FEP MISURA PROGETTO PILOTA: Tutela e Riproduzione del Riccio di Mare (Paracentrotus lividus) specie innovativa per l acquacoltura

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1 Algesiro srl FEP MISURA PROGETTO PILOTA: Tutela e Riproduzione del Riccio di Mare (Paracentrotus lividus) specie innovativa per l acquacoltura a cura di Nicola Zizzo e Michela Cariglia Progetto finanziato dall Unione Europea con il Fondo Europeo per la Pesca Misura 3.5 Progetti Pilota Art. 41 reg. CE 1198/2006

2 Algesiro srl FEP MISURA PROGETTO PILOTA: Tutela e Riproduzione del Riccio di Mare (Paracentrotus lividus) specie innovativa per l acquacoltura AA.VV a cura di Nicola Zizzo e Michela Cariglia Progetto finanziato dall Unione Europea con il Fondo Europeo per la Pesca Misura 3.5 Progetti Pilota Art. 41 reg. CE 1198/2006

3 Responsabile FEP 2007/2013 Regione Puglia Misura 3.5: Antonella Grandolfo - Regione Puglia Servizio Caccia e Pesca Responsabile Scientifico del progetto: Nicola Zizzo, Facoltà di Medicina Veterinaria - Università degli Studi di Bari Responsabile Aziendale del Progetto: Francesca Cariglia, Algesiro srl - Manfredonia Autori: Aiudi Giulio Albrizio Maria Cicirelli Vincenzo Di Summa Aldo Donno Fernando Gorgoni Paola Guaricci Antonio Ciro Laudadio Vito Passantino Giuseppe Patruno Rosa Tinelli Antonella Tufarelli Vincenzo A Maris Stella Vittoria nata tra un riccio e l altro Collaboratori: Annovi Giuseppe Conversano Pietro - Guardia di Finanza De Rinaldis Gianluca Gadaleta Claudia Leone Rosa Lopresti Giuseppe Maiorano Elisabetta Mario Giovannetti Coordinamento Michela Cariglia - Algesiro srl, Manfredonia Coordinamento delle attività in policoltura Alessandro Cariglia - Algesiro srl, Manfredonia

4 Il mare è un immenso deserto dove l uomo non è mai solo, perché sente fremere la vita ai suoi fianchi (Jules Verne)

5 Il progetto pilota: Tutela e Riproduzione del Riccio di Mare (Paracentrotus lividus) specie innovativa per l acquacoltura, rappresenta una innovazione importantissima nel campo dell acquacoltura. I dati tecnico-scientifici che hanno permesso di acquisire potranno fornire utili informazioni a valenza multipla sia per la migliore sostenibilità delle produzioni, anche per ciò che attiene l impatto ambientale, e sia per la riduzione della pressione di pesca sugli stock selvatici. Le varie figure scientifiche che, a vario titolo, hanno fornito il loro contributo tecnico hanno permesso di sviluppare tutti gli obiettivi specifici del progetto e hanno svolto un lavoro in piena e fattiva collaborazione. Il rapporto con le imprese coordinato dalla Algesiro srl ha dato origine ad una filiera di conoscenza e crescita che avrà sviluppi futuri. A conclusione della attività esprimo al prof. Zizzo, coordinatore, e a tutti i partecipanti al progetto la più viva soddisfazione per i brillanti risultati ottenuti e per gli spunti scientifici da utilizzare per future ricerche. Desidero, infine, ringraziare. l Area Politiche per lo Sviluppo Rurale della Regione Puglia per il supporto finanziario senza il quale l attività di ricerca non si sarebbe svolta. Valenzano (Bari), 1 Dicembre 2014 Prof. Canio Buonavoglia Direttore del Dipartimento di Medicina Veterinaria Università degli Studi di Bari

6 Quando il Prof. Zizzo ci ha proposto una ricerca sulla riproduzione dei ricci eravamo scettici. Le possibilità dell acquacoltura sono infinite, perché no? Esplorando l Adriatico e lo Ionio abbiamo scoperto che in Grecia e Croazia non li raccolgono neppure mentre in Puglia ed in Italia hanno un mercato ad alto valore aggiunto. E allora, perché non provare? A noi che del mare e dell acquacoltura abbiamo fatto la nostra vita è sembrata un opportunità. Sin dalle prime fasi di progettazione, il rigore scientifico dimostrato da tutti i ricercatori della Facoltà di Medicina Veterinaria - Dipartimento di Benessere Animale ha aiutato l azienda a costruire una metodologia. Andare di pari passo insieme, con tutte le difficoltà che un metodo da inventare ha in re ipsa, ha fatto crescere l intero sistema di schiuditoio ed ingrasso coordinato dall Algesiro srl sul Gargano. Al progetto hanno lavorato soprattutto i giovani e le giovani promesse che hanno scelto la natura, l ambiente e la buona tavola per inventarsi un mestiere. Il progetto ha generato 7 posti di lavoro in azienda di cui tre diventati contratti a tempo indeterminato, mentre quattro ricercatori hanno creato una start up per sviluppare mangimi. L applicazione in policoltura che nasceva dall esigenza pratica di mettere a mare in lanterna i piccoli di riccio mentre venivano realizzati contenitori ha consentito di scoprire che l inserimento in lanterna con le ostriche agevola la pulizia e la manutenzione migliorando le performance dell impianto a mare. La sperimentazione sulla dieta ha aperto qualche orizzonte e confermato il ruolo che l artemia salina svolge sui riproduttori qualsiasi essi siano. Ringraziamo la Regione Puglia - Servizio Caccia e Pesca per la fiducia accordata a questa azienda sostenendo la ricerca sulla tutela e riproduzione dei ricci. Una menzione particolare va all Ing. Gennaro Russo, alla Dott. Vito Imbrici, e alla D.ssa Antonella Grandolfo che ci hanno supportato nel percorso tecnico-amministrativo arricchendo il patrimonio di conoscenze della Algesiro srl e consentendo con la loro professionalità e levatura morale di crescere. Il sapore dei ricci lo lasciamo valutare a Voi! Michela, Alessandro e Francesca Cariglia Algesiro srl Manfredonia, 1 Dicembre 2014

7 Prefazione L esperienza svolta nella ideazione, gestione e realizzazione del progetto pilota Tutela e Riproduzione del Riccio di Mare (Paracentrotus lividus) specie innovativa per l acquacoltura dalla Algesiro srl di Manfredonia e della Facoltà di Medicina Veterinaria Dipartimento di Benessere Animale dell Università di Bari è un modello per sviluppare la filiera ittica e la collaborazione tra imprese e mondo della ricerca. Classificato al primo posto della graduatoria nella valutazione di merito, avendo colto il senso del bando ed i suoi obiettivi, il progetto è stato condotto con puntualità ed aggiornamento costante rispetto alle scoperte via via effettuate ed alle tecnologie applicate. L esperienza si colloca nelle buone pratiche che la Regione Puglia intende adottare e replicare perché il settore delle risorse ittiche possa crescere in maniera sostenibile e nel lungo periodo. L attenzione posta alla tutela dell ambiente e delle risorse partendo dalla richiesta di mercato del riccio di mare dimostra che è possibile progettare la gestione della filiera ittica bilanciando gli interventi tenendo conto della pluralità degli interessi e della qualità. Il protocollo sviluppato, primo al mondo, è replicabile in ogni angolo del pianeta e la funzione degli echinodermi, sia in allevamento sia in banchi naturali, contribuisce a tutelare l ecosistema. Con l auspicio che esperienze positive come questa possano replicarsi attivando rapporti virtuosi tra imprese, mondo della ricerca, istituzioni e ambiente per la crescita del territorio pugliese. Bari, 1 Dicembre 2014 Antonella Grandolfo Regione Puglia - Servizio Caccia e Pesca FEP Responsabile Misura Progetti Pilota

8 Indice 1 - INTRODUZIONE Criteri tassonomici Cenni di anatomia e fisiologia OBIETTIVI DEL PROGETTO ALLESTIMENTO IMPIANTO PER LA SPERIMENTAZIONE RACCOLTA RIPRODUTTORI - STABULAZIONE RIPRODUZIONE Determinazione stadio di maturazione Fasi della maturazione gonadica - Trattamento dei campioni Ovaio Testicoli Emissione STUDIO SULLA CONSERVABILITÀ A LUNGO TERMINE DI SEME DI RICCIO (Paracentrotus lividus) QUALITÀ NUTRIZIONALI ALIMENTAZIONE La meccanochimica della chemiotassi Scopo della Ricerca test (proteine animali vs proteine vegetali) test (addensante animale vs addensante vegetale) test (preparazione umida vs preparazione secca) PATOLOGIA POLICOLTURA CONCLUSIONI BIBLIOGRAFIA ICONOGRAFIA 55

9 1 - Introduzione La produzione acquicola dell Unione Europea nel 2010 è stata stimata sui 3,1 miliardi di Euro, con una produzione di 1,26 milioni di tonnellate, rappresentando circa il 2% della produzione mondiale. Il fabbisogno europeo di prodotti ittici è soddisfatto per il 10% dalla produzione proveniente dall acquacoltura, per il 25% dal pescato, per il 65% dalle importazioni da paesi terzi (per gran parte da attività di pesca). Lo sviluppo dell acquacoltura, sempre più attenta a garantire una maggiore resa e salubrità del prodotto, ha avuto negli ultimi decenni, grazie anche agli incentivi dell UE per il potenziamento del settore, un notevole incremento tecnologico e scientifico, tanto da prevedere che, nei prossimi anni si riuscirà a colmare il divario tra domanda e offerta del mercato (Pearce, 2010). Le nuove sfide dell acquacoltura sono rivolte verso protocolli sperimentali e innovativi, dedicati alle specie il cui allevamento è in grado di conciliare l interesse nei confronti dei prodotti allevati, con la sostenibilità delle produzioni, l impatto ambientale e la riduzione della pressione di pesca sugli stock selvatici. Il Paracentrotus lividus, più di altre specie innovative, rientra in questo contesto essendo in grado di coniugare le aspettative dell impresa, del mercato e dell ambiente. La ricerca nel campo dell allevamento dei ricci di mare si è prefissata alcuni obiettivi, quali: la messa a punto di tecniche di allevamento per sopperire alla richiesta di mercato, ormai diventata insufficiente, la riduzione dell antropizzazione e relativa salvaguardia delle aree marine oggetto di pesca e la riduzione del depauperamento degli stock naturali per overfishing; quest ultimo rappresenta una conseguenza dell azione di pescatori professionisti e dilettanti in acque costiere poco profonde e della pesca meccanizzata, che vede l impiego di attrezzi opportunamente modificati, già utilizzati per la pesca di molluschi lamellibranchi (Andre et al., 2002; Baron & Theatre, 2005; Guidetti, 2004; Tegner & Dayton, 2000). La parte edibile di un echinoide sono le gonadi, detta anche polpa di riccio, prelibato cibo in Asia, Nord e Sud America, Spagna, Grecia e Francia (Le Gall, 1990; Conad & Sloan, 1989); in Italia il prodotto è apprezzato soprattutto in regioni quali Campania, Puglia, Sardegna e Sicilia. Considerato un tempo prodotto di nicchia stagionale, limitato a pochi estimatori del prodotto fresco, oggi la richiesta di riccio di mare ha avuto un aumento sul mercato nazionale ed internazionale, anche per il riconoscimento delle caratteristiche nutrizionali: elevato contenuto proteico, basso contenuto di grassi e un buon contenuto di alcuni preziosi minerali, come il fosforo e il ferro. Il prodotto viene commercializzato, a seconda delle tradizioni gastronomiche dei vari Paesi, fresco, congelato, essiccato, salato, surgelato o cotto a vapore (Saito, 1992; Hagen, 1996 citata Grosjean, 2001). Il mercato globale è caratterizzato dal consumo preferenziale di determinate specifiche specie, a seconda dell area geografica analizzata: in Asia, Nord e Sud America lo Strongylocentrus droebachiensis; negli stati americani del nord-atlantico, il Cidaris tribuloides; l Evechinus chloroticus in Nuova Zelanda; lo Strongylocentrotus franciscanus e lo Strongylocentrotus purpuratus nelle coste del Pacifico degli Stati Uniti; lo Strongylocentrus intermedius in Giappone. Il mercato europeo consuma esclusivamente il Paracentrotus lividus, apprezzato specialmente dai Paesi che si affacciano sul Mar Mediterraneo, e lo Strongylocentrotus droebachiensis nel nord Europa. L Ir- 1

10 landa, il Portogallo e la Croazia sono da considerare Paesi esportatori, avendo un consumo interno quasi nullo (Boudoresque & Verlaque, 2007). Agatsuma (2010) e Keesing & Hall (1998) hanno condotto uno studio, evidenziando come la produzione mondiale sia cresciuta in pochi decenni, passando dalle tonnellate nel 1982 a un picco di tonnellate nel 1995, riconducibile all espansione della capacità di pesca di Cile, Canada e USA (Stati della California e del Maine). Pochi anni dopo, Andrew et al. (2002), evidenziò che in soli tre anni il pescato era diminuito del 23%, passando a tonnellate annue. Dati FAO del 2005 evidenziano come la produzione mondiale fosse ancora diminuita rispetto agli anni precedenti, di circa il 18%, arrivando a tonnellate annue. Tale diminuzione è da ricondurre alla riduzione delle catture dei due principali produttori: Cile e Stati Uniti. Il Giappone è l unico Paese a mantenere costante la sua produzione, con tonnellate medie annue dal 2000 al 2011 (dati FAO). Il Giappone, per il quale le gonadi di riccio costituiscono un ingrediente del tradizionale sushi, detiene il primato del consumo di ricci di mare con l 80% del pescato commerciale. Dal 2007 le importazioni del riccio di mare in Giappone sono aumentate del 300% (Pearce, 2010). I principali esportatori di gonadi di riccio, ad oggi, sono gli USA (soprattutto verso il Giappone), seguiti da Russia, Canada, Corea del Nord, Cile, Messico, Australia e Cina. In Europa, il maggior esportatore è la Francia, la cui produzione di Echinoidi vivi per anno si è progressivamente ridotta, passando da circa tonnellate degli anni 70 a tonnellate tra il 1980 e il 2000 (Ledireach, 1987; Le Gall, 1990; BIM, 2003) e 106 tonnellate annue nel 2013 ( I dati FAO del 2010 evidenziano come, per il prodotto fresco pescato il prezzo di vendita sia aumentato del 25% in dieci anni, a fronte di una produzione diminuita del 20%. Il prodotto allevato è entrato sul mercato agli inizi degli anni I dati FAO riportano come, dopo la forte oscillazione del prezzo nei primi anni, a partire dal 2003, il prezzo di vendita sia costantemente in crescita. La quantità allevata di P. lividus in Europa, dal 2010 in poi, è stimata intorno alle 2 tonnellate annue, dato dimezzato rispetto alle produzioni del periodo L allevamento di S. droebachiensis si è sviluppato a partire dal 2009, con produzione media annua di 47 tonnellate ( Allo stato attuale sono stati riscontrati diversi problemi che ostacolano un valido sistema di allevamento per il P. Lividus: performance di crescita; mortalità elevata dopo la metamorfosi; mortalità episodica nello stadio larvale; diversità di taglia degli individui all interno dello stesso lotto di produzione; identificazione di pattern di base delle preferenze di substrato dei ricci a diversi stadi di crescita; combinazione di parametri esogeni che influiscono e condizionano lo sviluppo come: temperatura, fotoperiodo, qualità e quantità del cibo, limiti di densità imposti dalle strutture di allevamento e ph dell acqua; alimentazione che, opportunamente studiata e calibrata in funzione delle esigenze, può dare una svolta alle tecniche di norma utilizzate. Infatti, l accrescimento del P. lividus è strettamente correlato alla somministrazione di particolari alimenti, che potrebbero influenzare la quantità del prodotto e ne migliorerebbero le qualità organolettiche. Le gonadi hanno un prezzo medio sul mercato giapponese, considerato il primo mercato mondiale, per il prodotto locale di alta qualità di 18,6 /kg e di 7,9 /kg per gli Echinoidi freschi importati. In Europa il prezzo varia da 4,5 /kg a 17,8 /kg; sul mercato al dettaglio, in Italia, si usa esprimere il prezzo per singolo esemplare, che può costare 0,50. Al mercato ittico di Barcellona, ad ottobre 2013, il prodotto fresco veniva venduto a 11 /kg. Il prezzo di gonadi trasformate può raggiungere i 150,00 /kg. Secondo vari autori le specie allevate sono: Strongylocentrotus intermedius (A. Agassiz), Mesocentrotus nudus (A. Agassiz), Hemicentrotus pulcherrimus (A. Agassiz), Pseudocentrotus depressus (A. Agassiz), Heliocidaris crassispina (A. Agassiz) e Tripneustes gratilla (Linnaeus), Strongylocentrotus droebachiensis (O. F. Müller), Mesocentrotus franciscanus (A. Agassiz), Loxechinus albus (Molina) (Fuji, 1967; Fuji & Kamura, 1970; Fernandez, 1996; Hagen, 1996; Kato, 1972; Sloan, 1985; Gonzalez et al., 1993; Lawrence et al., 1997 citato da Grosjean (2001)). L echinocoltura in Europa è ancora poco praticata; allevamenti di Strongylocentrotus droebachiensis sono presenti lungo le coste atlantiche, e recentemente in Italia è stato condotto un protocollo d allevamento sperimentale nel territorio siciliano, allo scopo di mettere a punto le migliori condizioni di sviluppo e allevamento di ricci di mare usando come specie il Paracentrotus lividus. 2 3

