UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVA

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1 UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVA Dipartimento di Medicina Animale, Produzioni e Salute SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE Sanità Animale, Allevamento e Produzioni Zootecniche Tesi di specializzazione Salmonella Enteritidis in allevamenti di galline ovaiole della Regione Veneto: stato dell arte delle procedure di pulizia e disinfezione dei capannoni RELATORE: Ch. mo Prof. Martini Marco CORRELATORI: dr. ssa Cibin Veronica, dr. Bernardi Zeno SPECIALIZZANDO: Dott. ssa Roccato Anna Anno Accademico

2 INDICE RIASSUNTO Pag. 1 ABSTRACT Pag. 2 INTRODUZIONE ALL'ARGOMENTO Pag SALMONELLA E SALMONELLOSI Pag SALMONELLE: EZIOLOGIA, CLASSIFICAZIONE E NOMENCLATURA Pag EPIDEMIOLOGIA E PATOGENESI DELLE INFEZIONI DA SALMONELLA Pag SALMONELLOSI NELL UOMO Pag SALMONELLOSI NEGLI AVICOLI Pag IL CONTROLLO DELLE ZOONOSI Pag ASPETTI NORMATIVI DI CARATTERE GENERALE Pag PIANI DI CONTROLLO DELLE SALMONELLE AI SENSI DEL REGOLAMENTO CE 2160/2003 Pag PIANO NAZIONALE PER IL CONTROLLO DI SALMONELLA NELLE GALLINE OVAIOLE DELLA SPECIE GALLUS GALLUS 3. PULIZIA E DISINFEZIONE COME MISURA DI CONTROLLO DELLA SALMONELLA NEGLI ALLEVAMENTI AVICOLI Pag. 14 Pag IMPORTANZA DI PULIZIA E DISINFEZIONE COME MISURA DI PROFILASSI DIRETTA Pag LE PROCEDURE DI PULIZIA E DISINFEZIONE DI STRUTTURE E ATTREZZATURE IN ALLEVAMENTI DI GALLINE OVAIOLE: INFORMAZIONI DALLA LETTERATURA Pag SCOPO DELLA TESI Pag MATERIALI E METODI Pag IDENTIFICAZIONE DEGLI ALLEVAMENTI DI OVAIOLE CON EVENTO DI POSITIVITÀ A SE Pag ELABORAZIONE DEL QUESTIONARIO Pag RICHIESTA DI COLLABORAZIONE AI VETERINARI Pag VISITA DEGLI ALLEVAMENTI SELEZIONATI Pag ELABORAZIONE STATISTICA DEI DATI Pag RISULTATI Pag ANALISI DESCRITTIVA DEI DATI DEL QUESTIONARIO Pag DATI GENERALI E STRUTTURE-ATTREZZATURE PRESENTI IN ALLEVAMENTO Pag LA PULIZIA Pag LA DISINFEZIONE Pag ANALISI DEI FATTORI DI RISCHIO Pag PULIZIA E DISINFEZIONE NEI DUE GRUPPI: ALLEVAMENTI CON ESITO NEGATIVO E ALLEVAMENTI CON ESITO POSITIVO PER SE AI TAMPONI AMBIENTALI Pag INTERVENTI DI RISTRUTTURAZIONE Pag. 33

3 TIPOLOGIA DI ALLEVAMENTO Pag STOCCAGGIO DELLA POLLINA Pag TIPOLOGIA DI PULIZIA APPLICATA Pag MODALITÀ DI PULIZIA/LAVAGGIO DELLE STRUTTURE MOBILI E CAPANNONI Pag TEMPO IMPIEGATO PER LA PULIZIA Pag MODALITÀ DI APPLICAZIONE DEL DISINFETTANTE Pag ORE DEDICATE ALLA DISINFEZIONE Pag NUMERO CICLI DI DISINFEZIONE Pag DISCUSSIONE E CONCLUSIONI Pag ANALISI DESCRITTIVA DEI RISULTATI Pag ANALISI DEI FATTORI DI RISCHIO Pag CONCLUSIONI DI CARATTERE GENERALE Pag. 42 ALLEGATO 1 Pag. 44 BIBLIOGRAFIA Pag. 47 RINGRAZIAMENTI Pag. 55

4 RIASSUNTO L'applicazione del Piano Nazionale di controllo di Salmonella Enteritidis (SE) e Typhimurium (ST) nelle galline ovaiole della specie Gallus gallus a partire dal 2008, ha permesso di ridurre la prevalenza di SE, principale sierotipo responsabile dei casi di salmonellosi umana a livello europeo. In caso di gruppi di animali positivi a SE/ST, si applicano una serie di misure sanitarie volte a tutelare la salute dei consumatori e ad evitare la persistenza di Salmonella in allevamento; nonostante l applicazione di procedure di pulizia e disinfezione, sono segnalati a livello europeo, Italia inclusa, dei casi di recidiva, imputabili anche alla scarsa efficacia delle procedure di pulizia e disinfezione applicate. Poiché non esistono linee guida in materia di pulizia e disinfezione, obiettivo di questa ricerca è stato quello di approfondire la conoscenza riguardo le procedure di pulizia-disinfezione applicate in allevamenti di galline ovaiole, attraverso lo studio di un campione di allevamenti della Regione Veneto risultati positivi a SE nel corso di controlli ufficiali eseguiti nel periodo Inoltre ulteriore scopo è stato quello di individuare eventuali fattori critici nelle procedure di puliziadisinfezione per la permanenza di SE in allevamento. Dallo studio è emersa una notevole eterogeneità tra gli allevamenti sia in termini di tipologia di allevamento che di modalità di pulizia-disinfezione applicate. In particolare vale la pena evidenziare che: nella maggior parte dei casi non è disponibile un documento in cui vengono riportati i dettagli tecnici delle procedure di pulizia-disinfezione; la formazione non è il risultato di un processo di apprendimento strutturato e metodico; le modalità d'impiego degli strumenti per il lavaggio delle strutture (in particolare pressione e portata dell acqua) sono spesso non adeguate e le condizioni d'uso di detergenti e disinfettanti sono frequentemente non note. In conclusione, questo studio mostra come le procedure di pulizia e disinfezione siano un insieme complesso di operazioni che per poter essere veramente efficaci richiedono l'impiego di personale adeguatamente formato ed altamente specializzato.

