ORGAN ON A CHIP. Un promettente sostituto alla sperimentazione animale

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1 ORGAN ON A CHIP Un promettente sostituto alla sperimentazione animale 1

2 1.Fasi di sviluppo di un farmaco La ricerca e lo sviluppo di un farmaco sono indirizzate al processo dell identificazione di molecole dotate di efficacia terapeutica in presenza di un accettabile sicurezza d uso. -percorso molto lungo e costoso 2

3 - Lead Discovery Research : seleziona un limitato numero di composti che interferiscono con il bersaglio selezionato. - Drug Development : Indaga queste molecole con una serie di studi preclinici su animali con lo scopo di valutare qual è il livello di tossicità della molecola sull organismo vivente nel suo complesso, per poi proseguire con la sperimentazione clinica sull uomo. 3

4 STUDI DI FASE 0 Recentemente proposta, che mi determina un primo profilo farmacocinetico. Non forniscono dati sull efficacia, essendo condotti a dosi basse e su soggetti sani. Scopo di selezionare i candidati più promettenti riducendo il rischio di fallimenti. Dubbia predicibilità. STUDI DI FASE I Farmacocinetica, farmacodinamica e tollerabilità del farmaco. Partecipazione volontaria di soggetti sani con consenso informato. 4

5 STUDI DI FASE II Riguardano i primi studi sul paziente. Finalizzati ad individuare l intervallo di dose attive. IIA : -Studi non comparativi -Stimare approssivamente l entità dell effetto Si dividono in II B: -Studi comparativi verso placebo o trattamento attivo -Modalità doppio cieco con assegnazione randomizzata dei pazienti ai gruppi -criteri di ammissione restrittivi -confermare l efficacia terapeutica e tollerabilità del farmaco 5

6 STUDI DI FASE III Gruppi con un numero più alto di pazienti per una più accurata determinazione dell efficacia terapeutica e della tollerabilità. Studi più costosi, i più dispendiosi in tempo e i più difficili da progettare ed eseguire. Sono richiesti almeno due studi di fase III con esito positivo al fine di poter richiedere l approvazione da parte delle autorità di regolamentazione e quindi l immissione in commercio. STUDI DI FASE IV Post-marketing: studi terapeutici e di farmacovigilanza in seguito all immissione in commercio. Permettono di venire a conoscenza della reale efficacia e sicurezza di un farmaco e anche di nuovi impieghi terapeutici. 6

7 Scopo della tesi Si rivolge alla fase di sviluppo preclinico di un farmaco al fine di indagare se sia possibile migliorare questo processo in termini di: - velocità - costi - e nello stesso tempo alleviare le problematiche etiche sollevate dall uso eccessivo degli animali 7

8 Strumenti : colture in vitro di cellule e tessuti non hanno contribuito significativamente alla riduzione dell uso di animali. D altra parte i pazienti hanno un urgente bisogno di nuove terapie Necessità di strumenti migliori e uno di questi, potrebbe essere l organ-on-a-chip. 8

9 2. Sperimentazione animale L uso degli animali nella ricerca biomedica : - Ricerca di base: che si occupa della fisiologia degli organismi, eziologia e patologia delle malattie - Ricerca applicata: sviluppo di farmaci 9

10 Animale come modello MODELLO: rappresentazione semplificata del vero oggetto di studio al quale siamo spesso costretti a ricorrere per l impossibilità di operare direttamente su tale oggetto di studio. -Predittivo Possono essere utilizzati come modelli solo se: non vi sono altre alternative, gli obbiettivi scientifici sono validi, possibilità di contribuire al benessere dell uomo o dell animale. 10

11 Animalisti contro Scienziati Punto di vista degli animalisti: 1) Scarsa predittività 2) Sostituibilità con metodologie alternative 3) Problematicità sotto il profilo etico Punto di vista degli scienziati : 1) Gli esperimenti sugli animali hanno un ruolo fondamentale nella ricerca e nello sviluppo dei moderni trattamenti clinici 2) Non ci sono differenze essenziali tra gli animali utilizzati in laboratorio e l uomo 3) I ricercatori sono a conoscenza delle limitazioni dei modelli animali 11

12 Il principio delle 3 R 1. RIDURRE: diminuzione del numero di animali utilizzati in un determinato protocollo sperimentale. 2. RIMPIAZZARE: valutare se sono disponibili metodi alternativi come test in vitro, o in subordine su organismi inferiori. 3. RIFINIRE: modificare gli esperimenti in modo tale da ridurre la sofferenza e il dolore degli animali. 12

13 La sperimentazione sull'animale rimane ancora oggi insostituibile Tuttavia il nostro impegno a ridurre il numero e la sofferenza degli animali deve mantenersi sempre al massimo. 13