11 1.1 Criteri tassonomici Di seguito sarà esposto un breve excursus sui criteri tassonomici che identificano e classificano le varie specie appartenenti al phylum Echinodermata, con particolare attenzione alle specie edibili. Tale trattazione è esemplificata in Tabella 1. Regno Phylum Animalia Echinodermata Classe Echinoidea La classe Echinoidea (dal greco echinos: spina + oide: forma di) raggruppa organismi con simmetria raggiata pentamera allo stadio adulto, con corpo sferoidale, ovale o discoidale, protetto da un dermascheletro rigido formato da piastre munite di aculei e disposte in serie interambulacrali e ambulacrali, dotate di fori per il passaggio dei pedicelli, lato orale rivolto verso il basso, 2-5 gonadi. All interno di questa Classe si individuano due subclassi: la subclasse REGULARIA e la subclasse IRREGULARIA. La classe Echinoidea ha diffusione cosmopolita, delle circa mille specie esistenti, 26 si trovano nel Mar Mediterraneo di cui 11 di forma regolare e 15 di forma irregolare. Classe Sottoclasse Ordine Famiglia Genere Specie Tabella 1: Criteri tassonomici Echinoidea Euchinoidea Echinoida Echinidae Paracentrotus P. Lividus Subclasse IRREGULARIA Gli Echinoidi irregolari sono cuoriformi, ovali o depressi (discoidi o ellittici), la bocca e l ano non si trovano sullo stesso asse verticale, non avendo una posizione prestabilita. La simmetria appare bilaterale, il raggio di simmetria passa attraverso il raggio anteriore e l interraggio posteriore. Tra i ricci irregolari il più noto è lo Spatangus purpureus. Subclasse REGULARIA Gli Echinoidi regolari presentano una struttura tipicamente sub-sferoidale o sub-conica, con contorno rotondo, ano o periprocto e bocca sono posti ai due poli opposti sullo stesso asse verticale rispettivamente sul lato orale e sull aborale con il primo rivolto verso il basso poggiante sul substrato. La sottoclasse Regularia comprende 11 specie: Phylum Echinodermata Il phylum degli echinodermata (dal greco echinos: spina + derma: pelle) comprende metazoi celomati deuterostomi con simmetria pentaraggiata allo stadio adulto. Il nome del Phylum deriva dalla presenza di un dermascheletro calcareo variamente sviluppato costituito da piastre mobili o fisse, dotate frequentemente di aculei o tubercoli che conferiscono all animale un aspetto più o meno ruvido o spinoso e un apparato acquifero costituito da un complesso di canali in rapporto con numerose appendici mobili che di solito comunica con l esterno. La fase larvale è planctonica, la fase adulta bentonica. Gli echinodermi sono esclusivamente marini, hanno distribuzione cosmopolita e distribuzione batimetrica amplissima. Nell ambito di questo phylum si individuano cinque classi viventi, riassunte in Tabella 2. Classe Specie viventi Specie Crinoidea circa 230 gigli di mare, stelle piumose (comatule) Asteroidea circa 1500 stelle marine Ophiuroidea circa 2000 stelle serpentine Holothuroidea circa 1500 cetrioli di mare Echinoidea circa 1000 ricci di mare, dollari della sabbia, ricci cuoriformi Tabella 2: classi viventi del phylum Echinodermata Cidaris cidaris o riccio matita con grossi e tozzi aculei Stylocidaris affinis Centrostephanus longispinus con corpo piccolo e aculei molto lunghi e sottili Arbacia lixula Arbaciella elegans Genocidaris maculata Sphaerechinus granularis, che presenta delle discrete dimensioni, è di colore viola con gli aculei bianchi sulle punte Echinus melo, conosciuto anche come riccio melone Gracilechinus acutus Psammechinus microtuberculatus Paracentrotus lividus Paracentrotus lividus. Il riccio comune europeo, Paracentrotus lividus, è un invertebrato marino che vive lungo le coste Europee del nord Atlantico (Irlanda, Bretagna, Spagna) e in tutto il Mar Mediterraneo. Colonizza due tipi di habitat: le zone rocciose intertidali o talvolta subtidali (Atlantico, Mar Mediterraneo) e le praterie di Posidonia. Sulle zone rocciose, gli Echinoidi hanno abitudini scavatrici, per 4 5

12 proteggersi dalle onde e dai predatori. I giovanili hanno abitudini diverse a seconda della geografia del litorale. Lungo le coste britanniche e irlandesi sono abbondanti nelle zone di marea vicino a prati di alghe (Laminaria spp., ma soprattutto Laminaria digitata) in cui si nutrono di frammenti di alghe in sospensione o nel Mar Mediterraneo, dove la maggior parte delle popolazioni vive nei prati di Zostera marina e di Posidonia oceanica dove presentano un ciclo circadiano con alimentazione prettamente notturna (Foto 1, 2). Arbacia lixula. Questo riccio è molto diffuso sulle rocce costiere immerse e nei fondi rocciosi, a partire da qualche decimetro e fino a circa 50 m di profondità. In generale il colore che assume è molto scuro (nero o blu molto intenso). Il guscio è appiattito e presenta, come altri ricci di mare, un area boccale dotata di un organo chiamato Lanterna di Aristotele che gli consente di raschiare le alghe dal fondale. E infatti un animale erbivoro che può mangiare grandi quantità di alghe. In casi dove si verificano alterazioni ambientali, un eccesso di questi animali può creare una forte diminuzione delle alghe, o addirittura la distruzione totale delle stesse in ambienti confinati come le pozze di marea. Predilige le alghe corallinacee incrostanti (Foto 3). Figura 1 struttura anatomo-fisiologica del riccio di mare Caratteristiche differenziative tra Arbacia lixula e Paracentrotus lividus Il Paracentrotus lividus (Lamarck) e l Arbacia lixula (Linnaeus) sono le specie mediterranee appartenenti alla classe Echinoidea più conosciute. Queste due specie sono molto simili tra loro, condividono lo stesso tipo di habitat; hanno all incirca la stessa distribuzione batimetrica (0-50 m) e le stesse dimensioni (circa 7-8 cm di diametro). Il Paracentrotus lividus è comunemente conosciuto come riccio femmina o riccio viola, ha una colorazione variabile che si presenta nelle varie sfumature del viola, del marrone e del verdastro, ha aculei poco numerosi. Lo troviamo nei fondali rocciosi popolati dalle alghe e dalle praterie di Posidonia entro i cm di profondità. Le gonadi hanno dimensioni maggiori rispetto all A. lixula. L Arbacia lixula è comunemente conosciuta come riccio maschio o riccio nero, non è considerata commestibile, presenta sempre una colorazione nera con aculei fitti; le gonadi, anche in piena stagione riproduttiva hanno dimensioni sempre inferiori rispetto a quelle di P. lividus. Proprio queste differenti dimensioni hanno portato a pensare che le specie con gli organi riproduttivi minori fossero maschi e, di conseguenza, che in cucina siano utilizzabili le uova di riccio, anziché le gonadi maschili e femminili indistintamente. 1.2 Cenni di anatomia e fisiologia L organizzazione esterna è costituita da un esoscheletro, detto teca, dentro il quale sono contenuti gli organi interni. La teca è provvista di piccoli tubercoli visibili a occhio nudo ai quali si articolano gli aculei; questi sono mobili per mezzo di una piccola muscolatura situata a livello dell articolazione fra aculeo e tubercolo. Oltre ai tubercoli, la teca porta sulla sua superficie dei piccoli fori, che rappresentano il punto di inserzione delle pedicellarie; queste sono utilizzate negli Echinoidei per la recezione degli stimoli esterni, per la pulizia della superficie del corpo e per la difesa contro possibili predatori. La teca si compone di cinque doppie file di podia o pedicelli ambulacrali, provvisti di ventose disposte lungo i meridiani dalla superficie orale a quella aborale secondo la simmetria pentamera. Questi pedicelli compongono il sistema acquifero e competono alla locomozione. Le cinque file di podia definiscono nel loro insieme le aree ambulacrali o radii, formando una doppia serie meridiana di piastre. Figura 2 struttura anatomo-fisiologica del riccio di mare Il P. lividus presenta due stadi di sviluppo differenti, una forma larvale e una adulta in cui manifesta la completezza anatomo-fisiologica caratteristica di specie. Lo stadio larvale verrà analizzato in seguito ai fini di un analisi dettagliata della biologia riproduttiva degli echinodermi. 6 7

13 Adulto I soggetti adulti hanno una simmetria raggiata, o più precisamente pentamera. Nella simmetria pentamera le parti del corpo sono disposte lungo cinque raggi attorno all asse oro-aborale; infatti, se ci soffermiamo a osservare il guscio di un riccio, privo degli aculei, possiamo notare come sia ben diviso in cinque spicchi uguali. La simmetria raggiata è un adattamento alla vita sedentaria cui questi soggetti si sottopongono. L accrescimento è rapido, la durata media di vita è di circa 4-8 anni e possono riprodursi dopo un anno di età. Parete del corpo - É formata da epidermide e derma. L epidermide è costituita da un epitelio monostratificato, prismatico, spesso cigliato e fornito di elementi ghiandolari. Il derma, costituito da uno scheletro calcareo determina la forma degli Echinoidi; al suo interno sono racchiusi i visceri. Il dermascheletro è costituito per l 86% di carbonato di calcio e per il restante 14% di carbonato di magnesio e solfato di calcio; è composto da dieci serie di piastre, che poste le une accanto alle altre formano una teca. Le piastre si estendono dal polo orale al polo aborale lungo i meridiani. Alle cinque serie di piastre ambulacrali, provviste di fori da cui escono i pedicelli, si alternano cinque serie di piastre interambulacrali non forate. Le piastre, in superficie, presentano dei tubercoli ai quali si articolano gli aculei. Tubercoli e aculei - I tubercoli situati sulla superficie delle piastre, sono emisferici, perforati o no al centro e circondati da una base anulare che può essere attraversata da solchi traversi e da un areola liscia. Sui tubercoli si articolano gli aculei costituiti per il 94% da carbonato di calcio, magnesio e silicio, e per il restante 6% da composti organici. Sono articolati ai tubercoli delle piastre coronarie mediante un manicotto muscolare che ne permette il movimento. Sono diritti e, in base alla loro grandezza, possono essere divisi in: aculei primari aculei secondari aculei terziari La loro colorazione può variare in funzione degli spinocromi contenuti. Gli aculei possono essere immobili o mobili; le spine mobili possono anche avere funzione locomotoria, essendo orientabili in ogni direzione grazie alla presenza di muscoli motori appositi, che si trovano alla base dell aculeo e sulla placca. Pedicelli ambulacrali e sferidi - I ricci di mare per muoversi usano, insieme agli aculei, i pedicelli ambulacrali, organi mobili, estensibili e contrattili che hanno funzione sensoriale, respiratoria e locomotoria. Sono costituiti da piccoli tubicini terminanti con delle ventose che, riempiendosi d acqua, si allungano, si induriscono e consentono di spostarsi in tutte le direzioni; in caso di capovolgimento, risultano essere degli ottimi sistemi di ancoraggio per rimettersi in piedi. Gli sferidi, presenti in tutti gli Echinoidi, sono corpuscoli sferici od ovali, di aspetto vitreo, rivestiti di epitelio cigliato ed articolati sui tubercoli della placca calcarea, cui sono legati attraverso fibre muscolari e hanno funzione tattile. La lanterna di Aristotele - Tutti gli Echinoidi regolari ed alcuni irregolari, possiedono un caratteristico apparato detto Lanterna di Aristotele, considerato impropriamente come apparato masticatore. La lanterna è posta all interno del corpo immediatamente al di sopra del peristoma, area membranosa dalla forma sub-circolare libera dal dermascheletro posta al centro del lato orale, al quale è perpendicolare. È di forma conica, costituita da cinque elementi calcarei bianchi mobili a forma di piramide, visibili dall esterno, in quanto sporgono nel peristoma uno accanto all altro, scostandosi o avvicinandosi a seconda che questa si apra o si chiuda. Ogni piramide porta sul margine esterno una struttura che, unita o fusa con le altre, forma un arco. In ogni piramide si trova, verticalmente, un dente simile ad un asta costituita da una sostanza dura simile a smalto. Le piramidi sono collegate tra loro da potenti muscoli interpiramidali e da pezzi calcarei, le rotule, al di sopra delle quali si trovano dei pezzi sottili leggermente ricurvi detti compassi. All estremità aborale di ciascuna piramide si trova un pezzo allungato, detto epifisi, che si articola lateralmente con la rotula. I movimenti della lanterna sono regolati da un complesso sistema di muscoli; i più importanti sono i muscoli protrattori della lanterna e i muscoli retrattori. Essa ha il compito di spezzettare il cibo da ingerire (Foto 4). Apparato digerente - Alla cavità boccale seguono la faringe, l esofago e un lungo intestino che termina con l ano al centro del polo aborale. Possiamo considerare l apparato digerente del P. lividus come un tubo attaccato alla parete del corpo tramite mesenteri. Inizialmente attraversa la Lanterna di Aristotele, passando al centro di essa per le piramidi, compiendo due giri sinuosi e terminando con una porzione (retto) che si dirige al centro del lato aborale, dove si trova l ano. L intestino può avere varia lunghezza, è simile ad un tubo ripiegato a formare anse, la parete interna è costituita da un epitelio cigliato contenente cellule ghiandolari che poggiano sullo strato connettivo. Proprio dalla parte opposta della bocca, nelle specie regolari, troviamo l ano o periprocto (Foto 5). Gli echinoidei si nutrono di alghe, briozoi, polipi, coralli e resti di animali morti. Alimentazione - Il Paracentrotus lividus è una specie prevalentemente erbivora che si nutre maggiormente di alghe: Ulva lactuca, Cystoseria spp., Gracilaria spp., e Cymodocea nodosa (Traer, 1980). Studi condotti sull alimentazione hanno dimostrato che P. lividus ha un grado di preferenza per differenti macroalghe. Indicandole in ordine decrescente di gradimento sono: P. palmata 33%, L. digitata 31%, C. officinalis 23%, U. lactuca 9% e C. tomentosum 5%. Sono stati osservati in allevamento intensivo anche fenomeni di cannibalismo in casi di scarsa disponibilità di alimento ed elevata densità di individui. Apparato circolatorio - Questa specie raggiunge il massimo della complessità strutturale del celoma, il quale si articola nei sistemi: Emale Periviscerale Periemale Acquifero Figura 3 struttura degli aculei 8 9