5 ABSTRACT The application of the National Control Program for Salmonella Enteritidis (SE) and Typhimurium (ST) in laying hens since 2008, has lead to a decrease of the prevalence of SE, the main serovar responsible of human salmonellosis cases at European level. In case of positive flocks for SE/ST, a series of sanitary measures are taken to protect the human health and avoid the persistence of Salmonella in the farms; despite the application of cleaning and disinfection procedures, cases of layer farms with persistent Salmonella contamination have been recorded at European level, Italy included, probably due also to a low standard of cleaning and disinfection (C&D) procedures. Since guidelines on cleaning and disinfection are not available, the main goal of this research was to deep the knowledge on C&D programmes applied in laying hens farms, through the study of a sample of Veneto Region farms, that from 2009 to 2011 have been found positive for SE, during official controls and environmental swabs, collected according to the national control program. Moreover the study has try to identify possible critical factors of C&D procedures, related to the persistence of SE in the farms after C&D. This study has highlighted the presence of a huge heterogeneity between farms considering both the type of production system and the applied C&D procedures. In particular, it has been pointed out that: the lacking, in most of the cases, of a document in which the technical details of the C&D procedures are reported; the knowledge of the farmers is not the result of a structured and systematic learning process; the using way (in particular pressure and flow) of the equipment applied for the washing step is often unsuited and the concentration and application rate of disinfectants are often unknown. In conclusion, this study has shown how the C&D procedures are a complex whole of actions that to be effective require skilled people with a high level of knowledge. 2

6 INTRODUZIONE ALL ARGOMENTO Salmonella spp. è ad oggi il principale responsabile, in Italia, di zoonosi trasmesse con gli alimenti: nel 2010 infatti 5489 ceppi di Salmonella spp. sono stati isolati da casi di infezione umana (Enternet, 2011). A livello europeo Salmonella spp. occupa, dopo Campylobacter spp., il secondo posto come responsabile di casi umani notificati di zoonosi alimentare ma è il primo agente causa di tossinfezione alimentare nei focolai epidemici (foodborne outbreaks). Nell Unione Europea, infatti, nel 2010 Salmonella spp. è risultata essere l'agente responsabile del 30,5% di tutti i focolai di malattia alimentare (EFSA, 2010). Salmonella Enteritidis (SE) è il sierotipo più frequentemente isolato nei casi di salmonellosi umana in Europa seguito da Salmonella Typhimurium (ST); da quanto emerge dall analisi dei dati relativi agli strong evidence outbreaks notificati dai Paesi europei, i casi di salmonellosi umana da SE sono frequentemente associati al consumo di uova crude e ovoprodotti (EFSA, 2010). A partire dal nuovo millennio la Commissione Europea ha sviluppato una nuova politica di sicurezza alimentare basata sull approccio di filiera ed in particolare ha individuato una strategia di controllo delle salmonellosi che si basa anche sull'applicazione di piani di controllo a livello di produzione primaria (Regolamento CE n. 2160/2003). Tali piani di controllo sono applicati obbligatoriamente a partire dal 2007 ed hanno coinvolto varie categorie produttive del settore avicolo con l obiettivo di diminuire il numero di casi umani attraverso la riduzione della prevalenza dei sierotipi di Salmonella rilevanti per la salute pubblica a livello di allevamento. Il numero di casi di salmonellosi umana in Europa è passato da casi del 2003 a del 2010, con una riduzione soprattutto dei casi associati a SE, evidenziando così l'efficacia di tale approccio (EFSA Report 2007 e 2010). L applicazione del piano di controllo nelle galline ovaiole, in particolare, obbligatoriamente applicato anche in Italia a partire dal 2008, ha consentito di ridurre la prevalenza di gruppi positivi nel territorio nazionale dall'8% (Piano nazionale di controllo approvato con Decisione 2007/848/CE, dati riferibili al baseline study del 2004) al 3.3%. (Piano nazionale di controllo 2013 approvato con Decisione 2012/716/UE, dati riferiti al 2011). L esperienza maturata in questi anni, attraverso l applicazione dei piani di controllo in Italia e l acquisizione di dati epidemiologici da parte del Centro di Referenza Nazionale per le Salmonellosi (CRNS), hanno permesso di evidenziare come la pulizia e disinfezione dei capannoni che hanno ospitato gruppi di avicoli positivi per salmonelle rilevanti, rappresentino un punto cruciale per ridurre il rischio di recidive. 3

7 La pulizia e disinfezione del capannone che ospitava gruppi positivi a sierotipi rilevanti è da effettuarsi obbligatoriamente e sotto controllo ufficiale, ai sensi dei piani di controllo, prima dell accasamento di nuovi gruppi. E' importante sottolineare che l applicazione di un'efficace pulizia-disinfezione di un capannone è un compito difficile, laborioso e costoso, soprattutto nel caso degli allevamenti di galline ovaiole, data l'intrinseca complessità delle strutture e attrezzature impiegate. Ad oggi, le modalità di pulizia e disinfezione utilizzate a livello nazionale non devono seguire indicazioni specifiche e non sono disponibili linee guida alle quali far riferimento. Di conseguenza il presente lavoro si sviluppa nell'ottica di approfondire le modalità con cui pulizia e disinfezione vengono applicate e quale sia il livello di conoscenza e competenze riguardo questo argomento. Tale obiettivo è stato perseguito attraverso l analisi di dati acquisiti a posteriori, raccolti tramite un questionario (predisposto in collaborazione con il dottor Zeno Bernardi, medico veterinario esperto dell argomento) in merito a modalità di pulizia e disinfezione applicate in casi di positività a SE in allevamenti di galline ovaiole della Regione Veneto. L acquisizione dei dati è stata possibile attraverso la collaborazione del CRNS con i veterinari ufficiali responsabili dei campionamenti previsti dai piani di controllo e grazie alla disponibilità dei responsabili degli allevamenti selezionati. Ulteriormente, obiettivo del lavoro è stato quello di confrontare modalità di pulizia e disinfezione applicate in caso di allevamenti i cui capannoni sono risultati negativi ai tamponi ambientali (pulizia e disinfezione efficace) rispetto ad allevamenti che hanno avuto un esito positivo ai tamponi ambientali a seguito di pulizia e disinfezione (pulizia e disinfezione non efficace). 4

