Sistema di rilevazione dei polimeri MultiVision: Polimeri Multivision anti-coniglio/ HRP + anti-topo/ AP

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1 Sistema di rilevazione dei polimeri MultiVision: Polimeri Multivision anti-coniglio/ HRP + anti-topo/ AP Pag. 1 di 5 USO PREVISTO: Per uso diagnostico in vitro. DISPONIBILITÀ: Codice catalogo Quantità vetrini vetrini SPECIFICITÀ: IgG anti-topo (H+L) e IgG anti-coniglio (H+L) ENZIMI: Perossidasi e fosfatasi CROMOGENO/SUBSTRATO: LVBlue/LVRed REAGENTI: Q.tà Componente 1 Polimeri (cocktail) Multivision anti-coniglio/ HRP + anti-topo/ AP TL-012-MAM 1 Ultra V block TA-012-UB 1 Bloccante alla perossidasi di idrogeno TA-012-HP 1 Tampone AP LVBlue TA-075-TMM 1 Fiala 1 del cromogeno LVBlue TA-001-AB1 1 Fiala 2 del cromogeno LVBlue TA-001-AB2 1 Fiala 3 del cromogeno LVBlue TA-001-AB3 1 Fiala 1 del cromogeno LVRed TA-004-HR1 1 Fiala 2 del cromogeno LVRed TA-002-HR2 1 Fiala 3 del cromogeno LVRed TA-002-HR3 1 Fiala 4 del cromogeno LVRed TA-002-HR4 1 Mezzo di montaggio TA-005-UA FORNITURA: Cocktail di polimero pronto per l'uso composto da polimeri Multivision anti-coniglio/hrp + anti topo/ap. LVBlue per attività di fosfatasi alcalina e LVRed per attività di perossidasi di rafano. DESCRIZIONE MultiVision Polymer Detection System è un sistema di rilevazione del polimero semplice ed affidabile per la visualizzazione di due antigeni contemporaneamente in blu e in rosso. Insieme al cocktail di polimeri Multivision pronto per l'uso composto da fosfatasi anti-topo/alcalina (AP) + perossidasi anti-coniglio/rafano (HRP), può essere utilizzato un cocktail di anticorpi primari di alta qualità. Questo cocktail è formulato nello specifico da polimeri MultiVision che forniscono una migliore sensibilità, più risparmio in termini di tempo e maggiore semplicità nel rilevamento. L'AP Multivision e i polimeri HRP sono tecnologie innovative e brevettate composte da subunità di polimeri di aminoacidi più piccole che minimizzano i conflitti nei legami con la proteina target. Il polimero più piccolo consente di avere minori conflitti di legame, ottenendo una colorazione più uniforme e una migliore amplificazione del segnale. Infine, fornisce all utente una maggiore sensibilità ed efficienza dell anticorpo, nonché un miglior rapporto segnale-rumore. Inoltre, UltraVision LP è privo di biotina, eliminando così la colorazione di fondo riscontrata con i metodi tradizionali di rilevazione a base di tale sostanza chimica. Il sistema di rilevazione del polimero MultiVision ottiene una colorazione