14 Si deve quindi immaginare la presenza nel corpo degli Echinodermi di un complesso sistema di vasi, lacune e valvole intercomunicanti fra loro, il cui ruolo è quello di scambio di nutrienti e metaboliti fra le varie parti del corpo o di regolazione della pressione locale dell endolinfa, per esempio, ai fini della locomozione. Negli Echinodermi non troviamo un vero e proprio apparato circolatorio, a causa della mancanza di organi propulsori, bensì il sistema emale e il sistema periemale. Il sistema emale consiste in una serie di lacune di origine blastocelica, che in alcuni casi può assumere l aspetto di canali privi di endotelio proprio. Le lacune sono strettamente associate al sistema acquifero e sono tipicamente costituite da una lacuna periorale di forma circolare che invia tante lacune radiali per quanti sono i solchi ambulacrali. Nella lacuna periorale, si versano due lacune intestinali che avvolgono il tubo digerente in una ricca rete dove sembra avvenire il passaggio di sostanze nutritive attraverso la parete dell intestino. Poi, situata nel polo aborale, vi è una lacuna a forma di anello, che invia rami alle gonadi. Questa lacuna comunica con quella orale attraverso le lacune emali che avvolgono o attraversano la ghiandola ovoide, una ghiandola di forma fusiforme, con una cavità irregolare costituita da tessuto connettivo, riccamente vascolarizzata, con funzione escretoria, che partendo dall anello periorale segue il decorso del canale petroso, raggiungendo la lacuna emale aborale. Il sistema periemale, sistema di cavità tubulari che fascia anche il semplicissimo sistema nervoso, è costituito da seni formati da epitelio celomico, contenenti tutto o in parte il sistema emale. Si distinguono in un seno periorale da cui partono cinque seni radiali, che comunicano con un seno anulare aborale, per mezzo di un seno assile che avvolge la ghiandola ovoide. Dal seno aborale, partono cinque seni genitali in rapporto con le gonadi. Apparato respiratorio: Sistema acquifero - Negli Echinodermi la respirazione è svolta dal sistema acquifero e dai pedicelli ambulacrali. Il sistema acquifero, detto anche ambulacrale, è uno speciale sistema di vasi, completamente indipendente dall apparato circolatorio, che si estende dal polo orale a quello aborale. Questo sistema consta di un cingolo periorale, situato al di sotto dell anello nervoso, dal quale si irradiano dei canali a fondo cieco e a decorso longitudinale, chiamati canali ambulacrali. Da questi dotti prendono origine dei diverticoli (ampolle) sporgenti all esterno per mezzo di pedicelli contrattili, che svolgono diverse funzioni e dai quali partono rispettivamente due canali. Il sistema acquifero degli Echinodermi comunica con l esterno tramite un canale, detto madreporico, che collega l anello periorale alla piastra madreporica, una placca calcarea traforata situata al lato dorsale dell animale: in tal modo l acqua marina penetra nei canali, regolata dalla contrazione di alcune vescicole poste sull anello periorale, di regola in numero di quattro, e di piccole dimensioni, denominate vescicole del Poli. Attorno alla bocca vi è una sottile membrana che dà origine, per invaginazione, a numerose piccole branchie provviste di epitelio ciliato. Gli scambi gassosi si realizzano per diffusione attraverso l epitelio branchiale e i pedicelli. Il sistema nervoso - Il sistema nervoso negli Echinodermi è piuttosto complesso, anche se presenta caratteri di primitiva semplicità. La sua organizzazione è simile a quella dell apparato ambulacrale, manca di gangli e presenta una tipica disposizione penta raggiata. In esso possiamo distinguere tre sistemi sovrapposti: ectoneurale, iponeurale ed endoneurale. Il sistema nervoso negli Echinoidi comprende un anello circum-boccale e cinque fondamentali nervi radiali. L anello circum-boccale è unito alla faringe da bande connettivali e fornisce la regione boccale e il tubo digerente. I nervi radiali danno origine a fibre nervose che passano con il nervo podiale, attraverso i pori delle placche ambulacrali e si diramano nella parete del corpo in un plesso sub-epidermico. Tale plesso forma un anello attorno alla base di ciascun aculeo, pedicellaria e sferidio, inviando fibre che risalgono queste strutture, conferendo loro notevoli capacità sensoriali. Tutti gli Echinodermi sono molto sensibili alle variazioni luminose su tutta la superficie del corpo, specialmente nelle zone più ricche di terminazioni nervose. L apparato riproduttore consiste di cinque gonadi. Esse sono unite da filamenti mesenterici alla superficie interna delle aree interambulacrali. Le estensioni del celoma genitale e dei seni ematici interconnettono tutte le cinque gonadi dei ricci di mare. Questi seni si proiettano da componenti simili del complesso assiale sotto il madreporite. All estremità aborale, ciascuna gonade si assottiglia fino a dare origine a un corto gonodotto che sbocca all esterno, attraverso il gonoporo delle piastre genitali. Da ogni gonade sporge un singolo gonodotto, che si estende dentro i filamenti del seno celomatico aborale, prima di uscire dal guscio attraverso una serie pentagonale di gonopori, situati lungo le piastre genitali che circondano l ano. In entrambi i sessi, la struttura della parete gonadica è simile ma non identica. Due sacche di tessuto (esterno ed interno) compongono la parete gonadica; ognuna consiste di diversi strati caratteristici. Per tutta la gonade, il seno celomatico genitale (GCS) separa la sacca esterna da quella interna; la sacca esterna include un peritoneo viscerale (VP) che si affaccia su celoma periviscerale e che è attaccato a uno strato di tessuto connettivo (CTL). Anche cellule epiteliali non muscolari delineano il CTL sulla sua superficie opposta verso il GCS. La sacca interna è un seno ematico genitale (GHS), che porta cellule ciliate mioepiteliali sul suo lato esterno. Questi muscoli si contraggono ritmicamente durante il rilascio dei gameti in risposta alla porzione glucidica di glicoproteine prodotte dall intestino e accumulate nei tessuti aborali ematici (Takahashi et al., 1990, 1991). I nervi interconnessi sincronizzano l attività delle gonadi durante lo spawning (emissione) (Walker et al., 2007 in Edible Sea Urchins: Biology and Ecology). Sulla faccia del lume, il GHS sostiene l epitelio germinale. Le funzioni principali del sacco interno sono la gametogenesi, un accumulo molto limitato di nutrienti nel GHS e ampio stoccaggio di nutrienti nei fagociti nutritivi. Il contenuto del GHS può variare leggermente in quantità durante la gametogenesi: prima e durante la gametogenesi, il GHS contiene glicoproteine PAS+ (Walker et al., 2005). Recidendo le connessioni radiali tra la gonade e le estensioni aborali celomatiche ed ematiche si impedisce lo sviluppo delle gonadi e la gametogenesi. NP è una glicoproteina che è stata originariamente identificata come la componente predominante dei granuli di tuorlo in uova di riccio e definita principale proteina d uovo (MYP). La MYP è prevalentemente sintetizzata nell intestino dell adulto del riccio di mare, viene poi secreta nel fluido celomatico, trasportata attraverso i due strati epiteliali della capsula ovarica ed è assorbita con i NP dove viene immagazzinata in grandi granuli. A differenza di altri animali ovipari, i ricci di mare producono MYP prima della gametogenesi. La clonazione e la caratterizzazione di MYP suggerisce che è una proteina di legame ferroso simile alla transferrina, piuttosto che una proteina vitellino-simile. Questa classificazione sembra adattarsi meglio al suo ruolo fisiologico e suggerisce che la sua funzione è quella di trasportare il ferro a sostegno delle attività di gametogenesi e embriogenesi. Dopo l iniziale gametogenesi, la MYP nell NP è utilizzata per sintetizzare nuove proteine e altri componenti per uova e sperma (Unuma et al., 2003; Unuma & Walker, 2010). Le espansioni dei seni ematici contengono precursori di cellule somatiche e gonadiche del tessuto germinale in sviluppo. Entrambi questi tipi di cellule sono piene di sostanze nutritive in vescicole di membrana e si trovano nell echinopluteo prima che avvenga la metamorfosi. Femmine molto piccole possono avere oogoni riconoscibili sebbene non si avvii il processo di oogenesi. Anche i piccoli maschi possono contenere spermatozoi poco differenziati: i testicoli di S. purpuratus producono spermatozoi entro i primi 12 mesi di vita. È riportata di seguito una rappresentazione esemplificativa dell apparato riproduttore degli Echinoidi e del relativo tessuto gonadico. Apparato riproduttivo - Gli Echinoidei sono animali gonocorici ma non presentano evidenti segni esterni di dimorfismo sessuale. I due sessi sono determinati attraverso il colore delle gonadi: arancio intenso per le femmine, giallo-arancio chiaro per i maschi (Sellem et al., 2007)

15 3 - Allestimento impianto per la sperimentazione Figura 4 (a) Rappresentazione dell apparato riproduttivo del riccio di mare visto dal lato aborale; (b) rappresentazione del tessuto nella parete gonadica, dopo Strenger (1973); (c) Lobo di una gonade colorata con phalloidin per mostrare i muscoli sulla superficie esterna del GHS della sacca interna (strisce bianche) Abbreviazioni: A - ano; CTL - strato di tessuto connettivo; GL lume gonadico; M - madreporite; NP - fagociti nutritivi; GCS - seni genitali celomatici; GHS - seni ematici genitali; TF - tubo del piede; VP - peritoneo viscerale L intero progetto, riguardante la riproduzione del Paracentrotus lividus, è stato condotto nello schiuditoio dell azienda Algesiro Srl (identificato con A), dove sono state utilizzate le strutture presenti, adibite alla riproduzione delle vongole e ostriche. Parallelamente, presso il Dipartimento di Medicina Veterinaria dell Università degli Studi di Bari (MDV) (identificato con B), sono stati allestiti acquari e vasche per condurre lo studio in oggetto. 4 - Raccolta riproduttori - stabulazione Gli esemplari di P. lividus per la sperimentazione sono stati prelevati nelle seguenti aree: Taranto, Castro-Otranto (LE), Fasano (BR) (Tabella 3). 2- Obiettivi del progetto Il progetto pilota sull echinocoltura, particolarmente attento alla tutela dell ambiente, è stato ideato per ottimizzare le modalità di allevamento e commercializzazione del P. lividus, ponendo attenzione al superamento delle fasi critiche attualmente riscontrate in altre esperienze di riproduzione. Partendo dal presupposto della autoctonicità della specie nella fascia costiera della regione Puglia, nel progetto sono state perseguite le seguenti fasi operative: 1) Allestimento dell impianto; 2) Reperimento esemplari di Paracentrotus lividus; 3) Produzione di alimento vivo (fitoplancton); 4) Selezione dei riproduttori mediante valutazione dello stadio di maturazione delle gonadi; 5) Riproduzione artificiale in ambiente controllato: condizionamento dei riproduttori; stimolazione dell emissione dei gameti, fecondazione artificiale ed incubazione delle uova; 6) Alimentazione larvale e post-larvale; 7) Messa a punto e preparazione del mangime per riproduttori; 8) Messa a punto di tecniche per aumentare la sopravvivenza dei gameti; 9) Policoltura con le ostriche. I soggetti campionati, che popolavano gli habitat subtidali, avevano dimensioni di mm di diametro, aculei compresi, e sono stati prelevati nel periodo compreso tra marzo 2012 e dicembre 2013 (Foto 6). Prima di essere utilizzati come riproduttori per la fecondazione indotta, è stato determinato l indice gonadico e la fase di maturazione gonadica. coordinate geografiche periodo n. soggetti N E marzo dicembre N E N E N E marzo dicembre N E marzo dicembre Metodologia di campionamento Tabella 3 coordinate geografiche Il campionamento è stato effettuato con cadenza quindicinale, ed eseguito in successione per evitare che si determinassero significative differenze temporali tra i campioni delle diverse popolazioni. Il prelievo, per una facile rimozione, è stato effettuato con l aiuto di un coltello. Per ogni campionamento, nelle varie zone sono stati estratti 40 ricci al mese, per un totale durante tutto il periodo di studio di n. 922 soggetti. I soggetti, subito dopo la pesca, sono stati immersi in contenitori con acqua di mare e trasportati in laboratorio. Nel periodo estivo l acqua era mantenuta refrigerata con dei siberini (piastre eutettiche)

16 Nelle due strutture i ricci sono stati suddivisi nel seguente modo: nell impianto A: composto da n. 6 vasche della capienza di circa 300 l. Nello specifico, nelle vasche numerate da 1 a 5 sono stati immessi n. 20 individui, rispettando una densità pro vasca di n.1 individuo/15 l di acqua; nella vasca n.6, n. 40 individui. Le vasche 1-5 erano a circuito aperto, con un ricambio medio di 1000 l/h. L approvvigionamento idrico dell impianto era assicurato da una presa a mare, che attraverso una condotta sotterranea, captava l acqua di mare tramite una pompa, la convogliava ai filtri e successivamente alla cisterna di raccolta. Il sistema di filtrazione prevedeva una pre-filtrazione dell acqua in entrata, proveniente dalla presa a mare mediante un filtro a sabbia, in modo da immettere nel circuito idraulico acqua priva di particolato sospeso, che avrebbe, altrimenti, compromesso il corretto funzionamento dell intero impianto. Successivamente l acqua pre-filtrata veniva sterilizzata mediante uno sterilizzatore ad ultravioletti, ed inviata ad un filtro a carboni attivi e quindi alle vasche di allevamento. Questa modalità di funzionamento poteva prevedere, a seconda delle esigenze del caso, anche la fase di filtrazione completa, come per il funzionamento a circuito chiuso. La termostatazione dell acqua era garantita da una caldaia a GPL, che tramite scambiatori di calore, poteva garantire la temperatura desiderata in tutte le vasche e per tutta la durata delle prove. Nella vasca n.6 a circuito chiuso è stato aggiunto un filtro a secchiello esterno di 2000 l/h, caricato con cannolicchi Siporax e carbone attivo (Foto 7-8). La salinità nelle vasche era del 35 e il peso specifico 1026 ± 1. Il fotoperiodo con luce fioca naturale/artificiale era di 12h/12h e temperatura pari a 18 ± 1 C. Nella fase iniziale sono stati sistemati dei cestelli di plastica in modo verticale, tale da permettere ai ricci di arrampicarsi e distribuirsi più equamente nella vasca (Foto 9-10). nell impianto B n. 54 soggetti da utilizzare come riproduttori sono stati sistemati in un acquario di 400 l, con acqua marina ricostituita al 35 di salinità, con peso specifico di ± 1. L acquario è stato dotato di filtro esterno di 2000 l/h caricato con cannolicchi Siporax, carbone attivo e UV (Foto 11). In altre n.5 vaschette di 80 l con acqua ricostituita e dotati di filtro sono stati immessi 20 ricci per ciascuna (Foto 12). Il fotoperiodo con luce fioca naturale/artificiale e la temperatura ideale, invece, sono stati riprodotti artificialmente nel seguente modo: di 12h/12h e T pari a 18 ± 1 C. I ricci posizionati negli impianti A e B, dopo un digiuno di 30 giorni, sono stati alimentati gradatamente con un mangime formulato nei laboratori del DMV, a base di farina di pesce e sostanze di origine vegetale. Dei restanti ricci sono stati sacrificati n.132 per la determinazione dell indice gonadico, n.110 per la determinazione dello stadio evolutivo delle gonadi, n. 20 soggetti per la determinazione della composizione chimica delle gonadi. Degli ulteriori restanti n. 366 ricci: n. 150 a integrazione dei soggetti venuti a morte per ambientamento, n. 216 presso l allevamento Algesiro S.r.l., in agro di Manfredonia, nelle lanterne contenenti ostriche per le prove di policoltura. 5 - Riproduzione La determinazione dell indice gonadico e la caratterizzazione istologica dei gameti del P. lividus sono indagini necessarie per la conoscenza del ciclo riproduttivo; da tali parametri dipende direttamente la buona riuscita della fecondazione. Le gonadi del riccio di mare sono costituite da due tipi di cellule: cellule riproduttive e cellule di riserva o di stoccaggio (noti come fagociti nutritivi o cellule NP). Le cellule riproduttive delle femmine sono le uova (nelle diverse fasi di oogoni, ovociti e ovuli), mentre quelle dei maschi sono lo sperma (nelle diverse fasi di spermatogoni, spermatociti, spermatidi e spermatozoi). I fagociti nutritivi (NP) hanno la capacità di fagocitare e di immagazzinare i nutrienti (proteine, carboidrati, lipidi) che vengono utilizzati per lo sviluppo del gamete e per l attività metabolica di base, quando l alimento scarseggia (Walker et al., 2007, Carboni et al., 2012). La percentuale dei due tipi di cellule presenti nelle gonadi varia durante il ciclo. La gonade è l unico organo che immagazzina sostanze nutritive; quando la disponibilità alimentare è ridotta la dimensione della gonade diminuisce, quando il livello nutritivo è alto le gonadi sono generalmente più grandi. Diversi autori (Lozano et al., 1995; Tenuzzo et al., 2012; Sánchez et al., 2004; Byrne, 1990), mediante la valutazione dell indice gonadico e le determinazioni istologiche hanno evidenziato che, il ciclo riproduttivo annuale di P. lividus ha uno o due picchi gametogenici stagionali, che potrebbero variare a seconda della località e della disponibilità di cibo presente (Gago et al., 2003). 5.1 Determinazione stadio di maturazione Il ciclo riproduttivo del P. lividus delle popolazioni del Mediterraneo è stato ampiamente studiato in vari Paesi, come: Andalusia (Sánchez et al., 2004); Tunisia (Sellem & Guillou, 2007); Catalogna (Lozano et al., 1995); Francia (Fenaux, 1968); Italia (Barbaglio et al., 2007; Fabbrocini, 2010) e in Algeria (Guettaf, 1997). Gli studi hanno dimostrato come, nel Mediterraneo l attività riproduttiva si svolge in un solo ciclo, tra la primavera e l estate (Lozano et al., 1995; Sanchez et al., 2004; Sellem & Guillou., 2007), anche se alcuni autori riportano due cicli: il primo in primavera, il secondo in autunno; (Fernandez & Boudouresque, 1997; Guettaf, 1997; Barbaglio et al., 2007). Altri anche per tutto l anno (Guettaf, 1997; Sanchez et al., 2004), direttamente proporzionali a seconda delle condizioni ambientali. Indice Gonadico L indice gonadico (IG) mette in evidenza la produzione gonadica rispetto al resto del corpo. Le dimensioni delle gonadi non sono indice dello stato gametogenico, né della fase riproduttiva (Boudouresque & Verlaque, 2007). L IG dei ricci di mare in natura può variare enormemente dal 1% al 20%, mentre per i soggetti allevati si registrano valori fino al 35%. Questa variabilità è dovuta alla disponibilità alimentare, alle condizioni ambientali (come periodo di luce diurna, temperatura dell acqua e presenza / assenza di correnti d acqua) e allo stato di moltiplicazione gonadico. Perciò, grandi differenze possono verificarsi in natura sia tra gli individui all interno di una popolazione, sia tra popolazioni di ricci vicine tra loro. Anche con IG molto basso, i ricci di mare sono in grado di sopravvivere per lunghi periodi (mesi), con poco o addirittura senza cibo, in quanto hanno la capacità di controllare il loro metabolismo e le loro funzioni biologiche (come la riproduzione)