8 CAPITOLO 1. SALMONELLA E SALMONELLOSI 1.1 Salmonelle: eziologia, classificazione e nomenclatura Il nome del genere Salmonella fu proposto per la prima volta da Lignières nel 1900 in segno di riconoscimento al lavoro svolto dal batteriologo americano D.E. Salmon che insieme a T. Smith nel 1886 descrisse l'agente responsabile del tifo suino (Bacterium suipestifer), successivamente denominato Salmonella Choleraesuis (Bell C. & Kyriakides A., 2002). I batteri del genere Salmonella spp. appartengono alla famiglia delle Enterobacteriaceae, sono microrganismi Gram negativi, non sporigeni, anaerobi facoltativi, ossidasi negativi, catalasi positivi, in grado di utilizzare come fonte di carbonio il citrato. Si presentano di forma bastoncellare, delle dimensioni di 0,7-1,5 x 2,0-5,0 μm, normalmente mobili per la presenza di flagelli peritichi, ad eccezione di S. Gallinarum e S. Pullorum. In grado di fermentare il glucosio con conseguente produzione di acido e gas, sono organismi mesofili, con una temperatura di crescita ottimale compresa tra 35 e 37 C, in grado comunque di replicare tra 7 e 46 C. Sono organismi termolabili, inattivati dal processo di pastorizzazione, sensibili a ph pari o inferiore a 4.5, incapaci di moltiplicare in presenza di una a w di 0.94 soprattutto se associata ad un ph pari a 5.5 o inferiore. Sono in grado di sopravvivere al congelamento e all'essiccamento per lunghi periodi e possono moltiplicare nei cibi senza alterarne le caratteristiche organolettiche. Resistono a lungo (anche mesi) nelle feci, nei liquami, nei corsi d'acqua (Bibek R., 2004; Zavanella M., 2001). Attualmente la classificazione si basa sulla schema di Kauffmann- White- LeMinor: lo studio degli antigeni somatici (O) e flagellari (H) della cellula batterica di Salmonella ha reso possibile una classificazione sierologica delle salmonelle. Il genere Salmonella comprende due sole specie: S. enterica e S. bongori; a sua volta la specie S. enterica si divide in sei sottospecie (S. enterica subsp. enterica, S. enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae, S. enterica subsp. indica). I sierotipi appartenenti a S. enterica subsp. enterica vengono indicati con un nome (es. S. Typhimurium, S. Dublin) di fantasia di solito correlato alla malattia causata o al luogo geografico nel quale il sierotipo è stato per la prima volta isolato. Il nome viene scritto in lettere romane (non in corsivo) e la prima lettera è maiuscola. I sierotipi appartenenti alle altre sottospecie sono designati dalle loro formule antigeniche, seguite dal nome della sottospecie. Attualmente vengono descritti più di 2600 sierotipi, la maggior parte dei quali appartengono a S. enterica subspecie enterica, isolati nell'uomo e negli animali a sangue caldo e tutti potenzialmente in grado di determinare malattia nell uomo (EFSA, 2010; Stevens M.P. et al., 2009). 5

9 Di seguito vengono descritti gli antigeni presenti sulla superficie della cellula batterica. Antigeni O: sono rappresentati dai lipopolisaccari (LPS) presenti sulla membrana esterna (LPS) responsabili della tossicità (endotossina) e della specificità antigenica del soma e vengono definiti antigeni somatici O. Gli antigeni O vengono indicati con numeri; attualmente si conoscono 65 antigeni O. Antigeni H: le specie mobili di Salmonella possiedono gli antigeni flagellari (detti anche ciliari), conosciuti come antigeni H, di natura proteica, termolabili e presenti in due fasi, rispettivamente note come fase 1 (o specifica, perché tipica di quel sierotipo) e fase 2 (o aspecifica, perché comune a più sierotipi). Tali fasi possono presentarsi contemporaneamente al momento delle prove di agglutinazione ma più spesso per riuscire a tipizzare una Salmonella bifasica è necessario provocare la cosiddetta inversione di fase in modo da far esprimere anche la fase latente. Alcuni sierotipi di Salmonella, detti monofasici, possiedono solo una fase (di solito la fase 1) come nel caso di Salmonella Enteritidis. Infine l'antigene di fase 1 viene indicato con una lettera dell'alfabeto minuscola (a, b, c, ecc.) mentre quello di fase 2 con un numero. Attualmente si conoscono 35 antigeni H. Antigene Vi: alcune salmonelle possiedono anche un terzo tipo di antigene, chiamato Vi (da virulenza), dato che gli stipiti che lo possiedono sono più virulenti (ad es. Salmonella Typhi, S. Paratyphi C, S. Dublin). Esso ha la caratteristica di mascherare gli antigeni O, rendendoli non agglutinabili dai sieri somatici. L antigene Vi delle salmonelle corrisponde agli antigeni K (capsulari) degli altri enterobatteri (Zavanella M., 2001; Pascucci S., 2005). Infine uno strumento importante per svolgere indagini epidemiologiche su alcuni sierotipi di Salmonella, come ad esempio S. Enteritidis (SE) e S. Typhimurium (ST), è rappresentato dalla fagotipizzazione, tecnica che permette infatti di differenziare il medesimo sierotipo in sottotipi (fagotipi) in base alla diversa sensibilità nei confronti di un pannello di batteriofagi. Questa tecnica sfrutta la caratteristica che hanno alcuni batteri di possedere recettori specifici per determinati fagi sierotipo specifici che, quindi, possono penetrare, replicarsi nella cellula e indurne la lisi. Si parla di Definitive Type (DT) per i fagotipi di ST, di Phage Type (PT) per quelli di SE e di Unknown (U) per i fagotipi che non hanno ancora una classificazione definitiva. Presso il laboratorio del Centro di Referenza Nazionale Salmonellosi (CRNS) viene effettuata la fagotipizzazione di tutti i ceppi di ST e SE isolati da matrici di tipo veterinario dagli IIZZSS distribuiti sul territorio nazionale. 6

10 1.2 Epidemiologia e patogenesi delle infezioni da Salmonella La salmonellosi è una zoonosi, ovvero una malattia infettiva trasmissibile tra gli animali e l'uomo. Il coinvolgimento di animali, alimenti, uomo e ambiente nel ciclo biologico di Salmonella spp. contribuisce a renderlo notevolmente complesso. Le fonti principali di contaminazione sono costituite da animali infetti e dai portatori sani, che garantendo una costante carica microbica ambientale contribuiscono a mantenere l'infezione in azienda e permettono allo stesso tempo di disseminare il microrganismo su terreni, pascoli e acque superficiali. Essi, infatti, albergano le salmonelle e possono eliminarle abbondantemente con le feci e con le urine o altri escreti o secreti in caso di infezione sistemica (Bibek R., 2004; Hoelzer K. et al., 2011; Pascucci S., 2005). I sierotipi appartenenti a Samonella enterica subsp. enterica sono in grado di infettare un gran numero di animali a sangue caldo come l'uomo e altri mammiferi. Da un punto di vista epidemiologico a seconda del grado di adattamento all'ospite di questi sierotipi, si possono identificare sierotipi strettamente adattati ad un particolare ospite (host restricted), sierotipi ubiquitari e presenti in ospiti diversi (unrestricted) oppure, sierotipi che pur essendo associati prevalentemente ad una specie ospite, possono essere in grado di causare malattia anche in altre specie (host adapted). I sierotipi host restricted quali S. Typhi, S. Gallinarum, S. Pullorum provocano generalmente un'infezione sistemica rispettivamente nell'uomo e nel pollame. I sierotipi host adapted, come S. Dublin, S. Choleraesuis e S. Hadar, sono associati ad infezioni sistemiche rispettivamente in bovini, suini e volatili, ma possono provocare malattia anche in altri mammiferi, incluso l'uomo ed infine i sierotipi unrestricted come S. Typhimurium sono in grado di infettare sia l uomo che animali di diversa specie. Le salmonelle possono causare forme morbose di gravità estremamente variabile a seconda del sierotipo ma anche della dose infettante, delle modalità di infezione e delle caratteristiche intrinseche all ospite (età, specie, stato immunitario, etc.) (Hoelzer K. et al., 2011 ;Uzzau S. et al., 2000). Le salmonelle non adattate all'ospite rivestono un ampio interesse perché sono le principali cause di tossinfezione alimentare nell uomo e più frequentemente colonizzano l intestino degli animali senza determinare forme morbose associate a sintomatologia clinica. Il processo di patogenesi dell'infezione da salmonelle si presenta come un fenomeno complesso che si articola in una serie di fasi di seguito illustrate. Una volta ingerite le cellule batteriche devono: - essere in grado di superare la barriera gastrica grazie a sistemi di difesa che ne permettono la sopravvivenza in ambienti a ph acido; 7

