ahbs ISTRUZIONI PER L USO VITROS Immunodiagnostic Products Confezione dei reagenti Anti-HBs

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1 ISTRUZIONI PER L USO VITROS Immunodiagnostic Products Confezione dei reagenti Anti-HBs ahbs Impiego Per la misura quantitativa in vitro dell anticorpo anti-hbs (antigene di superficie dell epatite B) nel siero e nel plasmo umano (eparina o citrato) a seguito di infezione o vaccinazione contro il virus dell epatite B (HBV). Compendio e spiegazione del dosaggio Per il monitoraggio della risposta immunitaria alla vaccinazione contro l epatite B si possono utilizzare dosaggi anti-hbs. La misura dell anti-hbs per la valutazione quantitativa della risposta immunitaria a seguito di vaccinazione è in grado d identificare responder inadeguati e non-responder e di monitorare le modifiche del livello di anticorpo. Viene comunemente riconosciuto che un titolo anti-hbs di 10 miu/ml è probabilmente protettivo 1. I dosaggi anti-hbs sono altresì utilizzabili per monitorare la convalescenza ed il recupero da infezione HBV acuta. La rivelazione dell anti-hbs indica che l infezione ha fatto il suo corso e che il paziente è diventato immune, dal momento che questo anticorpo neutralizza il virus 2. Principi della procedura Il dosaggio anti-hbs VITROS viene effettuato utilizzando la confezione di reagenti anti-hbs VITROS e calibratori anti-hbs (prodotti immunodiagnostici VITROS) sul sistema immunodiagnostico VITROS. Viene utilizzata una tecnica immunometrica che implica una reazione anti-hbs nel campione con antigene di superficie dell epatite B (HBsAg) adeso ai pozzetti. Un coniugato HBsAg marcato con HRP si complessa con l anti-hbs legato dando origine ad un sandwich antigenico. I materiali non legati vengono rimossi mediante lavaggio. Il coniugato con perossidasi da rafano legato viene misurato mediante reazione luminescente 3. Un reagente contenente substrati luminogenici (derivato del luminolo e sale peracido) ed un agente di trasferimento di elettroni, viene aggiunto ai pozzetti. La perossidasi da rafano nel coniugato legato catalizza l ossidazione del derivato del luminolo, dando origine a produzione di luce. L agente di trasferimento di elettroni (acetanilide sostituita) provoca un aumento del livello di luce prodotta prolungandone l emissione. I segnali luminosi vengono letti dal Sistema VITROS. Il quantitativo di coniugato legato con perossidasi da rafano è direttamente proporzionale alla concentrazione di anti-hbs presente. Avvertenze e precauzioni Solo per uso diagnostico in vitro AVVERTENZA: Materiale Potenzialmente Infettivo Il reagente coniugato e i pozzetti rivestiti presenti nella confezione contengono antigene di superficie dell epatite B purificato (HBsAg) ricavato da donatori sottoposti a test individuali e risultati negativi per quanto riguarda gli anticorpi al virus dell immunodeficienza umana (HIV 1+2) e al virus dell epatite C (HCV), utilizzando metodi approvati (immunodosaggio enzimatico, EIA). L HBsAg purificato è stato inattivato termicamente (10 ore a 60 C). Trattare come materiale in grado di trasmettere infezione. Gli emoderivati contenuti nella confezione provengono da donatori umani i quali sono stati sottoposti a test individuali usando metodi approvati e risultati negativi per quanto concerne la presenza dell HBsAG, di anticorpi del HIV 1+2 e del HCV (utilizzare EIA). Si raccomanda di usare la dovuta cautela nel maneggiare i campioni di origine umana. Tutti i campioni sono da considerare come potenziale fonte di infezione. Nessun metodo sperimentale può garantire con assoluta certezza l assenza del virus dell epatite di tipo B, HCV, dell HIV 1+2 o di altri agenti infettivi. Campioni e componenti del dosaggio devono essere manipolati, conservati ed eliminati in forma solida o liquida in conformità alle procedure dettate dalle relative direttive e normative nazionali in materia di sicurezza biologica (per es. Direttiva M29 del NCCLS 4 ). Versione 1.0 Pubb. n. GEM1205_IT 1