17 I campioni di riccio (n.132), una volta portati in laboratorio, sono stati pesati e, con l aiuto di un calibro di Vernier, se ne è misurato il diametro che, senza aculei, era compreso tra 3,8 e 6,8 cm (Foto ). Successivamente la teca è stata aperta a metà, a livello delle piastre ambulacrali, utilizzando comuni forbici da laboratorio, e i ricci sono stati posizionati con la cavità aperta su carta assorbente. Dopo circa cinque minuti sono state prelevate e pesate le gonadi (Foto 17-18). La valutazione dell IG è stata effettuata pesando il riccio in toto (peso umido totale di riccio di mare), e le gonadi isolate (peso umido) (Foto 13-18). La formula utilizzata è la seguente: indice gonadico (IG) = [peso della gonade (g) / peso totale del riccio (g)] x 100 (Fabbrocini, 2011; Tenuzzo, 2012). Gli indici gonadici risultanti dalla formula utilizzata sono stati suddivisi per data di rilevazione e luogo di cattura degli individui; successivamente sono stati calcolati gli indici gonadici medi per data (Grafico 1). Estrazione delle gonadi Prima del prelievo delle gonadi, i campioni sono stati pesati, misurando anche diametro e altezza con l aiuto di un calibro di Vernier. Successivamente con un paio di forbici sono stati tagliati a metà a livello delle piastre ambulacrali, per evitare di danneggiare il tessuto gonadico che è stato rimosso con una spatola- cucchiaio da laboratorio (Foto ). Trattamento istologico Il tessuto rimosso è stato immerso in formalina al 10% tamponata, per la fissazione. Altri autori hanno utilizzato il liquido di Bouin (Byrne, 1990; Guettaf, 1997; Sellem & Guillou, 2007). Dopo 3-4 giorni in formalina i campioni sono stati classificati, numerati progressivamente, immessi nelle cassette da inclusione e lavati in acqua corrente, per la rimozione del fissatore in eccesso (Foto 22-23). Il frammento è stato approntato per essere sottoposto alla procedura di inclusione, necessaria per fornire consistenza e resistenza al tessuto e per essere successivamente tagliato in fette sottili (4μm) (Foto ). L inclusione, che servirà per la penetrazione della paraffina in tutte le strutture della gonade, è stata eseguita dal processatore (Istochinette) con la seguente metodica: 1) disidratazione: mediante scala ascendente degli alcoli (alcool etilico a ) per eliminare la componente acquosa, che non permetterebbe l entrata della paraffina nel tessuto; 2) diafanizzazione: in xilolo per rendere il pezzo, già privato dell acqua, diafano (trasparente) e penetrabile da parte della paraffina; 3) infiltrazione: in paraffina fusa a 60 C (in bicchieri termostatati tarati secondo il punto di fusione della paraffina, fra i 58 C e 60 C) per permetterle di sostituirsi allo xilene, all interno del pezzo istologico; Grafico 1 Andamento indice gonadico La curva mostra l andamento dell indice gonadico nel periodo di riferimento marzo dicembre Si evince come l indice gonadico ha il picco massimo nei mesi di maggio e giugno di ciascun anno. 5.2 Fasi della maturazione gonadica - Trattamento dei campioni Cosi come non è possibile calcolare con precisione l IG senza aprire e pesare le gonadi del riccio di mare, analogamente non è possibile stimare la fase riproduttiva senza il prelievo e la valutazione istologica di un campione di gonade. 4) inclusione: i campioni vengono immersi in contenitori sagomati in cui viene fatta colare paraffina liquida ed il tutto viene lasciato solidificare a temperatura ambiente. Quindi, il blocchetto solido viene estratto dal contenitore e processato per la successiva fase di sezionamento. La durezza della paraffina solida ci permette di realizzare le sezioni istologiche; 5) sezionamento: tagli seriali di 4 μm sono stati effettuati con il microtomo rotativo per assicurare una corretta osservazione dello stato delle gonadi. Le sezioni vengono distese in acqua a temperatura di circa C e poi fatte aderire al vetrino portaoggetti; Per una maggiore adesione della fetta al vetrino sono state messe in stufa a 37 C per 1h. Le sezioni in paraffina aderenti sui vetrini porta oggetto, affinché possano essere colorate con coloranti istologici, debbono prima subire i seguenti passaggi: a) deparaffinazione: xilene per allontanare la paraffina dalla sezione istologica; b) reidratazione: con la scala discendente degli alcoli; c) lavaggio: con acqua distillata; d) colorazione: eseguita la colorazione con E.E., il campione viene immerso in ematossilina per 4 minuti dopo aver rimosso i resti di colorante attraverso un bagno di acqua distillata in eosina per 30 secondi.; 16 17

18 Eseguita l operazione di colorazione dei preparati, le sezioni sono state sottoposte a: a) disidratazione: mediante la scala ascendente degli alcoli (alcool etilico a ); b) chiarificazione in solvente organico: xilene; c) montaggio: con vetrino copri oggetto con interposta una goccia di resina sintetica (Eukitt), che ha lo stesso indice di rifrazione del vetro; Dopo quest ultimo passaggio i vetrini sono stati osservati al microscopico (Foto 27). Sono state effettuate anche colorazioni specifiche, come: P.A.S., Tricromica di Mallory e Van Geson. In letteratura l osservazione istologica del ciclo riproduttivo è classificata da alcuni autori (Byrne, 1990; Guettaf, 1997; Sellem & Guillou, 2007; Fabbrocini et al., 2010) in sei fasi, mentre da altri autori (Sánchez et al., 2004; Barbaglio et al., 2007; Tenuzzo, 2012) in quattro. Tra le diverse metodologie proposte abbiamo deciso di usare quella di Byrne (1990), dividendo il ciclo gonadico in sei fasi. I cambiamenti all interno delle gonadi vengono classificati in base alle proporzioni relative delle due popolazioni di cellule principali che compongono l epitelio germinale: le cellule germinali (oogoni e spermatogoni) e cellule somatiche o fagociti nutritivi (NP). Fase III: fase prematura (premature stage): la vitellogenesi continua, e gli ovociti di varie dimensioni e forma ovoidale aumentano il volume, raggiungendo un diametro di circa 90 µm. Il tessuto di riserva comincia a scomparire, i fagociti sono sempre più scarsi, spostati dalla loro posizione centrale e con riduzione del PAS+. La vitellogenesi comporta l accumulo di componenti del tuorlo dall NP, e delle proteine endogene prodotte anche dallo stesso ovocita. La deposizione di tali componenti non MYP è apparentemente dipendente da un segnale diverso dal fotoperiodo. Numerose proteine ovaio-specifiche sono prodotte negli ovociti che si troveranno nei granuli corticali degli ovuli maturi. I granuli sono costituiti da: sostanza ialina, glicosaminoglicani, serina (25kDa) proteasi, ovoperossidasi e proteolisine. I granuli corticali sono trasferiti nel citoplasma precocemente durante le divisioni degli ovociti in maturazione e dopo la rottura della vescicola germinale. Una volta che gli ovociti primari hanno raggiunto la massima dimensione finiscono la loro maturazione, e gli ovuli si accumulano al centro del lume, pronto per il rilascio nell ambiente (Foto 30). Fase IV: fase matura (mature stage): in questa fase si evidenziano uova mature, fittamente stipate, che occupano tutto lo spazio della gonade. Di colorito viola con E.E, sono fortemente eosinofile al PAS+, hanno un diametro di 90 µm, di forma sferica leggermente allungata. Il tessuto nutritivo e i fagociti scompaiono quasi completamente. Qualche piccolo ovocito primario, delle dimensioni di µm, è presente vicino alla parete della gonade, che si presenta molto assottigliata (Foto 31). 5.3 Ovaio Fase I: fase ricostituzione gonadica (recovery stage): inizia dopo la deposizione delle uova, con il riassorbimento della maggioranza dei gameti residuali. Nell ovaio si nota la presenza di piccole goccioline derivanti da lisi degli ovociti PAS+. I pochi fagociti nutritivi (NP) presenti nel lume sono di piccole dimensioni, conseguenza della mobilizzazione e rilascio della maggior parte delle sostanze nutritive contenute (Walker et al., 2007). Il numero e la dimensione di queste cellule fagocitarie determinano l aumento del peso della gonade (Harrington et al., 2007). Gli ovociti primari (pre vitellogenici), di 5 30 µm, che iniziano a formarsi sulla parete esterna della massa gonadica, parteciperanno al prossimo evento gametogenico, e sono riconoscibili come piccoli granuli scuri fortemente basofili (colorazione viola scuro H/E, e blu con PAS+) (Foto 28). Fase II: fase di crescita (growing stage): inizia la vitellogenesi in cui gli ovociti primari vitellogenici (EV), sempre meno basofili, aumentano di dimensioni (da 10 a 50 µm); i nuclei (N) diventano visibili. Il tessuto di riserva è ancora molto denso. Gli ovociti restano attaccati alla parete delle gonadi e sono generalmente circondati da fagociti nutritivi, nel frattempo, le gonadi sono aumentate in numero e dimensioni e riempiono anche il lume. La struttura generale dell NP in questa condizione è importante, perché è lo stadio finale prima che i nutrienti siano mobilitati dall NP e gli oogoni inizino la mitosi. Il nucleo del NP aderisce su un lato della membrana cellulare. I vacuoli contengono proteine (glicoproteine e lipoproteine), mucopolisaccaridi neutri e lipidi (Walker, 1982). In entrambi i sessi gli NP crescono per tutto questo stadio, poiché accumulano molecole nutritive. La vitellogenina è una glicoproteina accumulata negli NP, considerata il precursore della MYP (Major Yolk Protein), la più importante proteina trovata nel riccio di mare (10-15% di proteine totali dell uovo; Harrington & Easton, 1982; Unuma et al., 1998). Gli NP in entrambi i sessi, accumulano MYP (Unuma et al., 1998). Il significativo aumento della dimensione delle gonadi è attribuibile a un accelerato accumulo di MYP negli NP, e forse di altri nutrienti, e non a un aumento in numero dei gameti, poiché la gametogenesi non è ancora iniziata. Il contenuto PAS+ dentro gli NP è il glicogeno, il contenuto delle vescicole di membrana sono mucopolisaccaridi. (Walker, 1982). Il glicogeno rilasciato dagli NP è assorbito per pinocitosi dagli ovociti. Gruppi di ovociti primari e ovociti vecchi possono essere ancora visibili (Foto 29). Fase V: fase post deposizione (partly spawned stage): una volta che gli ovuli sono stati rilasciati nel gonodotto, il lume dell ovaio può apparire meno compresso rispetto alla fase precedente. L ovaio si presenta caratterizzato da ovuli maturi, circondato da spazio vuoto e scarso tessuto nutritivo. Nelle ovaie, però, una notevole quantità di ovociti in via di sviluppo sono presenti, e potrebbero sostituire le uova deposte. Un certo quantitativo di uova può essere presente nell ovidotto. Gli ovociti vitellogenici sono ancora presenti sulle pareti dell ovaio, e gli NP sono ancora visibili, anche se significativamente ridotti nel numero (Foto 32). Fase VI: stadio di esaurimento (spent stage): le pareti dell ovaio sono assottigliate. Ovociti e ovuli vitellogenici residui di forma irregolare o conica, subiscono un processo di fagocitosi, il restante spazio è occupato da NP, che ora iniziano a recuperare la loro dimensione per il successivo ciclo. Essi infatti sono di dimensione ridotta, a seguito della mobilitazione e il rilascio di molti nutrienti che originariamente contenevano. La loro dimensione raggiunge i µm in lunghezza, veramente esigua se comparata alla lunghezza massima raggiunta durante l ovogenesi attiva, 200 µ. I fagociti nutritivi contenenti un singolo nucleo sono PAS+. La fase VI porta alla fase I, con la comparsa dei primi ovociti nella parete gonadica. Il tessuto nutritivo comincia a riformarsi, e può occupare una vasta area (Foto ). 5.4 Testicoli Fase I: fase ricostituzione gonadica (recovery stage): i testicoli presentano un sottile strato di spermatogoni e spermatociti primari lungo le pareti degli acini. I fagociti nutritivi (NP), presenti nel lume, formano un reticolo con residui di spermatozoi (Foto 36). Fase II: fase di crescita (growing stage): la parte centrale dell acino è formato da un reticolo compatto ripieno di NP intensamente PAS+. Colonne di cellule germinali, spermatociti, si proiettano dalla periferia verso il centro del lume (Foto 37). Fase III: stadio prematuro (premature stage): si evidenziano colonne di spermatociti sulla parete dell acino; gli spermatozoi si incominciano ad accumulare nel lume. Fagociti nutritivi si evidenziano al centro (Foto 38)