11 - aderire alle cellule del lume intestinale (mediante fimbrie di tipo 1 e 3); - attraversare l'epitelio intestinale e sopravvivere all'interno dei macrofagi (enzimi PhoP e PhoQ) (Wallis T.S. & Galyov E.E., 2000). L'azione patogena di Salmonella è correlata al suo corredo genetico. Infatti, solo i ceppi che possiedono determinati geni sono in grado di indurre malattia, mentre quelli che ne sono privi non sembrano essere patogeni. Attualmente si conoscono sette principali regioni genomiche, note come Salmonella Pathogenicity Islands (SPI), SPI1 è essenziale per l'invasione della mucosa intestinale, mentre SPI2 influenza la virulenza sistemica, favorendo la crescita intracellulare e la sopravvivenza di Salmonella all'interno dei macrofagi. Inoltre a livello plasmidico è stata osservata una regione chiamata spv (Salmonella plasmid virulence) i cui geni sembrano promuovere la fase macrofagica della malattia, evitando la distruzione del batterio da parte dei neutrofili e facilitando la proliferazione delle cellule in siti extraintestinali (Wallis T.S. & Galyov E.E., 2000) Salmonellosi nell uomo Secondo il report EFSA, nel 2010 il numero di casi umani di salmonellosi di origine alimentare (non tifoidea) a livello europeo è stato pari a casi confermati, l'8.8% in meno rispetto al Inoltre Salmonella spp. è stato l'agente causale del 48.9% dei 698 focolai di malattia alimentare riportati in UE nel 2010 (dati riferibili agli strong evidence outbreaks), rendendosi responsabile di 5212 casi umani, di cui 994 ospedalizzazioni e 9 decessi. Considerando il numero di casi per classi d'età, nei neonati e bambini di età compresa tra 0 e 4 anni si registra il numero più elevato (112.7 casi ogni abitanti) e il picco di casi riportati in tutte le classi d'età si verifica nei mesi di agosto e settembre con un rapido declino nei mesi invernali, avvalorando l'ipotesi che la temperatura esterna eserciti un'influenza sulla moltiplicazione del microrganismo nei cibi e nell'ambiente (EFSA, 2010). La salmonellosi umana è storicamente più frequentemente associata a due sierotipi: SE e ST; l'infezione da SE, essendo un sierotipo fortemente adattato alle specie avicole, è correlata al consumo di uova o di ovoprodotti e al consumo di carne di pollo mentre quella da ST è legata al consumo di diverse tipologie di alimenti, data l ubiquità di questo sierotipo (EFSA, 2010). Inoltre la capacità delle salmonelle di moltiplicare a temperature comprese fra 7 C e 46 C fa sì che qualsiasi alimento manipolato o conservato in modo non corretto possa essere fonte d'infezione (Kovats R. S. et al., 2004). Una fase critica del processo di produzione degli alimenti di origine animale è rappresentata senz'altro dalla macellazione, nella quale si può verificare più facilmente contaminazione fecale 8

12 delle carcasse. Nel caso delle uova invece, la contaminazione può avvenire nell'ovaio per trasmissione verticale (solo per alcuni sierotipi), oppure per contaminazione con materiale fecale nella cloaca o successivamente alla deposizione (trasmissione orizzontale). In caso di trasmissione orizzontale le salmonelle si trovano sulla superficie del guscio e possono penetrare nell uovo in seguito a microlesioni del guscio stesso o attraverso i pori che permettono gli scambi gassosi fra l esterno e l interno. La maggior parte dei casi di tossinfezione alimentare da SE è dovuta più frequentemente al consumo di prodotti a base d uovo che non hanno subito alcun trattamento termico (maionese e dolci preparati con uova crude) e non conservati in maniera corretta, permettendo così ai microrganismi presenti di moltiplicare e raggiungere una dose sufficiente a dare infezione/malattia, se ingerita (Bibek R., 2004; Greig J.D. & Ravel A., 2009). Le tossinfezioni alimentari da Salmonella di solito presentano un periodo d'incubazione dalle 12 alle 36 ore, successivamente alle quali compaiono sintomi quali febbre, crampi addominali, diarrea, nausea e talvolta vomito. La sintomatologia regredisce di solito nell'arco di 2-4 giorni e nella maggior parte dei casi la guarigione è completa, ma il soggetto può rimanere portatore e continuare ad eliminare i batteri per svariati mesi attraverso le feci (Bibek R., 2004; EFSA, 2010). In altri pazienti invece quali anziani, bambini e immunodepressi, l'infezione può essere grave e dare origine ad una forma sistemica con coinvolgimento di sedi extraintestinali come sistema nervoso centrale, polmoni, ossa ed articolazioni, mettendo il soggetto in pericolo di vita. Ad ogni modo, raramente l'infezione comporta gravi conseguenze che richiedono l'ospedalizzazione del soggetto e meno dell'1% dei casi riportati di salmonellosi sono risultati fatali (EFSA, 2010). Le salmonellosi rappresentano un importante problema di sanità pubblica a causa delle conseguenze sanitarie, economiche e d'impatto sulla fiducia dei consumatori. Dal punto di vista sanitario la gastroenterite causata da Salmonella spp., sebbene di durata limitata, comporta un notevole disagio e malessere nei soggetti colpiti; considerando l'aspetto economico, si hanno delle perdite economiche stimabili sia per i soggetti colpiti che per il Servizio Sanitario Nazionale (SSN); inoltre non è da trascurare l impatto sulle imprese che producono, commercializzano e somministrano alimenti che possono essere identificate come la fonte dei casi umani. Nondimeno gli episodi di tossinfezione alimentare, in generale, determinano nel consumatore la percezione degli alimenti come rischiosi e una perdita di fiducia nelle Autorità preposte al controllo degli alimenti. Studi che stimano l entità dell impatto economico delle salmonellosi sono stati pubblicati da diversi autori. L unico studio italiano, ad oggi disponibile è stato pubblicato da Lopalco et al. (2000) dal quale si evince che il costo medio per paziente è stimato intorno ai 500 9

