. La soluzione di stop è un acido forte, maneggiare con cura. 4 - PREPARAZIONE DEI REAGENTI WB - Soluzione di Lavaggio (Washing solution): Diluire una parte di WS in 24 parti di acqua deionizzata/distillata, la soluzione diluita è stabile se conservata a 4 C. DB Tampone di Diluizione (Dilution buffer): Diluire una parte di WS in 4 parti di acqua deionizzata/distillata, la soluzione diluita è stabile se conservata a 4 C. Anticorpo coniugato, Controlli interni, Standard sono forniti pronti all uso Punto di controllo: Diluire una parte di reagente in 19 parti di DB NOTA: Il Punto di Controllo è un controllo interno incluso nel kit per assicurare il corretto funzionamento del test, il suo utilizzo non è necessario, tuttavia è consigliato. 5 - LAVAGGI I lavaggi possono essere effettuati con sistemi automatici o manuali (pipette multicanale) in grado di dispensare 300 μl. Aggiungere 300 μl di WB ad ogni step di lavaggio evitando di lasciare i pozzetti a secco più del necessario. Al termine degli step di incubazione eliminare il contenuto dei pozzetti rovesciando rapidamente la piastra in modo da evitare eventuali cross-contaminazioni. Dopo l ultimo lavaggio asciugare accuratamente il liquido dai pozzetti e picchiettare energicamente per 3 volte la piastra capovolta su carta assorbente per eliminare ogni residuo.

4 6 - PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Le procedure di seguito riportate sono valide con l eccezione dei prodotti contenenti cioccolato per i quali è disponibile una procedura peculiare. Gli estratti sono stabili per 7 giorni a temperatura ambiente. o Estrazione di prodotti trattati termicamente o contenenti soia 1. pesare 250 mg di campione alimentare omogenato/macinato/liquido e trasferirlo in un tubo di polipropilene da 15 ml. 2. aggiungere 2,5 ml di EB 3. tappare il tubo e vortexare per 15 secondi. 4. Incubare i campioni a 50 C per 40 minuti o a temperatura ambiente (22-25 C) per 60 minuti. 5. Se il campione è stato riscaldato a 50 C lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. 6. Aprire il tubo ed aggiungere 7,5 ml di una soluzione di etanolo 80%. 7. Agitare/vortexare vigorosamente per 30 secondi 8. Incubare per 60 minuti a temperatura ambiente mantenendo i campioni in agitazione. Se possibile utilizzare un agitatore rotante. 9. Centrifugare per 10 a g (temperatura ambiente) e trasferire il surnatante in un tubo pulito. o Estrazione di prodotti non trattati termicamente e non contenenti soia 1. Pesare 250 mg di campione alimentare omogenato/macinato/liquido e trasferirlo in un tubo di polipropilene da 15 ml. 2. Aggiungere 10 ml di una soluzione di etanolo 60%. 3. Vortexare vigorosamente per 30 secondi 4. Incubare per 60 minuti a temperatura ambiente mantenendo i campioni in agitazione. Se possibile utilizzare un agitatore rotante. 5. Centrifugare per 10 a g a temperatura ambiente e trasferire il surnatante in un tubo pulito. o Estrazione di prodotti a base di cioccolato 1. Pesare 250 mg di campione alimentare omogenato/macinato/liquido e trasferirlo in un tubo di polipropilene da 15 ml. 2. Pesare 0,125 g di campione alimentare omogenato/macinato e trasferirlo in un tubo di polipropilene da 15 ml. 3. Pesare 0,05 g di PVP (Polyvinyl-pyrrolidone) e 0,125 g di Fish Gelatin e addizionarli al campione 4. Aggiungere 1,25 ml di Ingenasa Extraction Buffer. 5. Vortexare fino ad ottenere un composto omogeneo 6. Incubare il campione a 50 C per 40 minuti 7. Riportare il campione a temperatura ambiente.

5 8. Aggiungere 7,5 ml di una soluzione di etanolo 80%. 9. Incubare per 60 minuti a temperatura ambiente mantenendo i campioni in agitazione. Se possibile utilizzare un agitatore rotante. 10. Centrifugare per 10 a g (temperatura ambiente) e trasferire il surnatante in un tubo pulito. 11. Conservare l estratto a temperatura ambiente 7 - DILUIZIONE DEL CAMPIONE È necessario diluire il campione prima del saggio ELISA utilizzando il DB fornito col kit. es. per campioni con un contenuto in glutine stimato inferiore a 50 ppm eseguire le diluizioni 1:25 e 1:50. 1:25 = 960 ul di DB + 40 ul di campione 1:50 = 980 ul di DB + 20 ul di campione

6 8- ESECUZIONE DEL TEST 1. Caricare 100 μl di ciascun punto standard (possibilmente lavorando in duplicato) e 100 μl di campione opportunamente diluito ad uno o più pozzetti. Incubare per 60 a temperatura ambiente (22-25 C). 2. Svuotare per inversione la piastra ed eseguire 5 lavaggi con WB 3. Caricare 100 μl di coniugato R5-HRP ad ogni pozzetto ed incubare 60 a temperatura ambiente. 4. Svuotare per inversione la piastra ed eseguire 5 lavaggi con WB 5. Caricare 100 μl di substrato TMB per ciascun pozzetto ed incubare per 10 a temperatura ambiente coprendo I pozzetti con un foglio d alluminio, la soluzione assumerà un colore azzurro in presenza del target (gliadine). 6. Aggiungere 100 μl di Soluzione di Stop, la reazione provoca un viraggio da azzurro a giallo. 7. Misurare l assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore per piastre. 9- VALIDAZIONE DEL TEST Il test è da considerare valido quando la OD misurata per il controllo positivo è maggiore della OD ottenuta per lo standard 25 ng/ml e quando la OD del controllo negativo è inferiore a quella corrispondente al punto standard 1,56 ng/ml. Il punto di controllo, se utilizzato, interpolato sulla curva di calibrazione dovrebbe corrispondere a 40±8 ppm. 10- INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI La OD del campione è il risultato della media delle OD ottenute da ciascuna replica. Il grafico della curva di calibrazione è ottenuto inserendo sull asse X i valori medi di OD ottenuti per i 5 punti standard e sull asse delle Y il corrispondente quantitativo di gliadine in ng/ml. La concentrazione di gliadine del campione si ricava interpolando sulla curva i dati di OD ottenuti dal saggio. Il contenuto di glutine (ppm) del campione deve essere calcolato secondo la seguente formula: ppm di glutine = C x D x 2 x 40 / 1000 C: concentrazione di gliadine nel campione estrapolata dalla curva di calibrazione D: fattore di diluizione del campione 2: fattore di conversione da gliadine a glutine 40: fattore di diluizione applicato durante l estrazione del campione 1/1000: conversione da ng/ml a ppm. INFORMAZIONI AGGIUNTIVE è importante che i valori di OD dei campioni rientrino nella curva di calibrazione, questo al fine di una corretta interpretazione dei risultati. Nel caso il valore di OD del campione risulti leggermente al di sopra dello standard più concentrato (25 ng/ml) è possibile utilizzare il controllo positivo come ulteriore punto della curva (50 ng/ml).

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