19 Fase IV: fase matura (mature stage): i testicoli maturi sono presenti nella zona centrale dell acino; fagociti nutritivi sono situati perifericamente. I testicoli sono in gran parte privi di eosinofilia e PAS+ (Foto 39). Fase V: fase post emissione (partly spawned stage): gli spermatozoi vengono rilasciati nel gonodotto. In questa fase i testicoli sono simili a quelli della Fase IV, eccetto che per la presenza di una minore concentrazione di spermatozoi negli spazi del lume dell acino (Foto 40). Fase VI: stadio esaurimento (spent stage): le pareti dell acino sono sottili, il reticolo pallido, gli NP in periferia vuoti o fagocitanti spermatozoi. Il lume risulta essere vuoto anche se gli spermatozoi potrebbero essere ancora presenti nel gonodotto (Foto 41). Cellula uovo matura A seguito dell ovideposizione, seguendo in progressione dall esterno, l ovulo pienamente maturo ha le seguenti caratteristiche: lo spesso strato di gelatina formato da diverse glicoproteine, la membrana vitellina, la membrana cellulare (o oolemma), il citoplasma corticale contenente granuli corticali, il citoplasma residuo centrale contenente granuli di tuorlo (MYP, ecc.) e il pronucleo femminile aploide e il suo unico centrosoma (Anderson, 1968). Il polo vegetale della regione dell ovulo maturo è attaccato alla faccia luminale della sacca interna della parete ovarica, da cui probabilmente riceve direttamente i nutrienti. Il citoplasma nel polo vegetale contiene tuorlo più di quello del polo animale. Il polo animale è dove i globuli polari emergono durante la meiosi I e II. Di solito, il primo globulo polare non si divide durante la meiosi II, e così sono prodotti solo due globuli polari, uno più grande (il primo) e uno più piccolo (il secondo). Inizialmente questi due globuli polari sono in sintonia con lo strato di gelatina, ma di solito sono persi nell acqua di mare circostante. Spermatozoo maturo Dall estremità anteriore a quella posteriore lo spermatozoo comprende: la membrana cellulare degli spermatozoi, la membrana acrosomiale (importante per la fecondazione, perché fornisce enzimi idrolitici per la penetrazione della membrana dell uovo), actina non polimerizzata (legata alla profilactina), il nucleo con cristallino, un DNA aploide, un centriolo basale circondato da singoli o multipli mitocondri di grandi dimensioni e una coda contenente nove coppie di microtubuli periferici e due centrali. Gli spermatozoi contenuti nel riccio sono immobili, probabilmente a causa dell elevata concentrazione di anidride carbonica. Quando sono dispersi in acqua di mare diventano estremamente mobili. Per cercare le cellule uovo, gli spermatozoi nuotano circolarmente seguendo un percorso a spirale, per massimizzare la loro probabilità di incontro. Quando gli animali sono maturi l ovideposizione è sincronizzata, e innescata da segnali esterni, come ad esempio la variazione di temperatura o anche l esplosione di fitoplancton (Spirlet et al., 1998). Durante il periodo riproduttivo, gli animali tendono a formare gruppi, che si spostano verso il litorale. La fecondazione avviene esternamente lungo la colonna d acqua, espellendo i prodotti germinali dei due sessi, direttamente nell acqua. Tale operazione è riscontrabile dalla presenza di materiale simile a una nuvoletta chiara o a un fiotto opaco. Al contatto dei gameti con l acqua fa subito seguito la fecondazione delle uova, che presentano una colorazione trasparente e hanno delle dimensioni molto ridotte, il loro diametro medio è di 0,1 mm circa. 5.5 Emissione Dopo 20 giorni di adattamento sono stati scelti 30 soggetti come riproduttori, e indotti all emissione attraverso l immissione in cavità peristomiale di cloruro di potassio (KCl) 1 M, comunemente alla dose di 40μl per grammo di peso corporeo (Carboni, 2012). Altri metodi possibili, ma non utilizzati nella nostra sperimentazione, sono l esposizione a brusche variazioni di temperatura o salinità e shock meccanici (Agatsuma et al., 2004; Gago, 2009; Spirlet et al., 1998). I maschi sono stati individuati grazie alla presenza sulla parte dorsale del riccio, dello sperma di colorito biancastro, le femmine, invece, per la presenza di uova con un colorito rossastro (Foto 42-43). Per la fecondazione è stata rispettata la proporzione di 5 femmine per ciascun maschio. Gli ovuli e gli spermatozoi sono stati raccolti in becher separati, e miscelati con acqua di mare filtrata (1μm), (Foto 44-45), successivamente mescolati per la fecondazione, mantenendo una temperatura di 24 C ± 1 per tre ore. È stato utilizzato sperma di più maschi al fine di aumentare il tasso di fecondazione (Evans & Marshall, 2005; Carbone, 2012). Il tasso di fecondazione valutato dopo le prime tre ore era del 90% in Aprile-Maggio, fino metà Giugno; Scendeva al 40% da Settembre ad Ottobre. Ad avvenuta fecondazione, gli embrioni sono stati divisi in matracci per il completamento dello sviluppo embrionale. Nei matracci l ossigenazione veniva assicurata mediante l immissione di cannule (Foto 46). L allevamento larvale si è svolto all interno dello schiuditoio, in serbatoi di polietilene cilindrici, a fondo conico con luce continua, con una densità di 4 larve/1 ml acqua, e un ricambio completo di acqua ogni 3 giorni (Kelly, 2000; Liu et al., 2007; Carbone, 2012). Sperimentalmente abbiamo usato dei coni hobbistici per la schiusa di artemia, da 1 litro (Rebie), dopo 48 ore dalla fecondazione delle uova le larve di echinopluteo sono state posizionate in contenitori da 80 l, senza ricambio d acqua ma ossigenate. Ogni tre giorni, le colture di larve sono state setacciate, i contenitori svuotati, puliti, disinfettati e riempiti con acqua di mare pulita filtrata e trattata con raggi UV (circa 250 mj cm-1s-1) Altre larve sono state immesse in un acquario di 400 l con filtro e lampade U.V. Il coefficiente di densità era di 0,25 larve/litro. La prima alimentazione dei plutei è stata effettuata dopo 48 ore, con alghe unicellulari di Nannochloropsis, con una concentrazione crescente da 4000 a 15000/ml; al 10 giorno venivano aggiunte alghe unicellulari Dunaliella e Dinophysis, tutte coltivate in impianto A e B. Nell impianto A sono stati utilizzati dei fotobioreattori di grossi volumi, con raggiungimento di concentrazioni /ml (Foto 47), invece, presso il DMV, sono stati allestiti tre fotobioreattori hobbistici della azienda Ruwal di 10 l cadauno, e stimolati con lampade da 15W e 4900 gradi Kelvin, raggiungendo concentrazioni pari a /ml. Le alghe sono state coltivate con acqua ricostituita con sale marino a densità di 1026, multivitaminico (B1, B12, H) 0,1ml/l e walne (cloruro di ferro, cloruro di manganese, acido borico, EDTA sodico, fosfato di sodio, nitrato di sodio, cloruro di zinco, cloruro di cobalto, molibdato di ammonio, solfato di rame) 1ml/l; per le diatomee veniva aggiunto in più silicato di sodio (silicato di sodio, acido cloridrico) 1ml/l. Dopo giorni, le larve, pronte per la metamorfosi, sono state trasferite in acquario a 21± 1 C con sistema di ricircolo completo e un fotoperiodo continuo. La durata plantonica a seconda della specie di larva è di circa quattro settimane crescendo 94,5 volte di più del volume dell uovo (McEdward & Miner, 2001). L allevamento larvale è terminato dopo circa 43 giorni dalla fecondazione, durante il quale le larve hanno subito notevoli cambiamenti morfologici, con la formazione dell echinopluteo, larva pelagica, con un numero variabile di braccia

20 Sono stati fatti quattro tentativi di cultura larvale: nella prima prova, poche larve hanno raggiunto gli stadi avanzati, ma nessuna ha raggiunto la metamorfosi allo stadio adulto. Tuttavia, nelle tre successive prove, si è ottenuto una media di 20 giovanili. Il numero delle larve sopravvissute si è mantenuto costante a 21± 1 C, con un periodo evolutivo di circa giorni. Il periodo immediatamente prima e dopo la metamorfosi si chiama periodo perimetamorfico. Si tratta di una tappa fondamentale, in quanto collega il periodo larvale planctonico con la fase giovanile bentonica (Grosjean et al., 1998). Questi eventi possono essere raggruppati in tre fasi distinte: fase competente: all inizio del quale la larva acquisisce la capacità di trasformarsi e durante la quale cerca un substrato adatto stadio metamorfico: durante il quale le larve pelagiche si stabiliscono sul substrato fase postlarvale: in cui l individuo post metamorfico prepara il suo passaggio alla vita giovanile. I momenti evolutivi del P. lividus, partendo dalla fecondazione, possono essere così schematizzati: A. dopo il primo minuto: fertilizzazione dell uovo che si compone di due eventi di fusione dei gameti: (a) fusione dello sperma alla membrana plasmatica dell uovo e (b) fusione del pronucleo aploide del maschio e della femmina. La fusione dei pronuclei ripristina la diploidia, con formazione di un individuo geneticamente unico (Foto 48-49). B. dopo 3 minuti: l ovulo viene fecondato. Lo sperma si fonde con l uovo e si ha l ingresso della testa dello spermatozoo nel citoplasma dell ovulo. I granuli corticali liberano il loro contenuto che provoca il raggrinzimento della superficie dell uovo, con formazione dell involucro di fecondazione intorno a tutto l uovo (Foto 50-51). C. dopo minuti: avviene la prima divisione, il solco di scissione taglia radialmente la cellula uovo, producendone altre di uguali dimensioni. I blastomeri dell embrione sono tenuti insieme dallo strato ialino formatosi dopo la fusione dei gameti. La prima scissione forma due cellule, con un piano di scissione mediale o longitudinale, con un asse passante dal polo animale al vegetale. La seconda scissione produce quattro celle, con un asse mediale che si verifica ad angolo retto alla prima scissione (Foto 52-53). D. dopo 75 minuti: avviene la terza scissione che è equatoriale o orizzontale, taglia perpendicolarmente l asse polare con formazione di otto cellule (Foto 54). Nelle prime tre scissioni le cellule sono uguali per dimensioni, ben presto appare tra i blastomeri una piccola cavità. La quarta scissione produce l embrione di 16 cellule, che danno origine a cellule delle stesse dimensioni: i mesomeri. E. entro 2 ore: la morula racchiusa nella membrana di fecondazione si divide formando 32 cellule, e alla sesta scissione a 64 cellule, con otto livelli o strati di cellule derivanti dalla suddivisione equatoriale diseguale: i macromeri e i micromeri. Questi strati sono molto difficili da vedere al microscopio (Foto 55). F. 4 ore: blastula precoce. La fase di blastula, che incomincia allo stadio di 128 cellule, è caratterizzato dalla presenza di una cavità a contenuto liquido: il blastocele. Le cellule della blastula, i blastomeri, sono disposti in un unico strato epiteliale di forma poligonale (Foto 56). G ore: dopo la fecondazione la blastula è composta da circa 600 cellule. Sul perimetro della blastula i blastomeri formano delle ciglia parzialmente visibili. Sul polo animale si forma un piccolo ciuffo di ciglia più lungo, il ciuffo apicale. Quando la segmentazione si è conclusa, le cellule secernono un enzima che digerisce la membrana di fecondazione, e la blastula può nuotare liberamente. Nella maggior parte dei casi gli embrioni si muovono con la regione del ciuffo apicale in avanti. Le ciglia a ciuffo apicale possono essere viste se gli embrioni sono visti con illuminazione a campo scuro. Nella fase tardiva della blastula il polo vegetale si ispessisce, formando la piastra vegetale (Foto 57). H. 13 ore: formazione della gastrula. La gastrulazione inizia quando, ispessendosi di cellule, il polo vegetale forma il mesenchima primario derivante dai micromeri. Un invaginamento del polo vegetale formerà invece una depressione, chiamata blastoporo. L invaginazione si formerà in un tubo cieco, l archenteron. La punta dell archenteron, costituita dal mesenchima secondario, allungandosi verso il polo animale entra in contatto con le cellule dell ectoderma (Foto 58). I ore: nella gastrula in stato avanzato si inizia a formare pigmento echinocromo. Al termine della gastrulazione, il mesenchima secondario e le cellule mesodermiche si staccano dalla punta dell archenteron. La gastrula contiene circa cellule. Le gastrule con anomalie tendono a rimanere nella parte inferiore del contenitore di coltura (Foto 59-60). J ore: al termine della gastrulazione, dopo che la punta dell archenteron ha preso contatto con l ectoderma, questo incomincia a cambiare posizione verso un lato dell embrione, curvandosi e cambiando la forma della larva in prisma. E l inizio della differenziazione delle strutture larvali. Nel punto di contatto tra la punta dell archenteron e l ectoderma si formerà la bocca, l esofago, lo stomaco e l intestino. K. Il blastoporo formerà invece l apertura anale. Durante la fase di prisma, l embrione prende la forma di una piramide tronca. Il ciuffo apicale scompare. Le cellule mesenchimali primarie cominciano ad aggregarsi e differenziarsi in spicole triradiate, i rudimenti dello scheletro larvale (Foto 61). L. da 30 ore a 13 giorni: la larva di pluteo completa il tubo digerente, ed è in grado di nutrirsi di alghe unicellulari, come si evidenzia dai resti di alghe nello stomaco e nella bocca. L ano si evidenzia come un apertura posizionata alla metà inferiore del corpo. L apparato digerente si presenta a forma di J, mentre sia l esofago che l intestino sono allungati. Si formano quattro braccia: prima le due postorali, posizionate sul lato dorsale (anale), che estendendosi anteriormente occupano da 1/4 a 1/3 della lunghezza del corpo della larva. Le punte delle braccia e il lobo orale ad arco sono determinanti per il nuoto, e formano un imbuto per dirigere le alghe in bocca. Le braccia postorali si presentano più spesse delle due anterolaterali, visibili sul lato ventrale (aboanale),e si formeranno successivamente alle prime, e sono situate leggermente anteriormente al lobo orale. La bocca, alla base delle braccia antero-laterali, è seguita da un ristretto esofago muscolare, che espone la peristalsi durante l alimentazione. I celomi si estendono lungo l esofago. Il celoma destro è meno allungato e più rotondo rispetto al sinistro. Alla fine di questa fase, si osserva un ispessimento tra le braccia antero-laterali, che sporge leggermente sulla bocca come un labbro superiore. Questo tessuto si svilupperà nel lobo orale per tutte le fasi successive. Le braccia postorali e antero-laterali sono supportate da aste scheletriche, derivanti dalle spicole triradiate, evidenti già nella fase di gastrula avanzata (Foto ). M. Giorno 11-20: caratterizzato dalla formazione di altre due paia di braccia. Il pluteo si evidenzia con otto braccia. Appaiono due nuove coppie di braccia: le prime braccia postero dorsali situate nella parte anteriore del corpo vicino alle braccia antero-laterali. Le seconde iniziano a sviluppare tra le braccia antero-laterali, dette preorali. Si apprezza un ulteriore sviluppo degli 22 23

21 elementi scheletrici e del celoma sinistro e destro. In questa fase sopra lo stomaco si incomincia a formare l arco dorsale. Il prossimo elemento scheletrico che si sviluppa è il precursore del triradiato dell arco dorsale. Questo comincia a formarsi medialmente sopra lo stomaco, sul lato ventrale dell esofago, il celoma sinistro differenzia nel axocele, (canale di pietra), idrocele e somatocele. L idrocele è posizionato al margine anteriore dello stomaco che farà parte del rudimento scheletrico dell adulto. N. Giorno 18-35: invaginazione vestibolare. L evento morfologico più importante è la formazione del vestibolo, struttura che farà parte del rudimento adulto. In questa fase, oltre all invaginamento vestibolare, si ha l estensione del somatocele, estendendosi tra lo stomaco e l idrocele. L ectoderma comincia a invaginarsi dal lato sinistro, verso il lato destro dello stomaco. In questa fase si evidenziano numerose concentrazioni di cellule di pigmento rosso brillante. Le larve appaiono meno attive, e trascorrono molto tempo sul fondo del contenitore di coltura. Alla base delle larve si trovano pedicellarie, al centro tra le due bande ciliate. O. Giorno 29-43: caratteristica è la formazione primordiale del tubo del piede. Quando il rudimento viene osservato dal lato sinistro della larva, le proiezioni dell idrocele assomigliano ad un disco pentagonale, che andrà a formare i denti della lanterna di Aristotele (Mac Bride, 1903; Von Ubisch, 1913; Smith et al., 2008). Inizia la degenerazione delle braccia larvali. P. Giorno 37-46: i primi elementi scheletrici osservati nel rudimento sono le tre piastre preambulacrali. Si possono osservare spine sul perimetro del rudimento e strutture a forma di ventosa (Foto 65). Qualità dell acqua Le analisi chimiche condotte sull acqua di mare artificiale e naturale sono state effettuate secondo i Metodi analitici per le acque a cura dell APAT e dell IRSA-CNR per le seguenti sostanze: Metodo Cloruro (titolazione argentometrica) Principio del metodo: Titolazione degli ioni cloruro con una soluzione di nitrato d argento in ambiente neutro o leggermente basico, in presenza di cromato di potassio come indicatore: dopo la precipitazione quantitativa del cloruro d argento, si ha colorazione rosso mattone, persistente, del cromato d argento. Metodo Azoto ammoniacale (spettrofotometrico con reattivo di Nessler) Principio del metodo: L ammoniaca, (libera o idrolizzata) presente in acqua, reagisce con una soluzione alcalina di iodio-mercurato di potassio (reattivo di Nessler) per formare un complesso colorato secondo la reazione: L assorbanza del complesso colorato viene misurata alla lunghezza d onda di 420 nm. Metodo Azoto nitrico (spettrofotometrico mediante salicilato di sodio) I nitrati rappresentano l ultimo stadio di ossidazione dei composti azotati provenienti dai processi di decomposizione biologica di sostanze organiche. Principio del metodo: Il metodo si basa sulla reazione tra i nitrati e il salicilato di sodio in soluzione acida per acido solforico. Il composto ottenuto ha, in soluzione alcalina, un colore giallo stabile misurabile spettrofotometricamente alla lunghezza d onda di 420 nm. Metodo Fosforo (ortofosfato; fosforo totale) Principio del metodo: Gli ioni ortofosfato reagiscono con il molibdato di ammonio ed il potassio antimonil tartrato, in ambiente acido, formando un eteropoliacido che viene ridotto con acido ascorbico a blu di molibdeno, intensamente colorato, la cui assorbanza viene misurata alla lunghezza d onda di 882 nm. Metodo Ossigeno disciolto (titolazione iodometrica) Principio del metodo: Il metodo si basa sull ossidazione dell idrossido di manganese (II) a stati di valenza superiore in soluzione alcalina da parte dell ossigeno disciolto; per successiva acidificazione in presenza di ioduro, il manganese si riduce a Mn (II), liberando iodio in quantità equivalente all ossigeno inizialmente presente nel campione. Lo iodio messo in libertà viene titolato con una soluzione a concentrazione nota di tiosolfato sodico, in presenza di sali d amido. I parametri maggiormente misurati nelle analisi della qualità delle acque sono stati l ammonio/ammoniaca (NH 4 /NH 3 ), i nitriti (NO 2 ) ed i nitrati (NO 3 ) e PO 4 PO 3. In ambiente controllato, avanzi di mangime, escrementi, animali morti, un filtro mal funzionante possono portare all aumento dei prodotti azotati. L Ammonio NH 4 non è da considerarsi sostanza tossica in basse concentrazioni; in ambiente ricco d ossigeno si trasforma in NH 3 (ammoniaca) prodotto primario del ciclo dell azoto. L ammoniaca, invece, viene trasformata naturalmente in nitriti (NO 2 ) dai batteri del ceppo Nitrosomonas, e successivamente in nitrati. I nitriti sono tossici con livelli > 1 mg/l; i nitrati invece, risultano molto meno tossici. Per agevolare questi processi di trasformazione abbiamo aggiunto tali batteri. A causa del malfunzionamento dei filtri, o dell aumento della sostanza organica, i nitriti hanno raggiunto valori di 1,5 mg/l, causando nei ricci afflosciamento degli aculei con loro successiva perdita e una discreta moria. Ristabilendo immediatamente i parametri corretti, gli aculei si sono riformati e parte dei soggetti di P. lividus è stata recuperata. Valori di nitrati superiori a 25 mg/l portavano inappetenza. I valori dei fosfati sono risultati sempre in un range di 0,2-0,3 mg/l. Il ph, dopo una taratura del sistema elettrodico, è stato determinato con il ph-metro, risultando essere tra 8.0 e (HgI2+KI)+2NH (NH3HgI2)+2KI 2(NH3HgI2) --- NH2Hg2I3 + NH4I 24 25