13 euro. Un recente studio inoltre stima i costi per gli episodi di salmonellosi nei paesi europei pari a 600 milioni di euro l anno (FCC Consortium, 2010). Un altro importante aspetto di sanità pubblica legato alle salmonellosi è la diffusa presenza del fenomeno dell'antibiotico-resistenza e della multi-resistenza tra i ceppi di Salmonella spp. isolati sia dall'uomo che di origine animale (EnterVet Report 2010; EnterNet: rapporto ). Lo sviluppo dell antibiotico-resistenza è imputabile all uso improprio e/o all abuso di antibiotici sia in medicina umana, che in medicina veterinaria. Per quel che riguarda il settore veterinario, l'impiego dei trattamenti di massa per la terapia e la profilassi delle infezioni batteriche in allevamento oltre che l utilizzo degli antibiotici quali promotori di crescita, bandito nel 2006, ha favorito la selezione di ceppi resistenti sia alla molecola impiegata che verso quelle strutturalmente simili (McEwen S.A. & Fedorka-Cray P.J., 2002; Randall L.P., 2004). Negli ultimi anni, si è purtroppo registrato un numero crescente di fallimenti di trattamenti terapeutici nell uomo come conseguenza dello sviluppo e diffusione di questo fenomeno; di conseguenza anche malattie comunemente banali, come una salmonellosi, possono esitare in gravi conseguenze per i pazienti proprio in mancanza di strumenti terapeutici efficaci (TATFAR, 2011) Salmonellosi negli avicoli Nell'infezione dei volatili sono coinvolti sia sierotipi ospite specifici quali S. Pullorum e S. Gallinarum, le uniche specie immobili del genere Salmonella, che sierotipi non adattati all'ospite quali ST e SE, agenti delle cosiddette paratifosi. S. Pullorum e S. Gallinarum provocano gravi forme sistemiche nel pollame con pesanti perdite sanitarie ed economiche. Ad oggi, nei Paesi industrializzati, grazie a misure di profilassi diretta ed indiretta queste malattie sono sotto controllo (Anderson A. A. et al., 2006; Barrow P. A. & Neto O. C. Freitas, 2011; Berchieri Jr A. et al., 2001). I sierotipi non adattati all'ospite possono provocare infezione con manifestazione clinica principalmente nei soggetti giovani, con mortalità nelle prime due settimane di vita. I pulcini o i tacchinotti con paratifosi presentano sonnolenza, tremori, diarrea acquosa, disidratazione e, occasionalmente, cecità e zoppia. Nel soggetto adulto invece solitamente si ha solo colonizzazione intestinale e sono rare le forme sistemiche, spesso non si manifesta alcuna sintomatologia ad eccezione di lievi episodi diarroici (Hoelzer K. et al., 2011). La forma asintomatica e cronica che può colpire i soggetti adulti trova la sua origine nell'infezione del pulcino per via verticale (dai riproduttori alla progenie) o da trasmissione orizzontale, più frequentemente da animali infetti/eliminatori o anche attraverso alimenti/ambiente contaminati. 10

14 L'applicazione delle misure di profilassi diretta ed indiretta rappresenta un valido strumento di controllo delle infezioni da Salmonella spp. in un allevamento. Tra le azioni di profilassi diretta, le misure di biosicurezza, quali l'adozione di disinfezioni periodiche, della pratica del tutto pieno-tutto vuoto con pulizia dei locali destinati agli animali, la possibilità di separare i gruppi, limitano efficacemente la diffusione delle salmonelle in allevamento (Massi P., 2009). Per quanto riguarda la somministrazione di antibiotici, il loro utilizzo quale misura di profilassi diretta per le salmonellosi oltre che non risolutivo, è vietato dalla legislazione comunitaria (Regolamento CE 1177/2006) a seguito del problema dell antibiotico-resistenza (McEwen S.A. & Fedorka-Cray P.J., 2002; Singer R. S. & Hofacre C. L., 2006). Infine alle misure di profilassi diretta possono essere associate misure di profilassi indiretta quali la vaccinazione degli animali. Scopo della vaccinazione è quello di diminuire la suscettibilità degli animali all'infezione, con conseguente riduzione della diffusione ed eliminazione del microrganismo e dei livelli di infezione in allevamento (EFSA Opinion, 2004). 11

15 CAPITOLO 2. IL CONTROLLO DELLE ZOONOSI 2.1 Aspetti normativi di carattere generale In seguito alla grave crisi del settore alimentare verificatasi alla fine degli anni 90 con gli episodi "BSE" e "diossina", che hanno comportato gravi conseguenze in termini sanitari oltre che la perdita di fiducia da parte dei consumatori e ingenti perdite economiche, l'unione Europea (UE) ha modificato la politica fino ad allora adottata in materia di sicurezza degli alimenti, al fine di garantire un elevato grado di protezione e tutela della salute umana e del consumatore. Poiché tra le malattie trasmesse da alimenti le tossinfezioni alimentari, ed in particolare quelle sostenute da Salmonella, negli anni a cavallo tra il primo ed il secondo millennio, erano quelle più frequentemente responsabili di episodi nell uomo, misure in primis sono state prese in questa direzione, attraverso specifici atti normativi mirati sia ad un'efficace sorveglianza che al controllo di questo agente di zoonosi. I principi che hanno ispirato la nuova politica europea di sicurezza alimentare sono espressi nel Libro Bianco sulla Sicurezza Alimentare pubblicato nel 2000, dove si afferma che per la Commissione Europea è priorità strategica fondamentale..assicurare che l'ue disponga degli standard più elevati possibili di sicurezza alimentare. La nuova politica di sicurezza alimentare trova una prima applicazione con il Regolamento CE n. 178/2002 che stabilisce i principi e i requisiti generali della legislazione alimentare, istituisce l Autorità Europea per la sicurezza alimentare (EFSA) e fissa procedure nel campo della sicurezza alimentare. Secondo tale Regolamento, la legislazione alimentare e la gestione dei rischi devono basarsi sull'analisi del rischio, che deve considerare gli elementi scientifici a disposizione e deve essere svolta in modo indipendente, obiettivo e trasparente. Viene affermato che la catena alimentare (dalla produzione primaria alla vendita/somministrazione degli alimenti al consumatore) è un processo integrato in cui ciascun componente contribuisce alla sicurezza degli alimenti. In tutte le fasi del processo produttivo la responsabilità primaria della sicurezza alimentare viene attribuita agli OSA (Operatori del Settore Alimentare), mentre all Autorità Competente spettano funzioni di controllo e sorveglianza. Nel 2002, in accordo con quanto previsto dal Reg. CE 178/2002, è stata istituita l'efsa (European Food Safety Authority) con sede a Parma, il cui ruolo è di valutare in maniera indipendente e comunicare i rischi associati alla catena alimentare, in risposta a richieste specifiche di consulenza scientifica. L'EFSA inoltre ha come obiettivo quello di fornire comunicazioni adeguate, coerenti, 12