2 Pag. 2 di 5 doppia di alta qualità in meno di due ore su sezioni tissutali fissate in formalina e incluse in paraffina. Per una interpretazione ottimale dei risultati, devono essere inclusi controlli positivi e negativi. PRINCIPIO DELLA PROCEDURA: Questo sistema di rilevazione di polimeri MultiVision può essere impiegato con qualsiasi cocktail di anticorpi primario per visualizzare contemporaneamente la presenza di due proteine. Una volta legati gli anticorpi specifici ai loro rispettivi antigeni nelle sezioni tissutali, gli anticorpi primari del coniglio e del topo vengono localizzati mediante un cocktail formulato nello specifico da polimeri di anticorpi secondari: polimeri Multivision anti-coniglio/ HRP + MultiVision anti-topo/ AP. In genere, il polimero dell'aminoacido è legato agli enzimi AP o HRP e ai frammenti Fab di immunoglobuline anti-coniglio di capra o anti-topo di capra. Quindi il polimero complesso viene visualizzato con, prima, il cromogeno LVBlue per attività dell'ap e poi, dopo il lavaggio, con il cromogeno LVRed per l'attività dell'hrp. Non è consigliata una controcolorazone nucleare con ematossilina AVVERTENZE E PRECAUZIONI: I casi clinici devono essere valutati nel contesto della prestazione di controlli adeguati. L'inclusione di un controllo negativo fissato ed elaborato nella stessa maniera del campione del paziente, posto su ogni vetrino oltre al tessuto del caso, è fortemente consigliata. Affinché il test possa essere considerato valido, il controllo negativo deve essere pulito. In alcuni casi, può essere osservata, e ritenuta accettabile, una colorazione molto debole. Inoltre, si consiglia di includere un controllo negativo del tessuto per ogni lotto di campioni processati eseguito su Lab Vision Autostainer. Questo controllo negativo del tessuto deve essere incluso per garantire che le altre procedure di trattamento non creino una colorazione falsa positiva. Fare riferimento alle schede tecniche di sicurezza per le istruzioni di sicurezza del materiale. CONSERVAZIONE E STABILITÀ: Tutti i componenti sono stabili fino a 12 mesi se conservati tra i 2 e gli 8 C. Conservare i cromogeni lontani dalla luce, se possibile. STATO MICROBIOLOGICO: Prodotto(i) non sterile(i) I MATERIALI NECESSARI NON SONO FORNITI: Reagenti di pretrattamento dei tessuti. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI E DEI REAGENTI: Consultare la procedura PROCEDURA (USO MANUALE): PROTOCOLLO DI COLORAZIONE (componenti del kit in grassetto) NOTA: I controlli appropriati, in particolare i controlli negativi, devono essere inclusi con tutte le elaborazioni dei vetrini manuali o automatizzate. L'inclusione di controlli negativi aiuteranno ad interpretare con precisione i risultati della colorazione e aiuteranno a determinare i falsi positivi. Fare riferimento alla sezione sugli avvisi e sulle precauzioni per i dettagli.

3 Pag. 3 di 5 1. Sezioni tissutali in paraffina: deparaffinizzare nel sostituto dello xilene e reidratare in alcoli graduati 2. Lavare in tampone TBST per 2 volte: (TBS + 0,1% Tween20). 3. Effettuare il pretrattamento del tessuto: recupero dell'epitopo mediante induzione di calore per 90 minuti a 98 C, quindi raffreddare a temperatura ambiente per 20 minuti. 4. Lavare 4 volte in acqua distillata. 5. Applicare la soluzione bloccante alla perossidasi di idrogeno e incubare per 10 minuti a 6. Lavare in TBST 4 volte 7. Applicare Ultra V Block e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente per bloccare la colorazione di fondo aspecifica Nota: non superare 10 minuti, altrimenti può verificarsi una riduzione dell'intensità della colorazione. 8. Non lavare dopo Ultra V Block, ma togliere la soluzione bloccante in eccesso e continuare con il passo successivo.. 9. Applicare il cocktail di anticorpi primari e incubare per 30 minuti a 10. Lavare in TBST 4 volte 11. Incubare con il cocktail di polimeri MultiVision: anti-coniglio/hrp + anti-topo/ap per 30 minuti a 12. Lavare in TBST 4 volte 13. Preparare una soluzione operative LVBlue immediatamente prima dell'uso e usare entro 15 minuti dalla preparazione, altrimenti la sua sensibilità può diminuire. 14. Aggiungere una goccia di fiala 1 LVBlue a 2,5 ml di tampone AP e miscelare con cura. 15. Aggiungere una goccia di fiala 2 LVBlue al tampone AP e miscelare con cura. 16. Aggiungere una goccia di fiala 3 LVBlue al tampone AP e miscelare con cura. 17. Applicare la soluzione alla sezione tissutale e incubare per 10 minuti. 18. Lavare in TBST 4 volte 19. Preparare una soluzione operativalvred immediatamente prima dell'uso e usare entro 15 minuti dalla preparazione, altrimenti la sua sensibilità può diminuire. 20. Aggiungere tre gocce di fiala 1 LVRed a 5 ml di acqua distillata e miscelare con cura. 21. Aggiungere due gocce di fiala 2LVRed e miscelare con cura. 22. Aggiungere due gocce di fiala 3LVRed e miscelare con cura. 23. Aggiungere due gocce di fiala 4LVRed e miscelare con cura. 24. Applicare la soluzione alla sezione tissutale e incubare per 10 minuti. 25. Lavare 4 volte in acqua distillata. 26. Asciugare completamente la sezione tissutale, preferibilmente su piastra calda a 60 C per 1 ora. 27. Montare con un sostituto dello xilene contenente il mezzo fornito nel kit. NOTA 1:L'utilizzo di mezzi di montaggio acquosi farà sparire il prodotto della reazione LVRed nel giro di pochi giorni. NOTA 2: L'utilizzo di un mezzo di montaggio contenente xilene, può parzialmente sciogliere il prodotto di reazione LVBlue. PROCEDURA (PER AUTOSTAINER): NOTA: I controlli appropriati, in particolare i controlli negativi, devono essere inclusi con tutte le elaborazioni dei vetrini manuali o automatizzate. L'inclusione di controlli negativi aiuterà ad interpretare con precisione i risultati della colorazione, così come a determinare i falsi positivi. Fare riferimento alla sezione sugli avvisi e sulle precauzioni per i dettagli.