22 6 - Studio sulla conservabilità a lungo termine del seme di riccio (paracentrotus lividus) È stato avviato uno studio sulla conservabilità a lungo termine del seme di riccio di mare (Paracentrotus lividus). Tale ricerca è finalizzata a verificare la conservabilità della capacità fertilizzante, nel tempo, degli spermatozoi, a temperatura di refrigerazione, rispetto ad un gruppo di controllo non trattato. E stata effettuata un analisi computerizzata del seme mediante SPERM CASA (CASA, computer assisted sperm analysis, model IVOS 12-Hamilton Thorne Bio scences, USA); nella fase preliminare, è stato necessario settare lo strumento per il riconoscimento degli spermatozoi di Paracentrotus lividus, successivamente sono state condotte analisi dettagliate per la valutazione e la caratterizzazione della motilità dei gameti. Durante la stagione riproduttiva, il seme fresco, ottenuto mediante induzione con cloruro di potassio 1 M da diversi soggetti, è stato conservato refrigerato in un apposito Buffer SSB (Sperm Storage Buffy), previa analisi dei parametri di motilità e velocità mediante SPERM CASA (Foto 73). Diversi lavori hanno mostrato l efficacia di agonisti/antagonisti oppioidergici nel modulare l attività degli spermatozoi in diverse specie. Pertanto si è pensato di valutare l efficacia anche in questa specie mediante uno studio funzionale; valutando, inoltre, la presenza e localizzazione dei recettori oppioidergici nel seme di riccio di mare (Foto 66). Del campione sono state allestite diverse aliquote, ciascuna delle quali è stata addizionata con antagonisti e agonisti di vari recettori oppioidergici: naloxone, natrindolo e DPDPE a diverse concentrazioni. Sono state prelevate giornalmente aliquote da ciascun campione e dopo attivazione con ASW (Artificial Sea Water), il seme è stato analizzato al CASA fino a completa immobilizzazione degli spermatozoi. A seconda del periodo di raccolta del seme si è riusciti a protrarre l analisi dei campioni trattati fino a 9 giorni. Per ogni analisi effettuata allo SPERM CASA sono stati registrati tutti i parametri di cinetica (VAP, VCL, VSL, ALH e Beat Frequency) nonché la percentuale di spermatozoi motili e progressivi. La vitalità degli spermatozoi è stata testata tutti i giorni verificando in vivo la capacità di fecondare le uova. In dettaglio in una piastra Petri da 3 cm sono state poste 1000 uova in 1 ml di ASW ed 1 microlitro di seme attivato derivante dalle preparazioni dei campioni da analizzare al CASA. Quindi, sono state misurate le percentuali di formazione dell involucro di fertilizzazione e della prima divisione. Contemporaneamente è stata verificata la presenza di recettori oppioidergici sugli spermatozoi, e l identificazione e localizzazione di tali recettori mediante immunofluorescenza e western blot. Nel primo caso si spottano degli spermatozoi attivati su vetrini lisinati, dopo fissazione e lavaggio si aggiunge il primo anticorpo specifico per un recettore e si lascia tutta la notte. Viene rimosso e lavato tutto ciò che non ha reagito e si aggiunge un secondo anticorpo in grado di legarsi al primo e coniugato con un fluorocromo (FITC) che permetterà l evidenziazione dell immunocomplesso mediante visualizzazione con microscopia a fluorescenza. Nel secondo caso si effettua una estrazione di proteine totali dagli spermatozoi che sono caricate su un gel di poliacrilammide e le si sottopone a separazione elettroforetica. Le proteine sono trasferite su un filtro di nitrocellulosa ed ibridate con lo stesso anticorpo utilizzato in immunofluorescenza ed in grado di riconoscere e legarsi specificamente alla proteina recettoriale ricercata. Dopo lavaggio per eliminare ciò che non ha reagito si aggiunge il secondo anticorpo in grado di legarsi al primo e coniugato con enzima (HRP), il che permetterà l evidenziazione dell immunocomplesso mediante luminescenza dopo aggiunta di Luminoled (Foto 74). Non essendo disponibili anticorpi anti recettori oppioidergici mu e delta specifici per il riccio di mare, sono stati acquistati anticorpi ottenuti nel coniglio e diretti contro i recettori di ratto. Attualmente si sta validando la specificità di questi anticorpi per il riccio. Questo studio ha mirato a migliorare la conservabilità del seme di riccio di mare (Paracentrotus lividus) sia quantitativamente, per ottenere un numero sufficiente di spermatozoi vivi e vitali con una motilità utile alla fecondazione, sia qualitativamente, prolungando il periodo di sopravvivenza degli spermatozoi. Sono state condotte diverse prove di refrigerazione per ottenere una conservabilità degli spermatozoi a breve - medio termine. Tale esperimento sfrutta metodiche sperimentate già in altre specie equine (Albrizio et al., 2010), e ben si adatta alle esigenze di riproduzione di specie di alto valore economico come il riccio di mare. Il secondo step del nostro lavoro punterà al congelamento del seme per arrivare ad una conservabilità a lungo termine. Dato che prove di allevamento sperimentale si effettuano ormai da diversi anni, pensiamo che il nostro studio ben si integri con tale realtà. Tra i nostri obiettivi c è quello di effettuare prove di conservazione a medio e a lungo termine anche sugli ovociti, per giungere ad una migliore conservabilità di entrambi i gameti di questa specie. 7 - Qualità nutrizionali La composizione chimica delle gonadi del Paracentrotus lividus varia in base alle stagioni e alla dieta (Fernandez, 1997); in generale, è un alimento ricco di acqua, la sostanza secca è ricca di proteine e relativamente povera di lipidi; la frazione lipidica è ricca in acidi grassi polinsaturi (Cengarle et al., 2003), il contenuto di carboidrati è scarso. Da analisi chimiche secondo le metodologie suggerite dalla Commissione Valutazione degli Alimenti dell A.S.P.A. (1980), condotte presso il Laboratorio di Nutrizione Animale della sezione di Cliniche Veterinarie e Produzioni Animali del D.E.T.O. su n. 25 campioni di gonadi di Paracentrotus lividus pescati nel Mar Adriatico, il contenuto in umidità oscilla dal 82 all 84%, quello in proteina grezza dal 12 al 14%, quello in lipidi grezzi dal 2 al 3%, quello in ceneri dal 1,5 al 2%. Il contenuto totale in proteine e la loro tipologia sono fortemente legati al periodo di maturità delle gonadi e segue per questo motivo un ciclo stagionale variando dal 36 al 60% (sulla sostanza secca). Il maggior contenuto di proteine si osserva in concomitanza con i valori più alti di glicogeno che sembrerebbe costituire la fonte di energia utilizzata per la sintesi proteica durante la gametogenesi. Le caratteristiche organolettiche del riccio di mare vengono attribuite fondamentalmente a 5 aminoacidi: glicina, alanina, glutammato, valina e metionina. Quest ultimo aminoacido conferisce forti sensazioni di amaro e costituisce l ingrediente chiave delle caratteristiche gustative delle gonadi di riccio. La composizione della frazione lipidica è anch essa fortemente condizionata dal ciclo stagionale e dal regime alimentare dei ricci. Studi effettuati su ricci selvatici e allevati hanno mostrato l influenza della composizione della dieta sul livello dei lipidi totali e sulla composizione della frazione degli acidi grassi, dei quali quelli maggiormente presenti sono: l acido eicosapentaenoico (EPA), docosapentaenoico (DPA) e docosahexaenoico (DHA) oltre a molti altri acidi grassi in concentrazioni minori

23 Per quanto riguarda la frazione vitaminica questa è legata fortemente al tipo di alimentazione ed è rappresentata dalle vitamine liposolubili: Vit. E (alfa-tocoferolo), dalla provit. A (betacarotene) e dalla Vit. K. Sono presenti in basse concentrazioni le vitamine idrosolubili del gruppo B, acido pantotenico (Vit. B5), acido folico (Vit. B9), Vit. B1, B2, B3 e B6 e la vitamina C. Le sostanze inorganiche sono rappresentate fondamentalmente da sodio, potassio, magnesio, calcio e fosforo, inoltre sono presenti interessanti concentrazioni di zinco, manganese, selenio e ferro. Il colore è legato alla concentrazione dei coloranti ingeriti durante la dieta anche se la colorazione delle gonadi è stata messa in relazione al sesso poiché i ricci maschi presentano gonadi colorate in gialloarancio più o meno chiaro, mentre i ricci femmina rosso o arancio brillante. Le caratteristiche aromatiche rappresentano il metodo più semplice per valutare la piacevolezza organolettica del riccio e definirne il prezzo sui mercati internazionali. Analisi descrittive hanno evidenziato che le gonadi dei ricci maschi presentano un aroma dolciastro, mentre le gonadi di riccio femmina presentano un sapore più amaro e acido, con un sentore erbaceo e metallico. La composizione della frazione aromatica non è stata ad oggi ancora completamente approfondita ed è possibile individuare in letteratura solo delle informazioni parziali. 8 - Alimentazione In allevamenti a circuito chiuso sono necessarie delle diete artificiali che consentano di far raggiungere ai giovanili la taglia commerciale corrispondente a 70 mm (aculei inclusi) al di sotto dei tempi indicati (tre anni). La maggior parte delle diete artificiali sono costituite da farina di soia, cereali, in alcuni casi proteine di origine animale e lipidi (Cook et al., 1998; Fernandez & Boudouresque, 2000; Spirlet et al., 2001); si presentano in forma di mangimi umidi o a base di agar (Klinger et al., 1994,), pellet ed estrusi. (Olave et al., 2001) Gonadi di eccellente qualità devono rispettare degli standard qualitativi tra i quali il principale è la colorazione. Questo parametro è il principale gap nelle sperimentazioni condotte (Robinson et al., 2002). Il colore delle gonadi è in funzione del contenuto di carotenoidi e una colorazione scadente è il diretto risultato dei livelli troppo bassi nella dieta. Gli animali marini contengono differenti tipologie di carotenoidi classificabili per diversità strutturale. L accumulo di carotenoidi deriva da componenti della loro alimentazione, modificate attraverso reazioni metaboliche. Molti dei carotenoidi presenti negli animali marini sono metaboliti del ß-carotene, fucoxantina, peridinina, diatoxantina, alloxantina, astaxantina, ecc. Dai primi studi sulla struttura del beta carotene di Kuhn e Karrer nel sino al 2004 sono stati riportati circa 750 carotenoidi presenti in natura. Di tutti i 750 ritrovati in natura, più di 250 hanno origine dall ambiente acquatico. In linea generale, gli animali non sintetizzano i carotenoidi de novo come mostrato in figura 5. Le principali conversioni metaboliche dei carotenoidi sono l ossidazione, la riduzione, lo spostamento del doppio legame, la rottura ossidativa del doppio legame, la rottura del legame epossidico. Figura 5 Il 9 cis-echinenone è il principale carotenoide presente nelle gonadi di riccio di mare. È un metabolita ossidativo del ß-carotene. Il principale problema riscontrato in acquacoltura nel miglioramento qualitativo delle gonadi, come già esposto, è la colorazione dovuta a una crescita gonadica più veloce dell accumulo di carotenoidi (Plank et al., 2002). Come è noto, gli Echinoidi non possono sintetizzare i carotenoidi de novo, quindi il pallore delle gonadi è dovuto unicamente a un apporto alimentare insufficiente (Pearce et al., 2010; Muki et al., 2004). Per tale ragione è difficile compensare questo squilibrio perché la deposizione è strettamente correlata alla bio-conversione del beta-carotene a echinenone. Lavori condotti da Nils T. Hagen in Norvegia hanno dimostrato le differenze intraspecifiche fra i due sessi nell intero ciclo riproduttivo di Strongylocentrotus droebachiensis. Maschi e femmine di S. droebachiensis dimostravano distintamente differenti pattern di variazione in contenuto di carotenoidi, con una deplezione e un accumulo stagionale nelle femmine (Lawrence et al., 2004) e una conservazione nel maschio. Le femmine perdono approssimativamente il 71.1% del loro echinenone durante lo spawning con successiva deposizione durante l accumulo di fagociti nutritivi durante la ricrescita delle gonadi. I livelli di carotenoidi nella femmina (da 100 a 275 μg g -1 sostanza secca), sebbene più bassi e meno variabili dei livelli di carotenoidi del maschio. Il maschio non ha una riduzione del livello di carotenoidi durante lo spawning, e la concentrazione degli stessi nelle gonadi varia da >600 a <200 μg g -1 (sostanza secca), apparentemente come risultato passivo di un aumento della grandezza delle gonadi. Questa considerazione deriva dal fatto che gli spermatozoi non contengono carotenoidi per cui il maschio non richiede conseguentemente un riaccumulo annuale di carotenoidi. Analizzare e quantificare l alimentazione del riccio di mare risulta essere tuttora un ostacolo dovuto a problemi puramente tassonomici nell identificare tutti i frammenti di alghe presenti nel tratto digestivo e all elevato dispendio di tempo che comportano gli esami di microscopia. Tuttavia, le informazioni nutrizionali sono essenziali per comprendere il ruolo ecologico di quest erbivoro nella comunità bentonica e poterne gestire le modalità di pesca. Per tali studi è in uso un metodo qualitativo, HPLC (high performance liquid chromatography), utilizzato per la prima volta da Hawkins et al. (1986). Sono state testate innumerevoli diete volte ad accelerare la crescita e migliorarne il sapore (Pearce et al., 2002; Cook et al., 2007; Lawrence et al., 2007). Le proteine animali di solito portano ad un buon tasso d accrescimento (Pearce et al., 2002; Schlosser et al., 2005) Tuttavia è stato evidenziato che nella specie Paracentrotus lividus, quando nella dieta viene 28 29