16 accurate e puntuali su questioni di sicurezza alimentare a tutte le parti interessate e al pubblico in generale, sulla base delle valutazioni del rischio effettuate dall Autorità stessa. Inoltre sono stati pubblicati direttive e regolamenti volti alla sorveglianza e al controllo delle zoonosi a trasmissione alimentare; in particolare, si evidenziano la Direttiva 2003/99/CE del 17 novembre 2003 sulle misure di sorveglianza delle zoonosi e degli agenti zoonotici e il Regolamento CE n. 2160/2003 del 17 novembre 2003 sul controllo della salmonella e di altri agenti zoonotici specifici presenti negli alimenti. La Direttiva 2003/99/CE, recepita in Italia con il Decreto Legislativo 191/2006, ha come scopo "quello di garantire una adeguata sorveglianza delle zoonosi, degli agenti zoonotici e della resistenza agli antimicrobici ad essi correlata e un'adeguata indagine epidemiologica dei focolai di tossinfezione alimentare, per consentire di raccogliere le informazioni necessarie ad una valutazione delle relative tendenze e fonti". Le zoonosi e gli agenti zoonotici per i quali esiste obbligo di sorveglianza sono: Brucellosi, Campilobatteriosi, Echinococcosi, Listeriosi, Salmonellosi, Trichinellosi, Tubercolosi da Mycobacterium bovis, Escherichia coli VTEC (Allegato I, punto A della Direttiva 2003/99/CE). Entro la fine del mese di maggio di ogni anno, il Ministero della Salute trasmette alla Commissione Europea una relazione sui dati raccolti; a sua volta, la Commissione invia le relazioni all'efsa, che le esamina e pubblica una relazione di sintesi sulle tendenze e le fonti delle zoonosi, degli agenti zoonotici e della resistenza agli antimicrobici nell'unione Europea. Scopo del Regolamento CE n. 2160/2003 è garantire che siano adottate misure efficaci di individuazione e controllo della salmonella e di altri agenti zoonotici nelle fasi di produzione, trattamento e distribuzione, principalmente a livello di produzione primaria, in modo da ridurre la prevalenza e il pericolo per la sanità pubblica. E' chiaro che la strategia per poter ridurre la salmonellosi umana non può prescindere da una riduzione delle prevalenze a livello di allevamento. Il Regolamento perciò stabilisce la necessità che gli Stati Membri applichino misure armonizzate di controllo finalizzate a ridurre la prevalenza dei sierotipi di Salmonella rilevanti per la sanità pubblica in diverse specie e categorie produttive; stabilisce, inoltre, i tempi e i modi per la definizione degli obiettivi di riduzione e per l attuazione dei piani di controllo (Allegato 1 del Reg. CE n. 2160/2003). Con l obiettivo di disporre di dati confrontabili di prevalenza tra i vari Paesi Membri, a partire dal 2004 sono stati svolti a livello comunitario degli studi, di durata annuale, mirati a definire la prevalenza di Salmonella spp. nelle seguenti specie animali e categorie produttive: galline ovaiole, 13

17 polli da carne della specie Gallus gallus, tacchini, sia da ingrasso che da riproduzione, suini da ingrasso e suini riproduttori. 2.2 Piani di controllo delle salmonelle ai sensi del Regolamento CE 2160/2003 Secondo il Reg. CE 2160/2003, sulla base dei risultati dei baseline studies e dei dati epidemiologici già disponibili, sono stati definiti gli obiettivi di riduzione della prevalenza dei sierotipi di Salmonella rilevanti per la salute pubblica per tutte le seguenti categorie produttive: riproduttori Gallus gallus, galline ovaiole, polli da carne, tacchini, sia da ingrasso che da riproduzione. La decisione di applicare i Piani a queste categorie produttive è dettata dal fatto che esse rappresentano le principali specie animali i cui prodotti alimentari costituiscono un'importante fonte di tossinfezione alimentare da Salmonella spp. nell'uomo. Ad oggi i sierotipi considerati rilevanti per la salute pubblica sono: S. Enteritidis (SE), S. Typhimurium (ST) (compresa la variante monofasica), S. Infantis, S. Hadar e S. Virchow nei riproduttori Gallus gallus e S. Enteritidis e S. Typhimurium (compresa la variante monofasica) per le altre categorie produttive avicole. Per obiettivo di riduzione s intende la percentuale massima di unità epidemiologiche positive; il Regolamento indica inoltre modi e tempi per il conseguimento dell'obiettivo. Ogni Stato Membro elabora il proprio piano di controllo, lo presenta alla Commissione per essere approvato e successivamente lo applica. Sul territorio nazionale sono stati attivati i seguenti piani di controllo: a partire da gennaio 2007 è entrato in vigore il piano di controllo nei riproduttori della specie Gallus gallus, nel 2008 si è proseguito con l'estensione dei piani alle galline ovaiole e a seguire nel 2009 ai polli da ingrasso della specie Gallus gallus e nel 2010 ai tacchini da riproduzione e da ingrasso. I piani di controlli attivi sul territorio nazionale prevedono alcuni aspetti trasversali e alcuni aspetti specifici. Tra gli aspetti trasversali si evidenziano: l applicazione di un piano di campionamento sia in autocontrollo che sotto forma di controlli ufficiali e l applicazione di misure sanitarie mirate ad evitare la diffusione di sierotipi rilevanti e a tutelare la salute pubblica. 2.3 Piano nazionale per il controllo di Salmonella nelle galline ovaiole della specie Gallus gallus Il Regolamento che fissa gli obiettivi definitivi di riduzione della prevalenza di SE e ST (compresa la variante monofasica) nelle galline ovaiole è il Regolamento CE 517/2011. Secondo tale Regolamento, vista l'eterogeneità a livello comunitario della prevalenza dei sierotipi rilevanti, 14

