Oncogenesi Virale. Infezioni con virus oncogeni sono responsabili di circa il 15% delle morti per cancro

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1 Oncogenesi Virale nel 1908 è stato dimostrato che un estratto filtrabile trasmetteva la leucemia dei polli Nel1911 Peyton Rous dimostrò la stessa cosa con un tumore solido (sarcoma) Da allora l'oncogenesi virale è stata oggetto di intensi studi, che hanno portato a importanti scoperte, che impattano tutta l'oncogenesi: scoperta di oncogeni cellulari, geni oncosoppressori, trasduzione del segnale, controllo del ciclo cellulare, carcinogenesi, ecc. Infezioni con virus oncogeni sono responsabili di circa il 15% delle morti per cancro Sviluppo di vaccini per prevenire l'infezione e, di conseguenza, il tumore

2 ONCOGENESI VIRALE La trasformazione neoplastica consiste nell induzione a livello genetico di alterazioni morfologiche, biochimiche e biologiche, stabilmente trasmissibili alla progenie cellulare, e ha almeno due aspetti: (1) la capacità di crescita illimitata in coltura (immortalizzazione); (2) la possibilità di causare la formazione di un tumore se inoculata in un ospite appropriato. Il tumore è il risultato finale di vari effetti cumulativi che modificano il controllo della proliferazione cellulare. I vari stadi di questo processo hanno differenti bersagli cellulari e possono essere causati da agenti chimici, fisici o virali. La prima esposizione a un virus oncògeno o a un cancerogeno chimico (iniziatore) induce modifiche ereditarie in alcune. L esposizione a un secondo agente (promotore) determina la formazione del tumore. Virus oncògeni, agenti chimici e fisici possono essere sia iniziatori che promotori. Alcuni agenti sono definiti carcinogeni completi, perché capaci sia di iniziamento che di promozione. Il termine progressione indica l insieme dei gradini che causano il progressivo aumento di malignità delle cellule trasformate.

3 Oncogenesi virale La proliferazione cellulare normale è sotto il controllo di: geni regolatori positivi oncogèni- se ne conoscono più di 100 negativi geni oncosoppressori se ne conosce qualche decina Alterazioni di questi geni possono determinare la trasformazione neoplastica. Gli oncogèni sono geni normali e necessari per vari processi cellulari. Le proteine codificate dagli oncogèni (oncoproteine) possono essere fattori di crescita, recettori di membrana per fattori di crescita, tirosinproteinchinasi, proteine leganti il GTP, proteine nucleari. Le proteine codificate dai geni oncosoppressori, come Rb e p53, controllano negativamente la crescita. Gli oncosoppressori codificano proteine che arrestano la crescita cellulare: es. p53 arresta la cellula in G1.

4 Oncogenesi virale Gli oncogeni sono stati scoperti originariamente nel genoma di retrovirus (vonc). In seguito si è scoperto che tutte le cellule normali hanno omologhi ai v-onc (c-onc o proto-oncogèni). I v-onc sono derivati dai c-onc, probabilmente acquisiti durante la trascrizione dell RNA dal provirus integrato. Gli oncogèni possono dare trasformazione neoplastica in seguito ad amplificazione genica, riarrangiamenti, mutazioni. Vari criteri per valutare la trasformazione: Morfologica (forma diversa) Biochimica (acquisizione nuove caratteristiche) Neoplastica (capacità di indurre tumori dopo inoculazione in vivo) Una cellula trasformata neoplasticamente è: - immortalizzata = capace di crescere illimitatamente in coltura - può formare tumore se inoculata nell ospite adeguato. L immortalizzazione è necessaria, ma non sufficiente, per trasformazione neoplastica.

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6 Esempio di trasformazione morfologica Trasformazione della stessa linea di fibroblasti di ratto ad opera di diversi oncogeni virali. a) cellule normali. Cellule trasformate da: b) Virus del Sarcoma di Rous; c) Virus del Sarcoma Murino di Harvey; d) Virus della Leucemia di Abelson; e) poliomavirus; f) poliomavirus - in soft agar; g) SV40; h) Adenovirus