24 superata una certa quantità di proteine animali, la crescita non è proporzionale (Cook & Kelly, 2007b), e una percentuale eccessiva di proteine animali può comportare la comparsa di ciò che viene definito off-flavors delle gonadi e un gusto decisamente amaro delle stesse (Hammer et al., 2006). Il sistema digestivo del riccio di mare contiene enzimi quali soprattutto carboidrasi e, in misura minore, lipasi e proteasi (Lawrence et al., 2007). Studi enzimatici portati avanti in tre specie di Echinoidi regolari A. lixula, P. lividus, S. granularis, hanno dimostrato che l attività specifica dell amilasi è significativamente più alta (p 0.05) mentre P. lividus mostra il valore statisticamente più basso (Tabella 4). Di conseguenza A. lixula mostra un attività intermedia che non è statisticamente differente dalle altre due specie. In accordo con l attività specifica della lipasi i valori sono significativamente (p 0.05) più alti in A. lixula rispetto alle altre due specie che invece mostrano un valore simile (Tabella 4). La proteasi totale ottenuta come somma della sua attività a diversi ph manifesta il più alto valore in A. lixula seguita da P. lividus ed infine S. granularis. Anche A. lixula ha dimostrato avere una protesi acida più significativa delle altre due specie. L agar è un polisaccaride estratto dalla parete cellulare di alcune specie di alghe rosse dei generi Gelidum e Gracilaria. La sua struttura macromolecolare origina un gel forte composto dal 99% di acqua insolubile in acqua fredda e resistente alla re-idratazione. Per queste ragioni, l agar è un ottimo addensante, usato nelle formulazioni di mangimi in acquacoltura alla concentrazione del 2-3%. La sua insolubilità limita la perdita di nutrienti del mangime durante i periodi di immersione in acqua nei sistemi a circuito chiuso. In questo lavoro sono state testate le caratteristiche reologiche dell agar estratto dalle alghe, al fine di poterlo utilizzare per la formazione di pellet per l alimentazione di Echinoidi in allevamenti intensivi in circuiti chiusi e semi-chiusi. L agar utilizzato in questa sperimentazione ha dimostrato elevata stabilità in acqua: il pellet manteneva la compattezza per la durata dell intera prova sperimentale di sei giorni. In aggiunta, l agar, in concentrazioni sia del 3 che del 6 %, non ha causato effetti negativi sull assorbimento degli altri nutrienti ed è stato metabolizzato dal Paracentrotus lividus, non influenzandone né il colore né il sapore delle gonadi. Il pellet è stato facilmente consumato e sebbene il pellet a base di mangime commerciale Classic portava a una resa gonadica maggiore, il pellet a base di Ulva lactuca (Ulvales) forniva identici risultati in termini di maturazione dei gameti e nella resa delle gonadi. Studi condotti da Fernandez & Boudouresque, invece, sull effetto di differenti diete artificiali hanno dimostrato che la crescita del Paracentrotus lividus si basa su quattro fattori: la quantità del cibo ingerito, il totale del cibo assorbito, la taglia e la quantità di sostanza secca assorbita. Tabella 4 enzimi digestivi Il profilo enzimatico digestivo dei tre Echinoidi regolari studiati (A. lixula, P. lividus e S. granularis) avvalora la tesi secondo cui è probabile che si siano evoluti per adattarsi a particolari habitat e che il contenuto più o meno significativo di alcuni enzimi riflette il tipo di alimentazione naturale. Ulteriori indagini sul profilo enzimatico del Paracentrotus lividus potrebbero aiutare le ricerche per la formulazione di nuovi mangimi da applicare nell ormai crescente settore dell acquacoltura. Sembra, comunque, che le diete formulate per rispettare gli standard di qualità e colore delle gonadi debbano presentare una certa percentuale di macro alghe (Muki et al., 2004). Va inoltre ricordato che le alghe migliorano anche l appetibilità dell alimento e conseguentemente ne aumentano il tasso d ingestione (Dworjanyn et al., 2007). Tuttavia, le alghe sono soggette a fluttuazioni stagionali e quindi a variazioni nel profilo nutrizionale e alla biodisponibilità ambientale. Lo studio effettuato da Fabbrocini e D Adamo si è concentrato sullo sviluppo di un mangime a base di macro alghe, facile da trasferire e stoccare per lunghi periodi, in modo da poter essere preparati nei tempi ottimali per valore nutrizionale e costi. Un aspetto non trascurabile, oggetto del lavoro, è stato il mantenimento delle qualità chimicofisiche dell alimento in immersione in acqua. A tale scopo nel presente lavoro sono state formulate tre diete: due a base di omogenato di alghe e uno di mangime artificiale Classic K, per trote e pesci-gatto, con aggiunta di due differenti percentuali di Agar, al 3 e 6% somministrate sotto forma di pellet delle dimensioni di 5 cm di diametro e 10 mm di spessore. Un numero noto di esemplari di Paracentrotus lividus nel suddetto lavoro è stato alimentato con tre differenti diete artificiali: farine vegetali e oli vegetali, ricchi di carboidrati solubili (58%), farine di pesce e farine vegetali in pari quantità miscelato con olio di pesce e olio vegetale (29% proteine solubili e 35% di carboidrati solubili) e la terza costituita da farine di pesce e olio di pesce, ricco di proteine solubili (47%). Tutte e tre le miscele sono state distribuite in forma pellettata delle dimensioni 1x1x1,5cm. È stato dimostrato tramite test statistico ANOVA che tra gli individui alimentati con tre differenti diete, vegetale, mista e animale, si riscontrava il più alto tasso di ingestione con la dieta vegetale. Altresì, il più alto tasso d assorbimento è stato ottenuto con la dieta di tipo animale. L assorbimento infatti ha una correlazione negativa tra il tasso d ingestione e i livelli di carboidrati nell alimento. L utilizzazione alimentare è stata più bassa con la dieta vegetale e più alta con quella animale. Inoltre, l accumulo di energia è influenzato dalla qualità dell alimento e dalla taglia dell echinoide. Nel lavoro di Olivier Basuyaux sono state testate sei diete in circuito semi-chiuso per lo studio della crescita e della mortalità del Paracentrotus lividus. Tre di queste diete erano a base di alghe (Palmaria palmata, Laminaria digitata e un mix di L. digitata (80%) e P. palmata (20%)), le altre tre erano a base di mais (Zea mays) (mais o un mix di mais (80%) e P. palmata (20%) e mais (80%) e L. digitata (20%). Il miglior tasso d accrescimento si è ottenuto con un mix di mais e P. palmata, mentre il più basso tasso di conversione si è ottenuto con le diete a base di alghe. La mortalità non era significativamente differente tra le diete. In tutti i tentativi di condurre un allevamento di Echinoidi sperimentale, la fase di alimentazione avveniva random e gli individui venivano posti in vasche o cestelli forati. Questo produceva aggregati e deposito di mangime, impedendo all acqua il normale ricircolo e le modalità di pulizia e rimozione più lunghe e dispendiose di tempo e lavoro

25 Inoltre per invertebrati marini come i ricci di mare tendenzialmente detritivori e brucatori con abitudini fossorie sono necessarie ampie superfici per consentire loro il movimento e lo spostamento, soggetti come ben noto, a un ciclo circadiano. In questa overview, UrchinPlatter System si presenta come il sistema più innovativo e completo per l echinocoltura in-shore. Sviluppato dalla Gourmet Marine, in collaborazione con l UCC di Cork in Irlanda, è ormai brevettato in tutto il mondo. Questo sistema si avvale dell utilizzo di gabbie, definite Stacks, all interno di una vasca raceway per ottimizzare l allevamento ad elevati livelli di biomassa e densità. Può essere utilizzato sia per le fasi di ingrasso e pre-ingrasso dei giovanili, che per le fasi di finissaggio. L innovazione del UrchinPlatter System sta nel fatto che questo sistema è compatibile con entrambi i tipi di alimentazione, naturale con l apporto di macroalghe, che artificiale. Lo schema (Figura 6) riportato di seguito sintetizza i vantaggi che quest innovazione porta nell acquacoltura, e nello specifico nella somministrazione dell alimento In questo modo la densità d allevamento e la crescita sono massimizzate. Il Platters è poi assemblato per essere posto in una gabbia definita Stack. In questa modalità l alimento può essere somministrato una volta alla settimana. Le caratteristiche ecologiche e fisiologiche del riccio di mare hanno consentito di integrare a produzioni già consolidate l allevamento del riccio di mare. Pertanto, nell ambito di un acquacoltura sostenibile, si stanno sviluppando numerose forme di co-coltura. Sono note prove d allevamento condotte in Scozia con Mytilus galloprovincialis e in Italia con Ostrea edulis al fine di limitare il fenomeno di comparsa del biofouling sulle strutture utilizzate per l allevamento. Nel Nord Est della Scozia sono state altresì portate avanti prove sperimentali da E.J. Cook & M.S. Kelly della Scottish Association for Marine Science di co-coltura di salmone atlantico Salmo salar e Paracentrotus lividus. L esperimento è stato condotto posizionando un numero noto di soggetti a distanze note dalle gabbie in cui sono allevati i salmoni e nello specifico: 0 m e 15 m. La crescita gonadica non variava nei due differenti punti, ma a 0 m la presenza di acidi grassi 22:1n-11 e elevati livelli di acidi grassi n-3 a lunga catena DHA 22:6n-3 nel tessuto gonadico conferma il consumo di POM e sottolinea l importanza che può derivarne ed i benefici che il consumo di questo tipo di uova può apportare alla salute umana. Paracentrotus lividus è in grado di utilizzare i pellet in eccesso non consumati dai salmoni in allevamento e il materiale e il biofouling che si accumula nelle gabbie. Questo sistema offre anche dei vantaggi a livello ambientale. I risultati hanno inoltre dimostrato che non è necessario fornire nessun mangime fino a due mesi prima del periodo di commercializzazione, periodo in cui è necessario sostituire l alimentazione per portare le uova a standard qualitativi eccellenti. Inoltre secondo Robinson et al., (2002) aggiungendo concentrato di betacarotene (250 mg kgß1) a una dieta artificiale possono essere ottenuti i più alti valori del rosso ( 26) e del giallo ( 17) nel tessuto gonadico di Strongylocentrotus droebachiensis. Il ß-carotene è solo il precursore del 9-cis echinenone, il principale pigmento delle gonadi del Paracentrotus lividus (Symonds et al., 2007) La meccanochimica della chemiotassi Figura 6 UrchinPlatter System La chemiotassi (neologismo composto dalle parole greche chemeia = chimica e taxis = schieramento), un tipo di tassia, è il fenomeno con cui i corpi cellulari, batteri ed altri organismi uni- o multi-cellulari direzionano i loro movimenti a seconda della presenza di alcune sostanze chimiche nel loro ambiente. 1- Le alghe sono semplicemente poste in vasca con gli animali. L accumulo di materiale organico e la biomassa limitano il flusso dell acqua. Efficienza e densità di allevamento sono compromessi. 2- Le alghe o i mangimi sono posti su una piastra, fornendo superficie per lo spostamento e l alimentazione. L impiego dei volumi è massimizzato e si riduce il deposito di materiale organico. 3- In altri sistemi d allevamento si somministra il mangime che si deposita sul fondo della vasca dove sono presenti gli animali. In questo modo si spreca una grande porzione del volume disponibile in vasca e si aumentano i costi di produzione. Nello specifico, UrchinPlatter System è costituito da delle piastre definite Platter. L alimento viene messo tra le due piastre perforate, con una piastra rigida posta dietro, a supporto dello strato di alimento inserito tra le due. Su questa piastra gli Echinoidi possono aderire e consumare l alimento. Questo sistema unico di alimentazione fornisce ad ogni animale dello spazio per muoversi e nel contempo di alimentarsi Scopo della Ricerca Il nostro obiettivo è stato quello di valutare le preferenze alimentari di Paracentrotus lividus allevato in vasche ospitate presso gli stabulari di Medicina Veterinaria di Bari, allo scopo di definire protocolli operativi trasferibili nelle pratiche di acquacoltura. Le vasche sono state riempite con acqua di mare (SHW) con sale sintetico alla concentrazione di 35 gr/l e portate a un volume di 200 litri. La temperatura misurata giornalmente era stata stabilita a 20 ± 1 C. Il ricircolo dell acqua era garantito da un sistema di vasi comunicanti con due filtri a secchio esterni con un refrigeratore che garantiva la temperatura impostata. Il filtro veniva caricato con 3 litri di cannolicchi Siporax più tre spugne di diversa granulometria e 200 gr di zeolite. Le vasche sono state rialzate e poste su supporti della altezza di 50 cm per garantire la corretta funzionalità del filtro. I valori di NO 2 e NH 3 /NH 4 (kit rapido da campo a viraggio di colore Sera Italia) misurati prima di ogni somministrazione sono risultati sempre assenti

26 Per quanto riguarda le diete formulate, il protocollo sperimentale ha previsto preparazioni alimentari con ingredienti differenti (proteine animali vs. proteine vegetali e addensante animale vs. addensante vegetale) nonché tecniche di preparazione differenti (umido vs. secco). All uopo sono state utilizzate tre vasche in PVC da 80 litri munite di: Filtro Ehime 350 professional (per volumi di 350 litri) Filtro Ehime 700 professional (per volumi di 700 litri) Refrigeratore Teco TC20 (per volumi di 1000 litri) Skimmer Bubble 350 Zeolite Pietre coralline Termometro Griglie in PVC. 6) N.D.F. (fibra neutro detergente); 7) A.D.F. (fibra acido detergente); 8) A.D.L. (lignina acido detergente); 9) A.I.A. (ceneri acido insolubili); 10) N.D.S. (solubili al detergente neutro = N.D.F.); 11) Cellulosa (A.D.F. - A.D.L. - A.I.A.); 12) Emicellulose (N.D.F. - A.D.F.). Entrambi i mangimi sono stati mescolati con il 10% di una soluzione di Agar (20 gr/l) e le miscele ottenute sono state spalmate su due pietre di mare di identiche dimensioni e collocate nelle vasche di allevamento dei ricci ai poli opposti secondo il seguente schema: In ogni vasca sono stati distribuiti 10 ricci di mare dal diametro medio di mm compresi gli aculei. I ricci di mare sono stati posizionati al centro delle vasche, lungo una linea orizzontale, mentre ai due poli sono state posizionate delle pietre di mare sulle quali erano state fatte aderire le preparazioni alimentari oggetto dell indagine (Foto ). Vegetali Animali Vegetali Dopo 24 e 48 ore si procedeva alla valutazione della posizione dei ricci in modo da stabilire quale tra le due preparazioni alimentari stimolava maggiormente la chemiotassi. A 96 ore dall inizio del test, i ricci venivano riposizionati lungo la linea centrale della vasca mentre le preparazioni alimentari venivano invertite come posizione e sempre a 24 e 48 ore si procedeva alla rivalutazione della posizione assunta dai ricci. Vediamo in particolare i diversi test condotti ed i risultati ottenuti: Vegetali Animali Animali 1 test (proteine animali vs. proteine vegetali) Sono stati preparati 2 mangimi sperimentali dalla composizione percentuale riportata in tabella 5 mentre nella tabella 6 viene riportata la composizione chimica percentuale ottenuta utilizzando le metodiche suggerite dalla Commissione Valutazione degli Alimenti dell A.S.P.A. (1980). riccio di mare Schema Test sulle preferenze alimentari: (proteine animali) posizione dei ricci di mare a 0 ore In particolare sono stati determinati: 1) Proteina Grezza (metodo Kjeldahl); 2) Lipidi Grezzi (Estratto etereo); 3) Fibra Grezza (metodo Weende); 4) Estrattivi inazotati (per differenza a cento); 5) Frazioni fibrose (metodo Van Soest); 34 35

27 Mangime animale Mangime vegetale Mais 46,50 32,20 Farina di aringhe 20, Farina di estrazione di Soia ,00 Glutine di Mais ,00 Grano tenero 10,00 1,85 Olio di lino ,50 Erba medica sfibr. 20,00 20,00 Fosfato Bicalcico 1,00 2,50 Calcio carbonato 2,45 3,00 L-Lisina ,20 DL-Metionina ,30 Treonina ,10 Premix * 0,05 0,05 Totale 1000,00 100,0 Dopo aver posizionato le pietre in vasca, i ricci di mare iniziavano ad esporre le pedicellarie in direzione del mangime. A 24 ore si è valutata l attivita chemiotattica dei ricci di mare registrando la posizione assunta dai ricci nelle vasche di allevamento e quindi la preferenza tra la preparazione contenente proteine animali (farina di aringhe) e quella contenente proteine vegetali (farina di estrazione di soia e glutine di mais). Vegetali Animali Vegetali Tabella 5 composizione dei mangimi sperimentali *Contenente per kg di prodotto: vitamina A 12,000 IU; vitamina E 10 mg; vitamina D 2,200 IU; niacina 35.0 mg; D-pantotenicoacid 12 mg; riboflavina 3.63 mg; piridossina 3.5 mg; tiamina 2.4 mg; acidofolico 1.4 mg; biotina 0.15 mg; vitamina B 0.03 mg; Mn 60 mg; Zn 40 mg; Fe 1,280 mg; Cu 8 mg; I 0.3 mg; Se 0.2 mg. Animali Vegetali Animali Mangime animale Mangime vegetale Umidità 8,65 8,97 Proteina Grezza 24,62 24,39 Estratto Etereo 5,11 5,03 Fibra Grezza 3,34 3,59 Ceneri 6,93 6,64 N.D.F. 11,21 11,50 A.D.F. 6,31 6,27 A.D.L. 1,87 1,75 Emicellulose 4,90 5,23 Cellulosa 3,44 4,52 Calcio 2,25 2,19 Fosforo 0,81 0,80 Dati calcolati Lisina 1,23 1,22 Metionina 0,51 0,53 Metionina + Cistina 0,88 0,86 Treonina Tabella 6 composizione chimica percentuale dei mangimi sperimentali *calcolate sulla base dei contenuti in aminoacidi di ciascun componente la miscela, secondo le Tabelle Nutrizionali dei Mangimi Semplici, edite dall Associazione Nazionale Produttori di Alimenti Zootecnici (ASSALZOO, 1989). riccio di mare Figura 7 Test sulle preferenze alimentari (proteine animali vs. proteine vegetali): posizione dei ricci di mare a 24 ore Vegetali Animali Vegetali Animali Animali Vegetali riccio di mare Figura 8 Test sulle preferenze alimentari (animale vs. vegetale): posizione dei ricci di mare a 48 ore 36 37