18 l'obiettivo di riduzione è modulabile sulla base della situazione di partenza di ciascun Stato Membro. Di conseguenza, è stato stabilito che la percentuale minima annua di riduzione dei gruppi positivi per i sierotipi rilevanti sia pari almeno a: - 10% se la prevalenza nell anno precedente era inferiore al 10%; - 20% se la prevalenza nell anno precedente era tra il 10 e il 19%; - 30% se la prevalenza nell anno precedente era tra il 20 e il 39%; - 40% se la prevalenza nell anno precedente era uguale o superiore al 40%; Per quanto riguarda l Italia, è stato fissato quale obiettivo, una percentuale minima annua di riduzione dei gruppi positivi del 10%. Da gennaio 2008 è entrato in vigore il piano nazionale di controllo: ad oggi l'applicazione dei piani nazionali ha permesso di ridurre la prevalenza di SE e ST nelle ovaiole dall'8% (dati baseline study 2004) al 3,3% (dati riferiti al 2011). Il piano di controllo prevede l'applicazione di un piano di campionamento sia in autocontrollo che da parte dei Servizi Veterinari (campioni ufficiali). Per ciò che riguarda il prelievo di campioni sia ufficiali che in autocontrollo, il piano descrive in maniera dettagliata la frequenza e la tipologia dei campionamenti, il protocollo di campionamento, il metodo da seguire per l'esame dei campioni e la modalità di trasmissione dei risultati. In caso di positività a SE/ST, devono essere messe in atto le seguenti misure sanitarie: 1) gli animali risultati positivi vanno posti sotto vincolo sanitario, abbattuti e distrutti o, in alternativa destinati alla macellazione mettendo in atto misure finalizzate ad evitare il rischio di diffusione di salmonelle; 2) le uova non possono essere commercializzate come uova da tavola e di conseguenza devono essere distrutte o destinate alla pastorizzazione. Inoltre i gruppi di ovaiole che producono uova destinate alla pastorizzazione e risultati positivi, possono essere macellati a fine ciclo (Reg. CE 1237/2007); 3) i Servizi Veterinari devono avviare un'indagine epidemiologica finalizzata ad identificare la fonte d'infezione e mettere in atto misure correttive; 4) i capannoni presso i quali erano stabulati gli animali positivi devono essere sottoposti ad un accurata disinfezione e disinfestazione, eseguite sotto controllo ufficiale. L avvenuta decontaminazione deve essere confermata da un controllo microbiologico ambientale, con almeno 5 tamponi ambientali (spugnette), da effettuarsi almeno 10 giorni prima dell immissione dei nuovi gruppi; 15

19 6) i capannoni presso i quali erano presenti animali positivi per i sierotipi rilevanti devono essere ripopolati con animali vaccinati nei confronti del sierotipo di Salmonella isolato. 16

20 CAPITOLO 3. PULIZIA E DISINFEZIONE COME MISURA DI CONTROLLO DELLA SALMONELLA NEGLI ALLEVAMENTI AVICOLI 3.1 Importanza di pulizia e disinfezione come misura di profilassi diretta Le procedure di pulizia e disinfezione fanno parte integrante delle misure di biosicurezza adottate in un allevamento. Le misure di biosicurezza si compongano di due momenti temporali: le misure da applicare in un continuum ed in presenza degli animali e le misure adottate durante il vuoto sanitario. Delle prime fanno parte i requisiti di costruzione dei locali e delle attrezzature, l'igiene del personale e la registrazione del personale in entrata e in uscita, il controllo e la disinfezione degli automezzi in entrata e uscita, la gestione degli animali morti e della pollina, la derattizzazione e disinfestazione, mentre le seconde sono costituite dalle procedure di pulizia e disinfezione delle strutture ed attrezzature di un allevamento a fine ciclo. La normativa nazionale (Decreto Legislativo n. 9 del 25 gennaio 2010 e Ordinanza Ministero della Salute 26 agosto 2005) fornisce alcune indicazioni riguardanti le norme di biosicurezza a cui gli allevamenti devono ottemperare, tra cui i requisiti strutturali, le norme di conduzione, la gestione degli animali morti e della pollina. Riguardo alla pulizia e disinfezione la suddetta normativa indica i tempi di vuoto biologico e sanitario da rispettare per diverse categorie produttive di avicoli e specifica che "alla fine di ogni ciclo produttivo e prima dell inizio del successivo, i locali e le attrezzature devono essere accuratamente sottoposti a pulizia e disinfezione". Inoltre in accordo a quanto previsto dai piani di controllo salmonella, i capannoni che hanno ospitato animali positivi per sierotipi rilevanti devono essere sottoposti ad un accurata disinfezione e disinfestazione sotto controllo ufficiale e i tamponi ambientali prelevati al termine delle operazioni di pulizia e disinfezione, prima del riaccasamento di nuovi gruppi, devono risultare negativi a Salmonella spp. Le attività di pulizia e disinfezione di un allevamento unitamente al rispetto dei tempi di vuoto biologico e sanitario rappresentano strumenti fondamentali per impedire il permanere e il diffondersi di agenti patogeni tra allevamenti e tra animali appartenenti a cicli successivi. Scopo delle consequenziali operazioni di pulizia, lavaggio, detergenza, risciacquo e disinfezione è quello di rimuovere o ridurre la carica dell'agente patogeno (batteri, virus, funghi parassiti) dall'ambiente. Associare tali attività alla pratica del tutto pieno-tutto vuoto consente di ridurre notevolmente i tempi di sopravvivenza della maggior parte degli agenti infettivi (Alborali G.L., 2009). Ad oggi non esistono indicazioni specifiche sulle modalità di pulizia e disinfezione da adottare in seguito al riscontro di Salmonella in allevamento, e la normativa esistente fornisce informazioni di 17