2 ahbs ISTRUZIONI PER L USO Materiali forniti AVVERTENZA: Contiene Kathon Il reagenti contenente Kathon. R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. R52/53: Nocivo per gli organismi acquatici, può provocare a lungo termine effetti negativi per l'ambiente acquatico. S24: Evitare il contatto con la pelle. S37: Usare guanti adatti. Materiali forniti 1 confezione dei reagenti contenente: 100 pozzetti rivestiti (sottotipi ad e ay di HBsAg inattivati termicamente, rivestiti a 40 unità P.E.I.*/pozzetto). 13,3 ml di reagente coniugato (sottotipi ad e ay di HRP-HBsAg (inattivati termicamente), 0,33 µg/ml) in soluzione tampone con siero umano e agente antimicrobico. 6,2 ml di reagente di dosaggio con agente antimicrobico. NB: Contiene sieroalbumina bovina. * Materiale di riferimento per HBsAg del Paul-Ehrlich-Institute. Materiali richiesti, ma non forniti nel kit Sistema VITROS per immunodiagnostica oltre ai seguenti prodotti immunodiagnostici VITROS: Calibratori per Anti-HBs (comprese scheda di calibrazione lotti e scheda dei protocolli), reagente di segnale, reagente di lavaggio universale, diluente per campioni ad elevata concentrazione B, contenitore per la conservazione delle confezioni di reagenti (opzionale) con essiccante. Preparazione e conservazione dei reagenti La confezione dei reagenti viene fornita pronta per l uso. Conservare i reagenti in condizioni integre a 2-8 C, non congelare. Una volta aperta, utilizzare la confezione dei reagenti entro 8 settimane dal primo caricamento sul sistema. Non usare oltre la data di scadenza. Conservare le confezioni di reagenti aperte direttamente sul sistema o a 2-8 C in apposito contenitore ermetico per la conservazione delle confezioni di reagenti sigillati con essiccante a secco. I calibratori per Anti-HBs VITROS vengono forniti pronti per l uso. Conservare i calibratori in condizioni integre a 2-8 C. Non usare oltre la data di scadenza. Dopo l apertura conservare per un massimo di 13 settimane a 2-8 C o di 13 settimane a -20 C (è ammesso un solo ciclo di congelamento-scongelamento). Preparazione del paziente Non è necessaria alcuna preparazione specifica del paziente. Raccolta, preparazione e conservazione dei campioni Si possono usare campioni di siero o plasma (eparina o citrato). I risultati ottenuti con campioni di plasma citrato saranno proporzionalmente inferiori a motivo della diluizione con liquido anticoagulante. Per la raccolta dei campioni ematici attenersi a procedure standard. I campioni devono essere accuratamente separati dal materiale cellulare, che potrebbe condurre a risultati falsamente elevati. I campioni di siero o plasma possono essere conservati fino ad un massimo di 5 giorni a 2-8 C o di 4 settimane a -20 C. Evitare congelamenti e scongelamenti ripetuti. Si è riscontrato che alcuni dispositivi di prelievo del campione biologico hanno determinato alterazioni all integrità di determinati analiti provocando interferenze nella determinazione analitica 5. Considerata la varietà di dispositivi per la raccolta dei campioni disponibili in commercio, la Ortho-Clinical Diagnostics non è in grado di definire con assoluta certezza le prestazioni dei propri prodotti con tutti i diversi dispositivi. Si raccomanda pertanto che i singoli