7 Trasformazione cellulare Caratteristiche delle cellule trasformate in vitro da virus: 1) caratteristica fondamentale: Maggiore potenziale di crescita in vitro a. Perdita dell inibizione da contatto formazione di colonie tridimensionali; b. vita illimitata, possono essere mantenute in coltura indefinitamente; c. capacità di crescere in sospensione o in terreno semisolido (agar); d. diminuita necessità di siero come fattore di crescita; e. aumento della densità cellulare per unità di superficie. 2) Presenza del DNA virale, integrato o episomiale. 3) Alterazioni di morfologia e metabolismo 4) Alterazioni cromosomiche (traslocazioni, rotture cromosomiche, aneuploidia, ecc). 5) Comparsa di antigeni tumorali virus specifici 6) Oncogenicità in animali (immunodepressi). Il trapianto di cellule è accettato in animali consanguinei, senza produrre tumori; invece il trapianto di cellule trasformate è rigettato da animali immunocompetenti, anche se consanguinei. Le cellule trasformate crescono in vivo producendo neoplasia se inoculate in animali anche autologhi purchè immunosoppressi.

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9 Oncogenesi virale Diversi virus sono in grado di trasformare cellule in vitro, ma non tutti sono associati a neoplasie umane.

10 Oncogenesi virale Fattori che ostacolano lo studio dell eziologia virale di un tumore - A volte le cellule trasformate non presentano tracce del virus trasformante ( Hit and run ). - Il tumore insorge parecchi anni dopo l esposizione al virus. - Il tumore insorge solo in una minoranza della popolazione infettata. - Non tutti i virus oncogeni hanno proprietà trasformanti in vitro. - Impossibilità di inoculare il virus nella popolazione. Criteri che suggeriscono una potenziale associazione fra virus e neoplasie nell uomo. - Indicazioni epidemiologiche: coincidenza geografica o di altro tipo tra la diffusione del tumore e quella del virus. - Presenza costante del virus o di sue macromolecole (DNA, RNA, antigeni) nelle cellule tumorali. - Titoli anticorpali o altre risposte immuni verso il virus elevate. - Capacità del virus di trasformare in vitro le cellule da cui origina il tumore e di indurre il tumore in animali. - Esistenza negli animali di tumori analoghi causati da virus simili.

11 Retrovirus oncogeni sono stati isolati in numerose specie animali, in cui possono provocare sia patologie neoplastiche (leucemie, linfomi, sarcomi, ecc) che non neoplastiche (glomerulonefriti, immunodepressioni, ecc). Negli animali: Retrovirus Oncogeni Alcuni danno patologie neoplastiche acute (con breve latenza); l azione oncogena è dovuta alla presenza nel loro genoma dei v-onc, mutati rispetto ai c-onc introduzione nella cellula di oncogeni sotto il controllo virale maggiore attività. Nella cellula normale molti c-onc sono controllati da geni oncosoppressori (es p53 e Rb). Altri sono cronici (con lunga latenza) e non hanno v-onc. L effetto oncogeno può esplicarsi per mutagenesi inserzionale o mediante transattivatori. Sono possibili anche altre cause (es. ricombinazioni con retrovirus endogeni).

12 Possono indurre tumori con diversi meccanismi: introducono nella cellula normale un v- onc la cui espressione è controllata dalle sequenze regolatrici del genoma virale (LTR) retrovirus privi di v-onc possono integrarsi a monte di un c-onc, promuovendone l espressione (attivatori in cis). Mutagenesi inserzionale alcuni retrovirus codificano proteine che aumentano la trascrizione, sia di geni virali che cellulari (attivatori in trans) es. HTLV-1 e la proteina tax Retrovirus Oncogeni I Retrovirus Oncogeni umani sfruttano quest ultimo meccanismo

13 Basi dell associazione fra HTLV-1 e leucemia linfoide T dell adulto: 1) I pazienti hanno ATC contro il virus; 2) Il DNA provirale è integrato nel genoma delle cellule leucemiche; 3) HTLV-1 in vitro provoca l immortalizzazione di linfociti T umani. HTLV-1 non ha oncogeni. HTLV-1 Però: bassa incidenza della leucemia nei soggetti infettati, lungo periodo di incubazione (oltre 20 anni), ecc. Necessari altri eventi (traslocazioni?).

14 HTLV-1 Supposto meccanismo oncogeno: Il virus codifica una proteina transattivante ( tax ) transattiva la trascrizione anche di geni cellulari, fra cui interleuchina-2 (fattore di crescita dei linfociti), il suo recettore e alcuni oncogeni si stabilirebbe un circuito autocrino: crescita incontrollata (produzione sia di recettore che di IL-2). 1. L infezione virale induce la sintesi di IL-2 e del suo recettore 2. Stimolazione policlonale di tutti i linfociti infettati 3. Controllo della reazione immunitaria verso le cellule che esprimono antigeni virali sopravvivenza di cellule infette che non esprimono antigeni di superficie 4. Queste cellule possono continuare la loro moltiplicazione per l azione di tax (anche per molti anni) 5. Può verificarsi un secondo evento (? Sconosciuto!!) solo in una o pochissime cellule che permette l espressione del recettore di IL-2 senza la presenza di tax (che non è necessaria per mantenere lo stato trasformato. Proliferazione clonale della cellula senza rischio di essere riconosciuta dal sistema immune.

