EFFECT OF CHRONIC TREATMENT WITH THREE VARIETIES OF LEPIDIUM MEYENII (MACA) ON REPRODUCTIVE PARAMETERS AND DNA QUANTIFICATION IN ADULT MALE RATS.

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3 INDICE CREAFERTI: IL PREPARARTO PER LA COPPIA INFERTILE E/O CHE SI ACCINGE A CONCEPIRE UN FIGLIO. CARATTERISTICHE FISIOLOGICHE DEI PRINCIPI ATTIVI NEL CREAFERTI LEPIDIUM MEYENII: COMPOSIZIONE E PROPRIETA SELENIO E FUNZIONE RIPRODUTTIVA MASCHILE EFFECT OF CHRONIC TREATMENT WITH THREE VARIETIES OF LEPIDIUM MEYENII (MACA) ON REPRODUCTIVE PARAMETERS AND DNA QUANTIFICATION IN ADULT MALE RATS. EFFECT OF LEPIDIUM MEYENII ON SEXUAL DESIRE AND ITS ABSENT RELATIONSHIP WITH SERUM TESTOSTERONE LEVELS IN ADULT HEALTHY MAN EFFECT OF LIPIDIC EXTRACT FROM LEPIDIUM MEYENII ON SEXUAL BEHAVIOR IN MICE AND RATS LEPIDIUM MEYENII WALP. IMPROVES SEXUAL BEHAVIOUR IN MALE RATS INDEPENDENTLY FROM ITS ACTION ON SPONTANEOUS LOCOMOTOR ACTIVITY. EFFECTOF LEPIDIUM MEYENII ROOTS ON SPERMATOGENESIS AF MALE RATS EFFECT OF MACA IN ENDOCRINE GLANDS LEPIDIUM MEYENII (MACA) IMPROVED SEMEN PARAMETERS IN ADULT MEN TRATTAMENTO FITOTERAPICO DELLA STERILITÀ DI COPPIA IDIOPATICA. STUDIO CLINICO OSSERVAZIONALE. ATTI DELLA SOCIETA ITALIANA DI GINECOLOGIA E OSTETRICIA VOL. LXXXIV. GYNECOAGOI SPECIALE CONGRESSO. FERTILITA FEMMINILE ED INQUINAMENTO AMBENTALE. FUMO E DANNO FOLLICOLARE. XXV CONGRESSO NAZIONALE SIA 2009 AMBIENTE, SESSUALITA E RIPRODUZIONE: L INQUINAMENTO AMBIENTALE E IL VELENO DELL AMORE. DISPERMIE E VARICOCELE. OXYGEN UPTAKE BY MITOCHONDRIA IN DEMEMBRANATED HUMAN SPERMATOZOA; A RELIABLE TOOL FOR THE EVALUATION PF SPERM RESPIRATORY EFFICIECY LO STRESS OSSIDATIVO NEL LIQUIDO SEMINALE. RUOLO DELLO STRESS OSSIDATIVO NELLA RIDUZIONE DEL POTENZIALE RIPRODUTTIVO ETA DIPENDENTE. BIBLIOGRAFIA GENERALE.

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7 CARATTERISTICHE DEI PRINCIPI ATTIVI NEL CREAFERTI MAN RUOLO FISIOLOGICO del MAKAVIT TM Attiva e Regolarizza la produzione ormonale (asse ipotalamo ipofisi- ovaio) Aumenta i livelli di energia fisica, mentale e sessuale. Stimola la produzione e maturazione degli spermatozoi RUOLO FISIOLOGICO della Vitamina E Previene i processi di ossidazione dei Radicali Liberi. Ritarda l invecchiamento cellulare Coopera contro l infertilità Migliora il rendimento sessuale RUOLO FISIOLOGICO del Manganese (MN) Presenta una forte azione antiossidante Agisce come attivatore di molti enzimi Contribuisce a mantenere costante la produzione degli ormoni sessuali RUOLO FISIOLOGICO del Selenio (SE) Presenta una forte azione antiossidante Svolge un azione strettamente collegata alla Vit E Ritarda l invecchiamento cellulare Aumenta la fertilità RUOLO FISIOLOGICO della Vitamina C O acido ascorbico. Il ruolo piu significativo della vitamina c è quello che la vede protagonista nei processi di riduzione che contrastano i danni legati ai fenomeni ossidativi.nei fluidi extracellulari (liquido seminale) agli antiossidanti piu importanti vitamina c e vit. e,le quali agiscono in sinergia tra loro.la vitamina c è oltretutto responsabile della rigenerazione della vitamina e,ossidata nell'organismo e ne potenzia le proprieta antiossidanti. RUOLO FISIOLOGICO dello Zinco (ZN) Presenta una forte azione antiossidante Ritarda l invecchiamento cellulare Neutralizza gli effetti delle radiazioni ionizzanti Favorisce la sintesi di RNA-DNA Molti studi dimostrano che la carenza di zinco influisce negativamente sulla fertilita sia maschile che femminile,lo zinco infatti ha un ruolo fondamentale per la produzione di spermatozoi e di testosterone nell'uomo e nell'ovulazione nella donna RUOLO FISIOLOGICO DELL' L-arginina alfachetoglutarato: L arginina oltre ad essere un aminoacido essenziale nello sviluppo,è presente in elevata concentrazione nei nuclei delle cellule in via di riproduzione e raggiunge circa il 50% nel nucleo degli spermatozoi. Per questo l arginina è stata proposta anche come coadiuvante nella terapia delle dispermie.recenti scoperte sulle importanti azioni biologiche del nitrossido,in cui l arginina è il precursore,hanno portato a definire questo aminoacido essenziale qualora ci fosse sia una maggiore necessita di nitrossido per le varie funzioni biologiche. In particolare sembra che il nitrossido sia neurotrasmettitore di alcune fibre,la cui stimolazione a livello del tessuto cavernoso del pene o dei muscoli ano-coccigei provoca l'erezione. Nel tempo l'uso di l-arginina può ristabilire la funzione in soggetti impotenti,nei soggetti non impotenti,le prestazioni possono essere aumentate significativamente.