utilizzatori verifichino che il sistema di prelievo da loro adottato venga usato nel rispetto delle istruzioni della Casa produttrice e sia compatibile con il sistema VITROS. Note sul controllo di qualità e sulla procedura Maneggiare la confezione dei reagenti con cura evitando la formazione di condensa sulla scatola, evitando la formazione di schiuma nei reagenti ed infine cercando di non agitare la scatola stessa. La calibrazione è specifica per i singoli lotti. Le confezioni di reagenti e i calibratori corrispondenti sono identificabili dal numero di lotto. Le confezioni di reagenti dello stesso lotto possono utilizzare la medesima calibrazione, che dev essere effettuata con calibratori aventi lo stesso numero di lotto. Mescolare perfettamente i campioni, i calibratori e i controlli per inversione e portarli a C prima dell uso. 2 Pubb. n. GEM1205_IT Versione 1.0

3 ISTRUZIONI PER L USO Procedura ahbs Manipolare i campioni, i calibratori e i controlli in contenitori chiusi al fine di evitare contaminazione ed evaporazione. Per evitare l evaporazione, limitare il numero di campioni, calibratori e controlli presenti sul sistema VITROS. Per maggiori informazioni vedere la Guida dell operatore del sistema VITROS. Dopo l uso, devono essere tempestivamente riportati a 2-8 C. In alternativa è possible utilizzarne un aliquota sufficiente ad una singola determinazione. I calibratori possono essere aliquotati in altri contenitori resi identificabili mediante le etichette con codice a barre fornite nel kit. Verificare periodicamente il materiale a disposizione assicurando la corretta gestione dei reagenti e la disponibilità di lotti di reagenti di Segnale, Reagenti di Lavaggio Universale e Reagenti calibrati sufficienti a condurre le analisi programmate. Dovendo eseguire una serie di dosaggi su un singolo campione, è opportuno accertarsi che il volume di campione sia sufficiente ad effettuare i dosaggi richiesti. La buona prassi di laboratorio prevede l esecuzione di controlli ai fini della verifica delle prestazioni del dosaggio eseguito. I controlli Anti-HBs VITROS contengono 3 idonei livelli di Anti-HBs (bassi, medi, elevati). Si raccomanda di eseguire i controlli contestualmente ad una calibrazione e, successivamente, almeno una volta ogni 24 ore e dopo l esecuzione delle procedure di controllo previste (Cfr. la Guida dell operatore del sistema VITROS). Se le procedure di controllo di qualità interne richiedono un uso più frequente dei controlli, è opportuno attenersi alle procedure previste. Per maggiori informazioni vedere la Guida dell operatore del sistema VITROS. Il nome predefinito del dosaggio che appare sul referto del paziente è anti-hbs. L abbreviazione predefinita che appare sui menu di selezione dei dosaggi e sui referti di laboratorio è ahbs. Se necessario è possibile riconfigurare. I risultati possono essere espressi come IU/L o miu/ml. Tali opzioni sono configurabili dalla videata di configurazione degli analiti nelle Opzioni e Configurazioni. I campioni di siero o plasma (eparina o citrato) con valori superiori all intervallo di calibrazione possono essere diluiti fino a 1/20 con diluente per campioni ad elevata concentrazione B precedentemente al dosaggio. Fare riferimento al foglietto illustrativo del diluente per campioni ad elevata concentrazione B. Procedura Il dosaggio per Anti-HBs VITROS richiede 80 µl di campione, calibratore o controllo per una determinazione singola, indipendentemente dal volume minimo di riempimento del contenitore per campioni utilizzato. Il dosaggio per Anti-HBs VITROS dev essere calibrato ogni volta si usi un nuovo lotto di reagenti