15 Strutura genomica e trascrizione del provirus di HTLV-1, che porta alla stimolazione autocrina della moltiplicazione delle cellule T

16 Virus oncogeni a DNA Di solito i virus a DNA sostengono infezioni litiche; possono indurre trasformazione in condizioni che non permettono la replicazione. Nell infezione non produttiva il genoma persiste in toto, e a volte vengono espressi solo i geni precoci. Poliomavirus, papillomavirus e adenovirus hanno geni che attivano la replicazione virale (nel ciclo litico) ma anche la trasformazione cellulare (nell infezione abortiva trasformante).

17 Virus Epatite B Numerose osservazioni indicano un ruolo CAUSALE fra virus dell epatite B e carcinoma epatocellulare primario: Infezione da HBV e epatoma hanno la stessa distribuzione geografica. Pazienti con neoplasia hanno elevata frequenza di marcatori sierici di infezione pregressa. alcune cellule tumorali esprimono antigeni virali Latenza fra infezione da HBV e sviluppo di epatoma: 9-35 anni.

18 Il meccanismo oncogeno è oscuro: Virus Epatite B Il virus non è in grado di trasformare cellule in vitro, ma codifica un gene ( X ) che attiva la trascrizione di molti oncogeni cellulari (cmyc, c-fos, c-jun stimolazione della proliferazione degli epatociti. Topi transgenici per il gene X epatocarcinomi. Mutagenesi inserzionale: in alcuni epatomi il DNA virale è integrato vicino a oncogeni o oncosoppressori; spesso ci sono riarrangiamenti nelle sequenze cellulari adiacenti al genoma virale. Ruolo indiretto: deviazione in senso neoplastico del processo di rigenerazione cellulare che si sviluppa come meccanismo compensatorio della necrosi epatica. Topi transgenici per HBsAg producono molta proteina necrosi rigenerazione alterazioni genetiche epatoma. Importanza di cofattori: alterazioni immunologiche, cirrosi da alcol, aflatossina (carcinogeno fungino).

19 Virus Epatite C Alla cronicizzazione dell epatite C segue frequentemente lo sviluppo di epatomi. Si ritiene che ne sia responsabili la proteina p21 del core, che attiva alcuni oncogeni cellulari e modula l'apoptosi.

20 Virus di Epstein-Barr Infetta primariamente i linfociti B. Dopo l infezione primaria, EBV entra in latenza; l effetto dei geni virali espressi durante la latenza risulta nella immortalizzazione dei linfociti B che, se non vengono eliminati dalla reazione immunitaria cellulo-mediata, proliferano indefinitamente. Durante la latenza EBV esprime diverse funzioni, fra cui: EBNA-2 (Epstein-Barr Nuclear Antigen), che transattiva geni cellulari, fra cui l oncogene c-fgr (stimola proliferazione cellulare e blastizzazione dei linfociti); LMP1 (latent membrane protein) stimola la produzione di antigeni di attivazione dei linfociti e di molecole di adesione. Inoltre attiva il c-onc bcl-2, che a sua volta contrasta l apoptosi (= morte cellulare programmata).

21 L immortalizzazione indotta da EBV favorisce la possibilità che avvengano altri eventi che causano la progressione neoplastica. EBV è associato a: Linfoma di Burkitt, casi della malattia di Hodgkin, carcinoma nasofaringeo. Nella maggior parte dei tumori associati a EBV c è una traslocazione 8;14.

22 EBV e Traslocazione 8;14 Nel cromosoma 8 c è l oncogene c-myc, nel 14 ci sono i geni che codificano le catene pesanti delle immunoglobuline, che sono regolati da forti promotori della trascrizione. (cromosoma 2 = catene leggere, crom 8 = catene leggere ). Nella traslocazione c-myc trasloca al cromosoma 14, ponendosi sotto il controllo del promotore del gene delle Ig altera regolazione e aumento di trascrizione ed espressione di c-myc crescita delle cellule tumorali.