8 CARATTERISTICHE DEI PRINCIPI ATTIVI NEL CREAFERTI LADY RUOLO FISIOLOGICO del MAKAVIT TM Rende efficace la maturazione dei follicoli Regolarizza l ovulazione Prepara l endometrio per l annidamento dell embrione Attiva e Regolarizza la produzione ormonale (asse ipotalamo ipofisi- ovaio) RUOLO FISIOLOGICO del Manganese (MN) Presenta una forte azione antiossidante Agisce come attivatore di molti enzimi Contribuisce a mantenere costante la produzione degli ormoni sessuali RUOLO FISIOLOGICO della Vitamina C O acido ascorbico. Vitamina idrosolubile.e' ampiamente distribuita nel mondo vegetale. Contenuta in frutta e verdura, frattaglie (fegato e reni). Pochissimo contenuta in latte e carne. Il livello di acido ascorbico nel sangue raggiunge la punta massima due o tre ore dopo l ingestione di una quantità media, per poi diminuire quando inizia l eliminazione attraverso le urine e la sudorazione. La maggior parte della vitamina C viene eliminata dal corpo in tre o quattro ore, ecco perché essa deve essere assunta diverse volte al giorno. E' una vitamina estremamente labile, e viene distrutta rapidamente dalla cottura, dall'esposizione all'aria e alla luce. La conservazione riduce molto il contenuto di vitamina C. La capacità dell organismo di assorbire la vitamina C viene ridotta dal fumo, dallo stress, dalla febbre alta o dall inalazione di gas derivati dalla combustione del petrolio. La vitamina C assunta dalla mamma durante la gravidanza può influire sul peso del feto e sullo sviluppo neonatale. Lo riporta uno studio condotto dalla Louisiana State University Health Sciences Center in Shreveport I ricercatori hanno condotto le analisi ematiche sulle mamme e sul cordone ombelicale dei loro bambini per rilevare i livelli di due vitamine antiossidanti, la vitamina C e la vitamina E, e dei perossidi lipidici, un indicatore del danno ossidativo.. Secondo i ricercatori, questo risultato evidenzia che l assunzione di vitamina C e di vitamina E da parte della mamma può influenzare i livelli vitaminici dei bimbi. È stato inoltre riscontrato che il peso alla nascita dei neonati era associate in maniera significativa con i livelli di vitamina C rilevati sia nella mamma che nel feto. I ricercatori americani hanno sottolineato l importanza della vitamina C alla nascita per la sintesi del collagene e in quanto fattore di protezione contro il danno ossidativo. Fonte: Molecular and Cellular Biochemistry RUOLO FISIOLOGICO della Vitamina E Previene i processi di ossidazione dei Radicali Liberi. Ritarda l invecchiamento cellulare Coopera contro l infertilità Migliora il rendimento sessuale RUOLO FISIOLOGICO dello Zinco (ZN) Presenta una forte azione antiossidante Ritarda l invecchiamento cellulare Neutralizza gli effetti delle radiazioni ionizzanti Favorisce la sintesi di RNA-DNA RUOLO FISIOLOGICO del Selenio (SE) Presenta una forte azione antiossidante Svolge un azione strettamente collegata alla Vit E Ritarda l invecchiamento cellulare Aumenta la fertilità RUOLO FISIOLOGICO dell Acido Folico È fondamentale per l assorbimento del ferro Promuove la normale funzione dei globuli rossi Partecipa al buon funzionamento degli organi sessuali Regolarizza il ciclo mestruale