28 Vegetali Animali Vegetali Vegetali Animali Vegetali Animali Vegetali Animali Animali Vegetali Animali riccio di mare Figura 9 Test sulle preferenze alimentari (animale vs. vegetale): posizione dei ricci di mare a 96 ore riccio di mare Figura 11 Test sulle preferenze alimentari (animale vs. vegetale): posizione dei ricci di mare a 144 ore 2 test (addensante animale vs. addensante vegetale) Vegetali Animali Vegetali Il mangime contenente farina di estrazione di soia e glutine di mais è stato mescolato con il 10% di una soluzione di Agar 20 gr/l (addensante vegetale) e con il 10 % di una soluzione di colla di pesce (20 gr/l); le miscele ottenute sono state spalmate su due pietre di mare di identiche dimensioni e collocate nelle vasche di allevamento dei ricci ai poli opposti secondo il solito schema: riccio di mare riccio di mare Vegetale Animale Vegetale Animali Vegetali Animali riccio di mare Figura 10 Test sulle preferenze alimentari (animale vs. vegetale): posizione dei ricci di mare a 120 ore Animale Vegetale Animale riccio di mare Figura 12 Test sulle preferenze alimentari (addensante animale vs. addensante vegetale): posizione dei ricci di mare a 24 ore 38 39

29 Vegetale Animale Vegetale Vegetale Animale Vegetale Animale Vegetale Animale Animale Vegetale Animale riccio di mare Figura 13 Test sulle preferenze alimentari (addensante animale vs. addensante vegetale): posizione dei ricci di mare a 48 ore riccio di mare Figura 15 Test sulle preferenze alimentari (addensante animale vs. addensante vegetale): posizione dei ricci di mare a 120 ore Animale Vegetale Animale Vegetale Animale Vegetale Vegetale Animale Vegetale Animale Vegetale Animale riccio di mare Figura 14 Test sulle preferenze alimentari (addensante animale vs. addensante vegetale): posizione dei ricci di mare a 96 ore riccio di mare Figura 16 Test sulle preferenze alimentari (addensante animale vs. addensante vegetale): posizione dei ricci di mare a 144 ore 40 41

30 3 test (preparazione umida vs. preparazione secca) Il mangime contenente farina di estrazione di soia e glutine di mais, mescolato con il 10% di una soluzione di Agar 20 gr/l utilizzato nel 2 test, è stato, una volta spalmato su pietra, essiccato in stufa alla temperatura di 105 C al fine di ottenere una maggiore adesione della preparazione alimentare alla pietra riducendo nel contempo la sua solubilizzazione in acqua di mare. secca umida secca Sono quindi state messe a confronto la preparazione alimentare umida con quella essiccata sempre secondo lo schema dei test precedenti. umida secca umida umida secca umida riccio di mare Figura 17 Test sulle preferenze alimentari ( secca vs. umida): posizione dei ricci di mare a 96 ore secca umida secca riccio di mare Figura 15 Test sulle preferenze alimentari ( secca vs. umida): posizione dei ricci di mare a 24 ore umida secca umida umida secca umida secca umida secca secca umida secca riccio di mare Figura 16 Test sulle preferenze alimentari ( secca vs. umida): posizione dei ricci di mare a 48 ore riccio di mare Figura 18 Test sulle preferenze alimentari ( secca vs. umida): posizione dei ricci di mare a 120 ore 42 43

31 9 - Patologia umida secca umida Le patologie assimilabili alla Bald-sea-urchin (riccio calvo) sono conosciute da circa un trentennio (Johnson, 1971; Becker et al., 2008). Tali patologie, riscontrate in molti areali geografici talvolta distanti migliaia di chilometri tra loro, colpiscono direttamente alcune specie di Echinoidi regolari causando focolai epidemici e mortalità di massa (Pearse et al., 1977). Nel Mediterraneo sono stati osservati diversi episodi che hanno colpito e colpiscono, con una certa ricorrenza, popolazioni del riccio edule Paracentrotus lividus (Lamarck & Maes, 1983; Maes et al., 1986; Zizzo et al., 2004). Anche nelle stesse aree costiere pugliesi sono stati osservati focolai di malattia del riccio calvo con ripercussioni economiche di un certo rilievo, tenendo conto che tale specie è commercializzata a scopo alimentare (Marano et al., 1995). secca umida secca riccio di mare Figura 19 Test sulle preferenze alimentari ( secca vs. umida): posizione dei ricci di mare a 144 ore (Foto 68-69) Attualmente sono in corso prove di accrescimento su ricci di mare, utilizzando mangimi a livello proteico differente, al fine di individuare gli apporti ottimali di sostanze azotate nelle diverse fasi di crescita. Parallelamente, sono in fase di attuazione indagini sperimentali sulla durabilità del mangime in acqua, utilizzando tecniche di preparazione e/o additivi agglomeranti differenti. I risultati delle suddette sperimentazioni saranno oggetto di pubblicazioni scientifiche su riviste specializzate del settore. Dai campioni di Paracentrotus lividus usati per le sperimentazioni che macroscopicamente e apparentemente sembravano sani, n. 35 esemplari, dopo 2-8 giorni dal posizionamento nelle vasche hanno iniziato a mostrare abrasioni che interessavano aree più o meno ampie, con diametro compreso tra 2-40 mm; le aree erano caratterizzate dal diradamento degli aculei e dei pedicelli e dal colorito rosso intenso dell epidermide. Con l aggravarsi delle lesioni si notava dapprima un sottilissimo strato biancastro, sul quale si instaurava un processo ulcero-necrotico che successivamente assumeva un colore verde scuro. Il dermascheletro subiva quindi un progressivo assottigliamento fino, talvolta, a perforarsi (Foto 70-71). Gli organi interni inoltre apparivano sofferenti e di dimensioni ridotte. In particolare le gonadi si presentavano atrofizzate, soprattutto in corrispondenza delle regioni interessate dalle lesioni. I soggetti sono stati analizzati dal punto di vista anatomo-patologico e microbiologico ed è stata effettuata una valutazione del sedimento della cavità gonadica alla ricerca di eventuali parassiti. L esame istopatologico è stato effettuato previa dissezione degli esemplari e il campionamento del dermascheletro, delle gonadi e dell apparato digerente sono stati quindi fissati in formalina neutra tamponata al 10% per 72 h. Successivamente si è provveduto alla decalcificazione delle strutture, alla processazione dei campioni e alla preparazione di sezioni istologiche (spessore µm) colorate con ematossilina-eosina, tricromica di mallory, tricromica di Azan Heidenhain. Le valutazioni microbiologiche sono state effettuate su campioni di tessuto ulcerato dei soggetti colpiti. Dopo incubazione in Alcaline Pepton Water (APW) a 37 C per 24h, un ansata del brodo di arricchimento è stata seminata su piastre di TiosulfateCitrate bile saltsurcrose (TCBS), incubate a 37 C per 24h. Sulle colonie sospette sono state effettuate prove di identificazione: colorazione Gram, test dell ossidasi, prova della beta-galattosidasi. L identificazione biochimica è stata effettuata mediante sistema miniaturizzato Api 20 NE (BioMarieux-Francia). L esame istologico ha fatto osservare necrosi ed infiltrazione di amebociti nei tratti della lesione, atrofia e scompaginamento delle gonadi (Foto 72). La determinazione microscopica ha consentito di isolare ceppi appartenenti alla famiglia Vibrionacaea identificati come Vibrio vulnificus nei campioni di Echinoidi in cui gli effetti della patologia erano evidenti (Foto 73)

32 10 - Policoltura Un modello di acquacoltura sostenibile, ben noto a livello mondiale, è rappresentato dalla policoltura, pratica che tende ad associare nello stesso ambiente di allevamento, più specie per sfruttarne i principali livelli trofici, massimizzando il rendimento dell allevamento e il ritorno economico. Uno dei problemi principali dell ostreocoltura è il fouling, cioè vegetali o animali che si insediano sulla superficie delle strutture adibite alla coltura. In questa sperimentazione abbiamo utilizzato l allevamento di ostriche dell azienda Algesiro Srl sita a miglia nella zona prospicente il golfo di Manfredonia. L impianto di tipo flottante costituito da n camere da allevamento utilizza Lanternet formato da elementi di plastica modulari ed impilabili ad una profondità cha varia dai 10 ai 12 metri. potrebbero quindi essere sfruttati commercialmente in policoltura. Questi risultati suggeriscono che il controllo biologico potrebbe essere un metodo efficiente ed ecologicamente corretto di affrontare il problema delle incrostazioni nella coltivazione di ostriche Conclusioni La ricerca sull acquacoltura cerca di conciliare l interesse nei confronti dei prodotti allevati, con la sostenibilità delle produzioni. Nell allevamento dei ricci di mare, la stessa ricerca si è prefissata l obiettivo della messa a punto di tecniche di allevamento adeguate alle esigenze del settore, per sopperire alla richiesta di mercato, ormai diventata insufficiente. Le prove sono iniziate nel marzo 2012 e sono terminate ad Ottobre 2013 utilizzando n 450 lanterne utilizzate per l ingrasso di ostriche; di queste n. 350 per la sperimentazione e n.150 di controllo. Sono stati posizionati, per ogni scompartimento delle lanternet, n. 30 Ostrea edulis delle dimensioni di 2,5-3 cm e n. 8 Paracentrotus lividus. Dal sito sono stati monitorati i parametri di base come: la temperatura, la salinità e l ossigeno disciolto, che risultavano nella norma del periodo stagionale e le microalghe presenti. Dopo sette mesi è stato valutato l indice di accrescimento dei soggetti che avevano raggiunto la taglia commerciale di 80 gr e 8 cm circa di lunghezza e quelli di controllo che raggiungevano una taglia di 70 gr e 6,8 cm circa. Sulle lanterne con i ricci si venivano a formare il 50% in meno delle incrostazioni di organismi e conchiglie residue che normalmente proliferano sulla rete della stesse durante l allevamento. Abbiamo constatato che i ricci di mare sono stati efficaci per la crescita delle ostriche e L obiettivo principale del presente progetto è cercare di migliorare le conoscenze attualmente disponibili per individuare protocolli operativi utili all allevamento del Paracentrotus lividus, indirizzando la ricerca su: 1. procedura di allevamento larvale (tecnica di riproduzione e di alimentazione); 2. formulazione di un mangime per l accrescimento corporeo e gonadico; 3. studiare la conservabilità a lungo termine del seme del P. lividus; 4. policoltura. La sperimentazione è stata condotta sia presso le strutture della Algesiro S.r.l, allevamento adibito alla produzione di molluschi bivalvi (prevalentemente ostriche e vongole), sia presso il Dipartimento di Medicina Veterinaria (DMV). La ricerca è iniziata con la raccolta in mare di esemplari adulti di P. lividus, evidenziando come, nei soggetti raccolti, l indice gonadico ha avuto un graduale aumento da settembre, e ha raggiunto il massimo in giugno, anche se tale indice non è un indicatore affidabile per rilevare la maturità dei gameti. La valutazione istologica delle fasi gonadiche, effettuata da Marzo 2012 a Dicembre 2013, ha evidenziato come la stagione riproduttiva del riccio di mare cominci a marzo e si estenda fino a settembre, con picchi massimi di maturazione tra aprile e giugno; la maggior parte dei ricci alla fine di agosto ha mostrato le gonadi in fase I e VI. La vitellogenesi è iniziata in coincidenza con il fotoperiodo più breve, terminando nei mesi estivi con fotoperiodo lungo. La temperatura e l indice gonadico sono inversamente proporzionali. Pensiamo perciò che il fotoperiodo, la temperatura e la fioritura di fitoplancton possano agire come regolatori del ciclo gonadico delle popolazioni di P. lividus. Questi dati, anche se strettamente vincolati alle zone in cui è stato effettuato il prelievo e alle condizioni ambientali del periodo preso in esame, possono suggerire che nelle aree dove si è presentata una diminuzione della presenza di individui sarebbe ragionevole estendere il divieto di cattura da aprile a luglio. La pesca invece, mantenendo rigorosamente la dimensione minima, potrebbe essere effettuata da Novembre a Febbraio - Marzo. La metodica di induzione e fecondazione, oramai collaudata da diversi autori (Liu et al., 2007; Carbone, 2012), ha dato i risultati previsti; la stimolazione chimica ha permesso l emissione solo nel 10% dei soggetti prelevati da Ottobre a Gennaio; la percentuale di fertilizzazione è stata pari al 70%, le uova ferti

33 lizzate venivano successivamente a morire nei 3-5 giorni successivi, molto probabilmente per scarso immagazzinamento di risorse nutritive. Abbiamo notato come sia fondamentale mantenere costanti le condizioni di coltura, osservando che, con piccole alterazioni dei parametri chimico-fisici dell acqua le larve dei plutei tendono ad aggregarsi sulla superficie dei coni; il regolare rinnovo dell acqua ogni tre giorni evita o riduce notevolmente la modificazione fisico-chimica delle acque, mantenendo i parametri nei range ottimali, con un risultato soddisfacente della sopravvivenza larvale. Per l intero arco di tempo di campionamento le larve hanno mostrato sempre lo stomaco pieno di alghe, caratterizzate da un colore verdastro. Inoltre, la miscela di micro alghe utilizzata ha fornito un profilo nutrizionale adeguato, rispettando i tempi di crescita. Sarebbe opportuno approfondire con studi specifici l esigenza nutrizionale delle larve e dei giovanili (fase post-metamorfosi), al fine di migliorarne sopravvivenza e sviluppo. Abbiamo valutato le preferenze alimentari dei soggetti adulti di P. lividus allevati in vasche presso gli stabulari del DMV dell Università degli Studi di Bari Aldo Moro, allo scopo di definire protocolli operativi trasferibili nelle pratiche di acquacoltura. Per quanto riguarda le formulazioni alimentari, il protocollo sperimentale ha previsto la preparazione di diete che differivano sia per la fonte proteica (proteine animali vs. vegetali ed addensante animale vs. vegetale) nonché per la tecnica di preparazione (umido vs. secco). I test di preferenza alimentare sui ricci di mare stabulati hanno messo in evidenza che la formulazione con proteine vegetali, fatta aderire al supporto sul fondo da una soluzione di agar al 20% e non essiccata, risultava quella maggiormente preferita. tozoi. Sono state condotte diverse prove di refrigerazione, per ottenere una conservabilità degli spermatozoi a breve e medio termine, che hanno fornito risultati preliminari incoraggianti, infatti il seme è rimasto vivo per circa 8 giorni. È in corso la sperimentazione sul congelamento del seme e degli ovociti per arrivare ad una conservabilità a lungo termine. La policoltura dei ricci nelle lanterne per l allevamento di ostriche ha dimostrato due aspetti importanti: il primo è una riduzione del 50% della formazione di incrostazioni di organismi e conchiglie residue che normalmente si formano all interno delle lanterne; ne consegue un abbattimento del 60% dei tempi di ripulitura della lanterne, ciò suggerisce che il controllo biologico potrebbe essere un metodo efficiente ed ecologicamente corretto di affrontare il problema delle incrostazioni nella coltivazione di ostriche. Il secondo è che nelle lanterne, la crescita delle ostriche è stata agevolata dai ricci di mare che, a loro volta, hanno dimostrato uno sviluppo soddisfacente; potrebbero quindi essere anch essi sfruttati commercialmente. In conclusione, questo progetto ha evidenziato alcune difficoltà nella fase di allevamento e nella alimentazione che devono essere perfezionati. Sarà nostra cura portare avanti le ricerche fino ad ora effettuate e renderle note alla comunità scientifica. La chemiotassi mostrata dai soggetti di Paracentrotus lividus nei riguardi delle differenti preparazioni alimentari testate non lascia dubbi o incertezze, in quanto i ricci di mare hanno mostrato, quasi nella totalità dei soggetti in sperimentazione, preferenze alimentari specifiche. I risultati di questi test preliminari hanno fornito indicazioni significative, utili alla sperimentazione che sarà condotta su larga scala ed in mare aperto. Parallelamente, sono in fase di attuazione indagini sperimentali sulla resistenza del mangime in acqua, utilizzando tecniche di preparazione e/o additivi agglomeranti di differente tipologia. Infine, i risultati preliminari ottenuti dal presente lavoro rappresentano una significativa base per ulteriori ricerche necessarie al fine di definire: possibili fonti alimentari proteiche ed energetiche per l accrescimento dei ricci di mare fabbisogni alimentari per i ricci di mare in termini di proteine, energia ed aminoacidi tecniche mangimistiche alternative ed innovative per la formulazione di diete complete che assicurino la copertura dei fabbisogni alimentari dei soggetti allevati nonché le migliori performance di accrescimento Va sottolineato che, le diete utilizzate in questo esperimento non sono state specificamente sviluppate per migliorare la fecondità e la qualità dei gameti dei riproduttori. Al momento la formulazione del mangime è indirizzata a favorire l accrescimento del P. lividus, con la finalità di brevettare una formula per sopperire alla carenza di mangimi specifici per la specie in commercio. Saranno testati e formulati a breve, mangimi con l aggiunta di xantofille e ß-carotene, per stimolare una maggiore fecondità nel P. lividus come suggerito da George et al., (2001). Lo studio sulla conservabilità del seme di riccio di mare (Paracentrotus lividus) è stato condotto con un ottica quantitativa, per ottenere un numero sufficiente di spermatozoi vivi e vitali con una mobilità utile alla fecondazione, e un ottica qualitativa, prolungando il periodo di sopravvivenza degli sperma

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