e, successivamente, ad intervalli di 28 giorni. Il dosaggio per anti-hbs VITROS dev essere calibrato anche dopo l esecuzione di alcune procedure di controllo oppure se i risultati del controllo qualità differiscono molto dal range accettabile. Per informazioni più dettagliate sul funzionamento del sistema si veda la Guida dell Operatore del Sistema immunodiagnostico VITROS, capitoli 4-7. In breve: 1. Effettuare la scansione della scheda dei protocolli per caricare un nuovo protocollo di analisi sul sistema a questo punto viene visualizzato il pulsante relativo alle diverse determinazioni sulla videata di programmazione dei campioni. Effettuare la scansione della scheda di calibrazione dei lotti per ogni nuovo lotto di reagenti per immettere i dati di scadenza e di calibrazione specifici per quel lotto. 2. Aprire la busta e prelevare la confezione dei reagenti. Caricare la confezione sull unità di autocaricamento o utilizzare il pulsante di scarico/carico nella videata di gestione dei reagenti (visualizzazione per reagente). NOTA: Non utilizzare prodotti danneggiati o non sigillati perfettamente. 3. Caricare i campioni nei settori portacampioni universali usando, se necessario, appositi adattatori (volendo, si possono identificare i campioni con codici a barre). Collocare un puntale monouso accanto ai singoli campioni e caricare i settori sul sistema. Definire i programmi dei campioni tramite la videata di programmazione dei campioni. Avviare la funzione di campionamento. Tutte le fasi di campionamento vengono effettuate automaticamente. 4. Processare i calibratori analogamente ai campioni. Non è necessario programmare la calibrazione se si usano etichette con codici a barre. Caricare i calibratori nell ordine voluto: la calibrazione parte automaticamente. Risultati Per costruire la curva di calibrazione principale codificata sulla scheda di calibrazione dei lotti si usa una funzione di aggiustamento di curva logistica a quattro parametri modificata. Il processo di calibrazione riposiziona la curva di calibrazione principale definendo una curva valida che viene memorizzata per il sistema. Per maggiori informazioni leggere le istruzioni per l uso dei calibratori. I risultati vengono calcolati automaticamente dal Sistema VITROS. Controllo di qualità I risultati di calibrazione vengono confrontati con un range di parametri di che appaiono in dettaglio nella videata dei parametri di calibrazione alla quale si accede dalle Opzioni e Configurazioni (videata di revisione/calibrazioni utente). Se non vengono rispettati tutti i range dei parametri di qualità definiti, sul rapporto di calibrazione appare un codice d identificazione. Per le operazioni da eseguire successivamente ad una calibrazione non andata a buon fine si veda il capitolo 8 della Guida dell Operatore (Revisione dei risultati). I campioni dei pazienti vengono contrassegnati come Anticorpo Neg, Borderline o Anticorpo Pos. I valori dei controlli vengono identificati se 2 DS rispetto alla media della linea di base definita. Non esistono parametri individuali in grado di descrivere completamente la qualità dell aggiustamento della curva. Il rapporto di calibrazione dev essere utilizzato in abbinamento a valori di controllo ai fini della determinazione della validità della calibrazione. Versione 1.0 Pubb. n. GEM1205_IT 3