4 Pag. 4 di 5 1. Sezioni tissutali in paraffina: deparaffinizzare nel sostituto dello xilene e reidratare in alcoli graduati 2. Lavare in tampone TBST per 2 volte. 3. Effettuare il pretrattamento del tessuto: recupero dell'epitopo mediante induzione di calore per 90 minuti a 98 C, quindi raffreddare a temperatura ambiente per 20 minuti. 4. Lavare 4 volte in acqua distillata. 5. Applicare la soluzione bloccante alla perossidasi di idrogeno e incubare per 10 minuti a 6. Sciacquare con TBST. 7. Applicare Ultra V Block e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente per bloccare la colorazione di fondo aspecifica. Nota: non superare 10 minuti, altrimenti può verificarsi una riduzione dell'intensità della colorazione. 8. Applicare il cocktail di anticorpi primari e incubare per 30 minuti a 9. Sciacquare con TBST. 10. Incubare con il cocktail di polimeri MultiVision: anti-coniglio/hrp + anti-topo/ap per 30 minuti a 11. Sciacquare con TBST. 12. Preparare una soluzione operativa nuova di LVBlue immediatamente prima dell'uso (seguire le istruzioni 14 16, in alto). Applicare e incubare per 10 minuti usando la funzione "Substrate-Batch". 13. Sciacquare tre volte; una volta con TBST, poi con acqua distillata e di nuovo con TBST, rispettivamente. 14. Preparare una soluzione operativa nuova di LVRed immediatamente prima dell'uso (seguire le istruzioni 20 23). Applicare e incubare per 10 minuti usando la funzione "Substrate-Batch". 15. Lavare 4 volte in acqua distillata. 16. Asciugare completamente la sezione tissutale, preferibilmente su piastra calda a 60 C per 1 ora. 17. Montare con il mezzo di montaggio sostituto dello xilene fornito nel kit. NOTA 1: L'utilizzo di mezzi di montaggio acquosi farà sparire il prodotto di reazione LVRed nel giro di pochi giorni. NOTA 2: L'utilizzo di un mezzo di montaggio contenente xilene, può parzialmente sciogliere il prodotto di reazione LVBlue. CONSIGLI: 1. Accertarsi che le soluzioni LVBlue e LVRed siano utilizzate a temperatura ambiente; temperature inferiori a quella ambiente possono provocare una colorazione inferiore, anche se le temperature troppo alte possono provocare una maggiore colorazione con in più un fondo aspecifico. 2. L'attività di fosfatasi alcalina è inibita dagli ioni fosfati. Non utilizzare PBS per il lavaggio e la diluizione dei reagenti. LIMITAZIONI: 1. L'utilizzo di questo kit si limita ai campioni fissati in formalina e incorporati in paraffina. 2. Il prodotto della reazione LVBlue è meno meno preciso del prodotto della reazione LVRed. Questo può oscurare l'osservazione. 3. La fosfatasi alcalina endogena in genere è assente nei campioni tissutali fissati in formalina e incorporati in paraffina. L'attività dell'ap endogena presente nei tessuti intestinali non è inibita dal levamisole e ha bisogno di trattamento prima dell'immunocolorazione (Bulman AS e Heyderman E, J. Clin. Pathol. 34:1349, 1981).

5 Pag. 5 di 5 BIBLIOGRAFIA PER LA DOPPIA COLORAZIONE: 1. Immunoenzyme Multiple Staining Methods. CM van der Loos, Manuale n. 45, BIOS Scientific Publishers, Oxford, UK, ISBN: o Springer-Verlag, New York, ISBN: x. 2. Multiple staining in molecular morphology, CM van der Loos. In: Molecular morphology in human tissues (Eds. Hacker GW and Tubbs RR), CRC Press, Boca Raton, FL, 2005, pp