23 Linfoma di Burkitt Linfoma maligno a cellule B, prevalente in Africa Tropicale ad altitudini inferiori a 1500 m., e in Nuova Guinea. Presente in zone in cui la malaria è endemica. EBV è stato originariamente isolato da cellule tumorali coltivate in vitro. EBV è regolarmente associato al linfoma di Burkitt, suggerendo una associazione diretta causa-effetto (presenza di DNA virale, espressione di antigeni virali, traslocazione 8;14). Ma EBV è presente in tutto il mondo. Perché una particolare localizzazione geografica? Si pensa ad un ruolo della malaria. Attacchi ripetuti di malaria riducono l immunità cellulo-mediata (specie nell infanzia), responsabile del controllo della proliferazione delle cellule EBVtrasformate, e stimolano antigenicamente i linfociti B.

24 Esempio di carcinogenesi multifattoriale 1) EBV immortalizzando i linfociti B sarebbe l iniziatore della trasformazione; 2) l infezione malarica amplierebbe la popolazione di linfoblasti, potenzialmente favorendo la comparsa della traslocazione; 3) la traslocazione sarebbe responsabile della definitiva trasformazione neoplastica. 4) Ma sono coinvolti anche altri fattori (forse genetici) in quanto i maschi sono più colpiti delle femmine.

25 Carcinoma nasofaringeo Generalmente raro, è molto diffuso nel Sud della Cina e fra gli Eschimesi. Le cellule neoplastiche contengono copie multiple del DNA di EBV ed esprimono antigeni EBNA e LMP. Probabilmente sono coinvolti fattori genetici o alimentari (Cinesi emigrati in altre parti del mondo mantengono un elevato rischio di sviluppare il carc. nasofaringeo) Inoltre pazienti immunocompromessi (HIV, trapiantati) sviluppano linfomi associati a EBV a rapida insorgenza (4 mesi), senza necessità di cofattori.

26 HHV-8 Human herpesvirus 8 = -herpesvirus (stessa sottofamiglia di EBV), trovato mediante PCR differenziale in cellule di Sarcoma di Kaposi. Sarcoma di Kaposi: neoplasia con tre forme (classica, endemica, associata a AIDS, che hanno diversa aggressività ma istologia simile): tutte le neoplasie sono associate a HHV-8. HHV-8 è associato anche a linfomi primari effusivi (rara forma tumorale a cellule B) e alla malattia di Castleman (iperplasia angiolinfoproliferativa multicentrica). Meccanismo oncogeno: HHV-8 ha molti omologhi a geni cellulari che regolano il ciclo cellulare (ciclina D, recettore per IL-8, recettore per IL-6, ecc). Il virus ha la potenzialità di superare i blocchi del ciclo cellulare e indurre l oncogenesi.

27 Papillomavirus umani (HPV) La famiglia dei Papillomavirus umani è costituita da più di 100 tipi. Causano proliferazioni benigne cutanee e genitali (verruche, condilomi). Alcuni tipi di HPV (16, 18, ecc.) sono associati al carcinoma della cervice uterina (neoplasia più comune nelle donne dei Paesi del Terzo Mondo, circa nuovi casi all anno). - Il 90% dei carcinomi squamosi della cervice uterina contiene DNA di HPV; - nei condilomi il DNA virale è libero, nei carcinomi è integrato: L integrazione interrompe l organizzazione lineare del genoma; di solito avviene nella zona di E1-E2, mentre E6 ed E7 (gli oncogeni) rimangono intatti. E2 ha la funzione di regolare trascrizione di E6 e E7; la sua interruzione ne permette una alta espressione.

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29 Papillomavirus umani (HPV) Funzioni di E6/E7: E6/E7 immortalizzano colture primarie; inducono trasformazione completa di linee già immortalizzate; cooperano con l oncogene c-ras nella trasformazione neoplastica; E6 forma un complesso con p53 e la degrada: E7 lega p105rb, neutralizzando le funzioni.

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32 Papillomavirus umani (HPV) Necessità di cofattori per l oncogenesi da Papillomavirus: Papilloma del coniglio: conversione maligna dopo applicazione di catrame. Papillomatosi esofagea del bovino: conversione maligna negli animali nutriti con felci (contengono una tossina immunosoppressiva e radiomimetica). Epidermodisplasia verruciforme: conversione maligna solo delle lesioni con tipi ad alto potere oncogeno, in siti esposti alla luce del sole. Papilloma laringeo: andamento maligno in seguito a terapia con raggi X. Il papillomavirus da solo non è in grado di indurre il cancro. Plausibile l ipotesi che gli HPV oncogeni del tratto genitale esplichino il loro potenziale maligno in associazione ad altri fattori: ormonali (sono ugualmente diffusi negli uomini, ma scarsa incidenza di tumori), chimici (??metaboliti della popolazione microbica vaginale??), virali (??virus dell herpes simplex??).