21 carattere generale. Secondo l art.1 del Decreto Ministeriale 274/1997 infatti si definiscono: a) attività di pulizia quelle che riguardano il complesso di procedimenti e operazioni atti a rimuovere polveri, materiale non desiderato o sporcizia da superfici, oggetti, ambienti confinati ed aree di pertinenza; b) attività di disinfezione, il complesso dei procedimenti e operazioni atti a rendere sani determinati ambienti confinati e aree di pertinenza mediante la distruzione o inattivazione di microrganismi patogeni; c) attività di disinfestazione, il complesso di procedimenti e operazioni atti a distruggere piccoli animali, in particolare artropodi, sia perché parassiti, vettori o riserve di agenti infettivi sia perché molesti e specie vegetali non desiderate. La disinfestazione può essere integrale se rivolta a tutte le specie infestanti ovvero mirata se rivolta a singola specie; d) attività di derattizzazione, il complesso di procedimenti e operazioni di disinfestazione atti a determinare o la distruzione completa oppure la riduzione del numero della popolazione dei ratti o dei topi al di sotto di una certa soglia; e) attività di sanificazione, il complesso di procedimenti e operazioni atti a rendere sani determinati ambienti mediante l'attività di pulizia e/o di disinfezione e/o di disinfestazione ovvero mediante il controllo e il miglioramento delle condizioni del microclima per quanto riguarda la temperatura, l'umidità e la ventilazione ovvero per quanto riguarda l'illuminazione e il rumore. Non sono al momento disponibili informazioni che specifichino gli aspetti tecnici e le modalità di applicazione delle procedure di pulizia e disinfezione, che possono variare a seconda della tipologia di allevamento, delle attrezzature e del personale a disposizione. Se da una parte tale situazione lascia all'allevatore un ampio margine di autonomia nella scelta e nella gestione di tali operazioni, dall'altra parte comporta la possibile presenza di numerose di modalità di pulizia e disinfezione molto diversificate tra loro e di efficacia variabile. La permanenza di Salmonella negli allevamenti di ovaiole è un fenomeno non di rara frequenza: sudi condotti in diversi paesi europei (Carrique-Mas J.J. et al., 2009; Davies R. & Breslin M., 2003; Wales A. et al., 2006) hanno mostrato come la presenza di recidiva per S. Enteritidis (SE) tra animali appartenenti a cicli successivi sia solitamente associata ad un basso livello di pulizia e disinfezione degli stabilimenti. Inoltre, in uno studio svolto in Italia è stato segnalato un episodio di recidiva di SE, ovvero sono state registrate ripetute positività al medesimo ceppo di SE nel corso dei controlli ufficiali e dei tamponi ambientali eseguiti dopo le operazioni di pulizia e disinfezione in un allevamento di galline ovaiole in provincia di Gorizia nel periodo (Busdon P. & Rossetti P., 2010). 18

22 Anche dati del Centro di Referenza Nazionale Salmonellosi (CRNS) confermano che l eliminazione di Salmonella dagli allevamenti è una operazione che non sempre esita in un successo. Numerosi fattori contribuiscono all efficacia di pulizia e disinfezione quali: la corretta applicazione delle differenti fasi e i tempi dedicati a tali operazioni, la tipologia di attrezzature impiegate e la modalità d'uso, i prodotti detergenti e disinfettati applicati, il loro volume d'applicazione e diluizione d'uso ed il personale a disposizione inteso sia in termini di numero che di professionalità posseduta (Beghian M.A., 2011). 3.2 Le procedure di pulizia e disinfezione di strutture e attrezzature in allevamenti di galline ovaiole: informazioni dalla letteratura In letteratura si possono trovare diversi studi europei che indagano le procedure di pulizia e disinfezione applicate, quale fattore causale di persistenza di SE negli allevamenti avicoli tra un ciclo ed il successivo. I risultati di questi studi propendono nell'indicare che l'inefficacia di tali operazioni è legata ai seguenti fattori: la tipologia di allevamento e i materiali di costruzione impiegati, la formazione degli allevatori in materia, l'applicazione di un'efficace procedura di pulizia, la scelta e l'utilizzo dei disinfettanti. L'intrinseca complessità delle strutture impiegate per l'allevamento delle galline ovaiole, difficilmente accessibili in termini di pulizia, la cospicua quantità di sostanza organica che vi si accumula, l'impiego di materiali di costruzione difficili da pulire (materiali porosi quali cemento, legno) e la presenza di strutture in cattive condizioni di mantenimento (crepe, fessure) sono identificati da diversi autori come fattori critici, che rendono necessario operare una serie di scelte mirate in termini di equipaggiamento, disinfettante applicato e tempo dedicato per ottenere un risultato efficace (Carrique-Mas J.J. et al., 2009; Davies R. & Breslin M., 2003; Marin C. et al., 2009). Inoltre la mancanza di conoscenza degli operatori, in particolare rispetto all appropriata concentrazione d'uso dei disinfettanti è stata identificata come un altro punto critico (Carrique- Mas J.J. et al., 2009; Davies R. & Breslin M., 2003). Per quel che riguarda le procedure di pulizia, in letteratura numerosi sono i fattori critici identificati come associati a questa fase: innanzitutto le strutture e attrezzature di un allevamento possono presentare punti più contaminati di altri, che quindi richiedono una maggiore attenzione nella pulizia, quali: il pavimento, il nastro raccolta pollina, i raschiatoi, gli abbeveratoi, le mangiatoie, i nidi. Inoltre rispetto alle due possibili tipologie di pulizia, la pulizia a secco e la pulizia con impiego di acqua, sono stati evidenziati per entrambi i metodi sia vantaggi che svantaggi: il 19

23 lavaggio se non correttamente eseguito può contribuire a disseminare Salmonella nell'ambiente mentre una pulizia a secco non adeguatamente applicata può esitare in un'eccessiva presenza di sostanza organica residua (Carrique-Mas J.J. et al., 2009; Wales A. et al., 2006). Per quel che riguarda la disinfezione, la scelta e le modalità d impiego del disinfettante rappresentano un ulteriore punto critico. Numerosi infatti sono i fattori che sono stati identificati condizionare l'efficacia di un disinfettante, tra cui: la scelta del principio attivo, che dipende dalla quantità di sostanza organica residua e dai materiali delle superfici da trattare; la temperatura ambientale, dato che la maggior parte dei disinfettanti agisce meglio in presenza di temperature di circa C; la durezza dell'acqua poiché l'efficacia di molti disinfettanti viene ridotta in presenza di acqua ricca di sali minerali; l'applicazione della corretta concentrazione d'uso ed infine la modalità d'applicazione del disinfettante (Berchieri Jr A. & Barrow P.A., 1996; Bessem Eugenè, 1998; Carrique Mas J.J. et al., 2009; Davies R. & Breslin M., 2003; McLaren I. et al., 2010). Infine, studi evidenziano che circa il 50% dei ceppi di Salmonella isolati in campo sono in grado di produrre biofilm, sul quale i disinfettanti riescono ad agire con minor efficacia. Inoltre l'esposizione ripetuta nel corso del tempo dei microrganismi ai disinfettanti impiegati in concentrazioni subefficaci è in grado di selezionare ceppi resistenti ai biocidi (Marin C. et al., 2009; Randall L.P. et al., 2007; Whitehead R.N. et al., 2011). In conclusione, gli studi ad oggi condotti mostrano come le operazioni di pulizia e disinfezione siano un processo complesso, la cui efficacia è influenzata da numerosi fattori critici. Ciò richiede di essere in grado di adottare scelte adeguate, nell'ambito delle procedure da applicare come gli strumenti, i principi attivi e il personale necessari. Inoltre, un altro aspetto da non trascurare, al fine di non vanificare le operazioni di pulizia e disinfezione è l'adozione di tutte quelle misure di biosicurezza volte ad evitare la ricontaminazione degli ambienti (Carrique-Mas J.J. et al., 2009; Davies R. & Breslin M., 2003). 20