14 3.Organ on a chip Complessi sistemi in vitro che integrano la tecnologia microfluidica e cellule umane per studiare la fisiologia e la pato-fisiologia umana, nonché la risposta ai farmaci. chip : principi di progettazione e alle tecniche di microfabbricazione usate, organ : simulazione di una struttura di microambiente ispirata alle funzioni dell organo in vivo con l utilizzo di colture cellulari. 14

15 Colture cellulari 3D Cellule coltivate in 2D non riescono a ricostituire il reale microambiente cellulare esistente in vivo sviluppo di modelli di coltura cellulare 3D in cui le cellule vengono coltivate in un gel di ECM ( importante per la sua flessibilità). Le nuove tecniche di microfabbricazione portano al raggiungimento del microambiente in vivo. Es. Microfluidica : scienza della manipolazione di piccole quantità di fluidi in canali vuoti microfabbricati, usata per : generare e regolare con precisione i flussi di fluido dinamico e i gradienti spazio-temporali, erogare gli elementi nutrienti e altri segnali chimici alle cellule in maniera controllata. 15

16 PDMS o poly(dimetilsilossano) : Polimero siliconico caratterizzato da proprietà uniche che ne fanno la scelta perfetta per la fabbricazione di microsistemi per la coltura di cellule e tessuti. VANTAGGI: - Elevata permeabilità ai gas - Trasparenza ottica - Elevata flessibilità SVANTAGGI: - Scarsa resistenza chimica a certi solventi - Propensità ad assorbire piccole molecole idrofobiche Grazie a tutto questo è stato possibile la formazione di modelli in vitro che ricostituiscono le più complesse strutture 3D a livello di organo e di integrare fondamentali segnali meccanici dinamici e anche chimici per meglio imitare la fisiologia e pato-fisiologia in vivo. 16

17 Sviluppo dell organ on a chip: 1) da coltura di biopsie ex vivo Più fedele rappresentazione in vitro di una risposta fisiologica in vivo Test funzionali a breve termine 2) da colture primarie Sorgente più comune Periodo medio di vita cellulare dopo isolamento: 2 settimane Mancanza di strutture e gerarchie tissutali proprie dell organo 17

18 3) Da cellule staminali pluripotenti Stadio iniziale Il controllo del fenotipo cellulare non è compito facile Migliore comprensione dei microambienti atti a promuovere i fenotipi differenziati 18

19 FEGATO on a chip Sistema che integra l epitelio del fegato con reti vascolari microfabbricate. Due camere di coltura cellulare PDMS sono state giustapposte e separate da una membrana di ECM. All interno dei canali microfluidici sono state costruite strutture che somigliano all endotelio che separa gli epatociti dal sinusoide, con l obbiettivo di avvicinarsi di più alle proprietà di trasporto della microcircolazione epatica. Questo a consentito agli epatociti umani primari di mantenere l attività metabolica specifica per una settimana.

20 SNC on a chip Sistema microfluidico compartimentalizzato che permette la cocoltura di neuroni e oligodendrociti finalizzato a studiare la comunicazione tra neuroni e cellule gliali durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale. 20

21 Sviluppo di modelli di malattie su chip Si è potuto studiare l'adesione intravascolare (capacità invasiva) delle cellule da parte di cellule tumorali metastatiche della mammella in circolazione in risposta all'attivazione endoteliale in condizioni di flusso fisiologiche. Usando questo modello, è stato dimostrato che la stimolazione basale dell'endotelio con la citochina, CXCL12, aumenta significativamente l'adesione delle cellule del tumore al seno in circolazione. 21

22 LUNG ON A CHIP Microsistema biomimetico che ricostituisce l interfaccia critica alveolo-capillare, che rappresenta di fatto l unità morfo-funzionale del polmone vivente. Sistema microfuidico contenenti due canali giustapposti tra loro di PDMS separati da ECM. Nell ECM sono state coltivate ai suoi lati opposti cellule epiteliali alveolari umani e cellule endoteliali polmonari umane. Dopo confluenza tra cellule, viene introdotta dell aria nel compartimento epiteliale per ricreare un interfaccia aria-liquido simile al rivestimento dello 22

23 Questo modello imita 1) L INSPIRAZIONE con riduzione della pressione intrapleurica ed espansione degli alveoli : portando aria nei polmoni, con conseguente espansione dell epitelio alveolare e dell endotelio. Quando si fa il vuoto nelle due camere laterali, si produce deformazione elastica della parete che divide i micro canali, che contengono le cellule, dalle camere laterali; ciò genera l espansione della membrana di PDMS e degli strati di tessuto aderenti. Quando il vuoto viene rilasciato, il rimbalzo elastico del PDMS riporta la membrana e le cellule aderenti allo loro dimensione originaria. 23