4 ahbs ISTRUZIONI PER L USO Limiti della procedura Se i risultati di controllo differiscono di molto dal range accettabile, indagarne la causa prima di decidere se annotare i risultati del paziente. Limiti della procedura I risultati ottenuti con questo o altri kit diagnostici devono essere utilizzati ed interpretati esclusivamente nel contesto del quadro clinico generale. Reazioni aspecifiche possono essere ottenuti con immunodosaggi ad elevata sensibilità. La fonte più comune di reazioni aspecifiche è la scarsa qualità dei campioni. I campioni contenenti trioleina (<33,9 mmol/l) o bilirubina (<0,342 mmol/l) non danno luogo ad interferenze a livello d interpretazione clinica dei risultati. Non utilizzare campioni emolizzati o torbidi. Interpretazione dei risultati I campioni con risultati <8 miu/ml vengono identificati come Anticorpo Neg, quelli con risultati tra 8 e 12 miu/ml come Borderline, mentre i campioni con risultati >12 miu/ml vengono identificati come Anticorpo Pos. I risultati Anticorpo Pos indicano immunità alle infezioni da HBV. I risultati Borderline indicano un livello di anticorpo entro il 20% del valore di cut-off raccomandato dall Organizzazione mondiale della sanità (W.H.O.) per un immunità di 10 miu/ml. Un campione che fornisce ripetutamente risultati borderline potrebbe contenere anticorpo insufficiente a conferire immunità 1. In questo saggio, i livelli di anticorpo inferiore alla zona borderline sono identificati come Anticorpo Neg. Bassi livelli di anticorpo possono indicare pregressa infezione da HBV. Lo stato del paziente con basso livello di anticorpo dev essere confermato utilizzando analisi per altri marcatori d infezione da epatite. Valori attesi In una popolazione casuale di 615 campioni di donatori di sangue, 40 (6,5%) sono risultati reattivi all anti-hbs ( 10 miu/ml) al dosaggio anti-hbs VITROS. In una popolazione di campioni non reattivi all anti-hbs, il 100% (575/575) è risultato non-reattivo al dosaggio Anti-HBs VITROS. In una popolazione di campioni reattivi all anti-hbs, il 99,7% (290/291) è risultato reattivo al dosaggio Anti-HBs VITROS. Prestazioni metodologiche Calibrazione e modalità per ricostruirla L intervallo di calibrazione del dosaggio Anti-HBs VITROS è miu/ml (ricavabile da calibratori di riferimento interni che sono stati avvalorati per essere messi in correlazione con il 1 o Preparato di Riferimento Internazionale dell OMS (1977)). Il dosaggio AntiHBs VITROS è stato altresì valutato per quanto riguarda la diluizione del materiale di riferimento Anti-HBs IgG del Paul-Ehrlich-Institute (P.E.I.) (1 000 mu/ml). Il dosaggio Anti-HBs VITROS ha fornito risultati equivalenti per i materiali dell Organizzazione Mondiale della Sanità e del P.E.I.. 4 Pubb. n. GEM1205_IT Versione 1.0

5 ISTRUZIONI PER L USO Bibliografia ahbs Precisione La precisione è stata valutata secondo il protocollo EP5-T2 6 del National Committee for Clinical Laboratory Standards. Due replicati di ciascuno dei 3 sieri di controllo liofilizzati sono stati dosati in una sola occasione ogni giorno per 20 giorni. L esperimento è stato eseguito usando 2 lotti di reagenti differenti su Sistemi differenti. I dati presentati sono rappresentativi delle prestazioni del prodotto. Tabella 1: Precisione Concentrazione Intra-dosaggio Intracalibrazion Intralaboratorio tipica miu/ml DS* CV(%)* DS* CV(%)* DS* CV(%)* 22,2 0,237 1,1 0,765 3,4 0,877 4,1 86,0 0,779 0,9 2,51 2,9 2,98 3, ,65 1,0 10,6 2,8 13,2 3,6 * Quadratica media Intra-dosaggio: Precisione fra un duplicato e l altro, con media ottenuta su tutte i replicati. Intracalibrazione: Precisione totale, con componenti ponderati di variazione intra-dosaggio, fra un replicato e un altro e da un giorno all altro. Intralaboratorio: Misura dell effetto della ricalibrazione sulla precisione totale, calcolata nell ambito di un singolo lotto di reagenti, utilizzando dati di 4 calibrazioni. Sensibilità Una popolazione