33 Nel 1775, Percival Pott, medico inglese, ha associato i tumori dello scroto negli spazzacamini alla natura del loro lavoro e alla presenza di agenti cancerogeni nella fuliggine. Oggi si sa che la sostanza cancerogena della fuliggine è il 3,4-benzopirene. Coniglio con papilloma di Shope. Lesione virale benigna, puo subire trasformazione neoplastica, dopo esposizione a cofattori chimici (es. catrame)

34 Possono dare: Poliomavirus infezione litica = esprimono sia le proteine precoci che quelle tardive ciclo completo di replicazione lisi cellulare; trasformazione = in cellule non permissive esprimono solo le funzioni precoci, fra cui le proteine trasformanti ciclo infettivo abortivo non lisi, ma trasformazione. Il genoma virale si integra in quello cellulare. Per indurre e mantenere la trasformazione è necessaria espressione di alcune funzioni virali.

35 Poliomavirus Il meccanismo della trasformazione neoplastica è diverso per i diversi polioma. Esempio di SV40 (virus della scimmia): L antigene T, tumorale, è necessario per mantenere la trasformazione. Nel ciclo litico ha la funzione di promuovere la sintesi del DNA virale. Data la sua affinità per le origini di replicazione, potrebbe stimolare anche la sintesi del DNA cellulare svincolo dai controlli cellulari trasformazione. Ma l effetto più probabile è dato dal suo legame con la proteina Rb (p105). Il gene Rb, quando è deleto o alterato, è associato al retinoblastoma ereditario controlla negativamente la crescita e la proliferazione. Il legame T/p105 ne inattiva le funzioni regolatrici attivazione della proliferazione cellulare fenotipo trasformato.

36 Poliomavirus T forma un complesso anche con la proteina p53, inattivandola. p53 è prodotta da un altro gene oncosoppressore, che spesso è mutato o deleto in tumori umani.

37 SV40 PATOGENESI POLIOMAVIRUS Ospite naturale: scimmie. I primi vaccini antipolio erano ottenuti da cellule di scimmia contaminate da SV40 decine di milioni di persone sono state inoculate con SV40 vivo. L effetto di questa infezione è ancora sconosciuto. Tracce di infezione si trovano nel 2-20% della popolazione generale. Non causa tumori in scimmie, ma trasforma cellule umane e di roditori, e causa diversi tipi di tumore quando viene inoculato in grande quantità in criceti neonati Sequenze di DNA di SV40 (ma non il virus) si riscontrano in alcuni specifici tumori umani (mesoteliomi, neoplasie del plesso coriodeo, ependinomi, osteosarcomi, linfomi non Hodgkin). Fra il 1955 ed il 1963 il vaccino antipolio conteneva SV40 (Era presente nelle colture cellulari usate per far crescere il virus) SV40 causa tumori nell uomo?

38 SV40 e tumori umani Sequenze di DNA virale si trovano frequentemente in tumori cerebrali e mesoteliomi, ma non tutti i tumori hanno sequenze virali DNA virale presente anche in tumori insorti in persone nate dopo il 1963 Nessun aumento nell incidenza di neoplasie in 1000 bambini inoculati con SV40 (Mortimer et al., 1981) Nessun aumento nell incidenza di tumori cerebrali in 800,000 bambini tedeschi inoculati con SV40 (22 anni di follow up) (Geissler et al., 1990) Nessun aumento di tumori in bambini nati durante il periodo di esposizione a SV40, rispetto a bambini nati prima e a quelli nati dopo (Strickler et al., 1998) CONCLUSIONE: è ancora dibattuto se l esposizione a SV40 aumenta il rischio di neoplasia nell uomo. MA: Come sono arrivate le sequenze virali nel genoma di chi non ha ricevuto il vaccino contaminato? Che cosa fanno?

39 ADENOVIRUS UMANI Alcuni AdV sono oncogeni in animali e trasformano colture cellulari. Coinvolti geni precoci: E1A immortalizza cellule primarie, E1B coopera nella trasformazione, E1A+E1B necessari per trasformazione completa ed oncogenicità. Non sono associati a neoplasie umane.