24 2) RISPOSTA INFIAMMATORIA, incorporando nel fluido che scorre cellule immunitarie. Introduzione del TNF nel microcanale alveolare in presenza di stress meccanico fisiologico ed esaminare l attivazione dell endotelio micro vascolare misurando l espressione di ICAM1. TNF ha aumentato l espressione endoteliale di ICAM 1, a differenza dello stress fisiologico (applicato attraverso il vuoto). Adesione dei neutrofili. Appiattimento dei neutrofili, diapedesi e trasmigrazione attraverso la barriera alveolocapillare. 24

25 3) RISPOSTA CELLULARE INNATA ALL INFEZIONE POLMONARE BATTERICA: Aggiunta al micro canale alveolare batteri viventi con GFP. - Attivazione dell endotelio sottostante, come indicato dalla trasmigrazione dei neutrofili nel micro canale alveolare. - Movimento direzionale dei neutrofili verso i batteri, che hanno poi circondato e fagocitato. 4) TOSSICITA POLMONARE indotta da dosi elevate di IL-2 somministrate nei protocolli di chemioterapia antimetastatica. - Extravasazione ed accumulo di fluido a livello dello spazio alveolare. - Attivazione della coagulazione con deposito intralveolare di fibrina. Questo modello consente di testare l effetto di farmaci potenzialmente capaci di modulare l extravasazione ( es. GlaxoSmithKline ). 25

26 Modello di patologia asmatica su chip I sintomi clinici tipi dell asma allergica provengono da un aumento esagerato del tono dei muscoli lisci in risposta al sistema immunitario da parte di allergeni. I Glucocorticoidi e i beta agonisti sono le attuali terapie resistenti. molti pazienti Modello di muscolatura della via aerea umana su chip: attraverso BMS ed introduzione nel sistema di IL

27 HUMAN ON A CHIP Modello integrato, ancora sotto analisi, fatto di compartimenti interconnessi, con ciascuno di essi che contiene un tipo di cellula che rappresenta un organo diverso, collegati attraverso un sistema circolatorio microfluidico. Collegamento tra gli studi pre-clini e clinici. 27

28 Varie PIATTAFORME PRELIMINARI microfluidiche hanno dato prova dell'importanza del human-on-chip per gli studi funzionali, per indagare gli effetti dei farmaci, e per testarne la tossicità. o Wagner e collaboratori biopsie umane cutanee ed epatociti primari umani in un dispositivo microfluidico. o Van Midwoud e collaboratori fegato e d intestino in un dispositivo microfluidico. o Interazione tra i due tessuti sotto la stimolazione di acido"desossicolico biliare. Zhang e collaboratori hanno voluto definire un mezzo di coltura"adatto per le cellule provenienti da diversi tessuti. 28

29 In uno di questi studi, è stato ad esempio microingegnerizzato un bioreattore con colture di cellule 2D di fegato e di polmone in diverse microcamere interconnesse da canali microfluidici al fine di sviluppare modelli farmacocinetici fisiologicamente rilevanti. - metaboliti di naftalene prodotti nello compartimento del fegato portavano a riduzione di glutatione nello compartimento cellulare epiteliale del polmone. Questo sistema microfluidico è stato modificato in seguito per incorporare colture 2D e 3D anche di adipociti, cellule tumorali, e cellule staminali del midollo spinale, per studiare l'accumulo, la distribuzione, il metabolismo e la tossicità dei farmaci. 29

30 Requisiti fondamentali: Validazione nel predire le risposte umane Identificazione della fonte cellulare umana che meglio imita le risposte in vivo Componente strutturale non biologica del chip 30

31 Gli organ-on-a-chip hanno molte applicazioni: 1) Accelerare il processo di sviluppo dei farmaci e per sviluppare farmaci che siano sempre più sicuri e più efficaci a costi inferiori. 2)Sviluppo di modelli di malattia di utilità per la nostra specie che possono meglio predire l'efficacia e la tossicità dei farmaci nei pazienti e fornire maggiore comprensione dei loro meccanismo d azione. 3) Potrebbero contribuire a proteggere la salute pubblica identificando tossine ambientali e fornendo una migliore comprensione dei loro meccanismo d azione. 31

32 4) Multi-organ : potrebbero fornire metodi più perfezionati per esplorare diversi percorsi di somministrazione dei farmaci, oltre che ai loro effetti sull'efficacia o tossicità delle diverse formulazioni dei farmaci (prolungamento intervallo QT di alcuni farmaci). 5) In futuro, potremmo utilizzare questi chip con cellule ottenute da diverse popolazioni genetiche che "rispondono" o "non rispondono" o da persone che esprimono o non esprimono particolari trasportatori molecolari o enzimi metabolici così che si possano sviluppare farmaci per specifiche sottopopolazioni umane. 6) Infine, in un futuro si potrebbero un giorno eseguire trial clinici umani virtuali usando questi modelli microingegnerizzati. 32

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