di 291 campioni, già risultati reattivi all anti-hbs ( 10 miu/ml) utilizzando un altro prodotto del commercio destinato al medesimo uso, è stata analizzata con dosaggio Anti-HBs VITROS. Le discordanze fra i risultati sono stati risolte utilizzando un terzo dosaggio anti-hbs. Metodo di confronto 291 campioni analizzati Positivo ( 10 miu/ml) Negativo (<10 miu/ml) Anticorpo Pos (>12 miu/ml) Dosaggio anti-hbs Borderline (8-12 miu/ml) 1 0 VITROS Anticorpo Neg (<8 miu/ml) 0 0 Sensibilità = 99,7% (290/291) rispetto al metodo di confronto (basato su un cut-off di 10 miu/ml). Specificità Una popolazione di 575 donatori di sangue in apparente buona salute, già risultati non-reattivi all anti-hbs (<10 miu/ml) con altro saggio del commercio destinato al medesimo uso, è stata analizzata con saggio Anti-HBs VITROS. Le discordanze fra i risultati sono stati risolte effettuando un terzo dosaggio anti-hbs. Metodo di confronto 575 campioni analizzati Positivo ( 10 miu/ml) Negativo (<10 miu/ml) Anticorpo Pos (>12 miu/ml) 0 0 Dosaggio anti-hbs Borderline (8-12 miu/ml) 0 0 VITROS Anticorpo Neg (<8 miu/ml) Specificità = 100% (575/575) rispetto al metodo di confronto (basato su un cut-off di 10 miu/ml) In questa popolazione di 575 anti-hbs negativi, il 98% dei campioni indicava risultati <1 miu/ml nel dosaggio Anti-HBs VITROS. Inoltre, sono stati sottoposti a dosaggio Anti-HBs VITROS 65 campioni provenienti dai seguenti sottogruppi potenzialmente cross-reagenti: anti-hav IgM positivo, anti-hbc IgM positivo, CMV IgM positivo, EBV IgM positivo e anti-hcv positivo, malattia epatica non virale, fattore reumatoide positivo e malattia da autoimmunità. Di questi campioni, nessuno è risultato ripetutamente reattivo nel dosaggio Anti-HBs VITROS. Bibliografia 1. Ambrosch F. et al. Lancet April 16: (1988). 2. Roggendorf M. In Simon C & Wilkinson P (Eds). Diagnosis of Infectious Disease - New Aspects. Schattauer : (1986). 3. Summers M et al. Clin Chem 41. S73 (1995). 4. NCCLS. Protection of laboratory Workers from Instrument biohazards and Infectious Diseases Transmitted by Blood, Body Fluids and tissue; Approved quideline. NCCLS Document M29-A (ISBN ). NCCLS, Wayne, PA 19087; Calam RR. J Clin Immunoassay 11: (1988). 6. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Order Code EP5-T2. (1992). Versione 1.0 Pubb. n. GEM1205_IT 5

6 ahbs ISTRUZIONI PER L USO Glossario dei simboli Glossario dei simboli 6 Pubb. n. GEM1205_IT Versione 1.0

7 ISTRUZIONI PER L USO Revisioni ahbs Revisioni Data revisione Versione Modifiche tecniche apportate* Nuovo formato, tecnicamente equivalente a PIGEM1205/101.0 con le seguenti variazioni minori: Sezione Simboli usati sostituita dalla tabella Glossario dei simboli Aggiunta la casella per la firma della sezione Revisioni * Le barre delle modifiche indicano la posizione del testo aggiornato rispetto alla versione precedente del documento. Quando le presenti Istruzioni per l uso saranno sostituite da quelle aggiornate, apporre la propria firma e la data e conservare in base alle direttive locali o ai regolamenti del laboratorio. Firma Data Versione 1.0 Pubb. n. GEM1205_IT 7

8 ahbs ISTRUZIONI PER L USO Condizioni di fornitura: tutte le forniture sono soggette ai termini e alle condizioni di vendita della ditta Ortho-Clinical Diagnostics e dei suoi distributori. Copie di tali condizioni saranno disponibili su richiesta. CHIRON Corporation Emeryville, CA Ortho-Clinical Diagnostics Johnson & Johnson Holmers Farm Way High Wycombe Buckinghamshire HP12 4DP United Kingdom VITROS è un marchio di Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Pubb. n. GEM1205_IT Versione 1.0