9 Lepidium meyenii "Nasce questa pianta nelle zone della sierra più aspre e fredde, dove non si può coltivare nessuna altra pianta per il sostentamento dell'uomo". Padre Bernabè Cobo 1653 Storia Un tempo la sua coltivazione era diffusissima in molte parti dell'altopiano peruviano e boliviano. Di fatto oggi il suo areale è ristretto a poche zone corrispondenti alle zone ecologiche di Suni y Puna, sulle rive del lago Chinchapoya, nel dipartimento del Junin e del Pasco, ad un'altezza compresa tra i 3700 ed i 4450 m.s.m. In totale meno di 50 ha sono oggi dedicati alla coltivazione di questo alimento (Tello et al. 1992). Come è stato possibile una così drastica riduzione dell'areale di crescita? Da resti preistorici è oramai assodato che i primi abitanti dell'altopiano peruviano conoscevano il Lepidium meyenii: tra il 4000 ed il 1200 a.c. nacque un'agricoltura basata sulla domesticazione del Lepidium meyenii. Ma fu la nascita del Cusco e della civiltà Inca che valorizzò completamente questo tubero. Le truppe incaiche erano alimentate con razioni il Lepidium meyenii per aumentarne forza e prestazioni fisiche nelle marce estenuanti e nei duri combattimenti. Il motivo della impressionante restrizione dell'areale di crescita del Lepidium meyenii è principalmente dovuto al progressivo esaurimento dei suoli (Castro de Leon 1990). Il Lepidium meyenii infatti, alimento ricchissimo in nutrienti, esaurirebbe progressivamente i suoli. E' quindi necessario un sistema di coltivazioni rotatorie,con un periodo di riposo dei suoli di 5-10 anni, ma anche con questo sistema, con il passare degli anni, il numero delle zone coltivabili scende progressivamente. Ecco che dopo secoli il Lepidium meyenii cresce solo in un area relativamente piccola dell'altopiano peruviano e questo nonostante le ricerche dell'instituto Nacional de Investigacion Agraria y Agroindustrial (INIAA) che ha ripetutamente cercato di estendere queste coltivazioni.(canales 1992). Botanica. La prima descrizione botanica del Lepidium Meyenii fu merito del dr. G. Walpers nel 1843 che utilizzò uno specimen del dept. di Puno e coniò il termine Lepidium meyenii Walp. Dal punto di vista botanico, il Lepidium meyenii corrisponde a: Divisione Classe Subclasse Ordine Famiglia Tribù Genere Specie Nome comune Angiospermae Dicotyledoneae Archichlamydeae Papaverales Brassicaceae Lepidieae Lepidium Lepidium meyenii Maca La famiglia delle Brassicaceae consta di oltre 2500 specie e di oltre 350 generi, tra cui importantissimi alimenti come broccoli e cavolfiori. Il termine Lepidium deriva dal greco "Lepidion", che letteralmente significa "piccola squama", nome attribuito già da Dioscoride ai piccoli frutti di questo genere. Si tratta di un genere cosmopolita che comprende circa 130 specie nel mondo: nel solo Perù ve ne sono 15 specie (Brako y Zaruchi 1995). Il Lepidium meyenii appare sostanzialmente nella fase vegetativa come una piccola rosetta di foglie, che diventa di dimensioni maggiori nella fase generativa quando è costituita da foglie e fiori, e di una radice di forma generalmente conica, che costituisce il suo organo di sotterraneo e che arriva ad una lunghezza di circa 18 cm e 6.5 cm di diametro. Le dimensioni in realtà possono variare moltissimo, con esemplari molto piccoli che arrivano a 1 cm di lunghezza e a 0.6 cm di diametro. Queste ultime sono quelle generalmente più apprezzate dalle popolazioni indie. Le maggiori invece troppo ricche di fibra, vengono ritenute di scarso valore nutritivo e denominate "shugla". Il colore della radice varia da pianta a pianta, passando dal giallo chiaro al rosso scuro, fino al marrone-nero: esiste una vasta classificazione indigena delle differenti specie non necessariamente in relazione con la loro qualità, come dimostrato dai moderni studi chimici.

10 Da una recente indagine effettuata su 758 piante provenienti dal dept. di Junin, sono risultati i seguenti 13 ecotipi: COLORE DELLA PERCENTUALE % RADICE GIALLO 47,8 ROSSO-BIANCO 16,5 ROSSO PORPORA 9 - BIANCO BIANCO-ROSSO 6,3 PIOMBO 5,4 NERO 4,2 ROSSO - GIALLO 3,7 BIANCO 2,2 BIANCO ROSSO 1,6 PORPORA ROSSO 1,3 PIOMBO CHIARO 0,8 Fitochimica Per quanto riguarda la composizione chimica del Lepidium Meyenii dobbiamo distinguere due grandi categorie: i composti primari (di natura nutrizionale) da quelli secondari. Gli studi nutrizionali sul Lepidium Meyenii hanno rivelato ovviamente una notevole differenza nel contenuto di macronutrienti. 1. Composizione chimica Percentuale Le proteine nel lepidium meyenii sono composti per la maggior parte da amminoacidi essenziali. In particolare gli amminoacidi arginina e lisina agiscono sulla regolazione della fecondità di uomini e donne. Composizione chimica del Lepidium Meyenii (da Universidad Nacional Agraria La Molina - Perù) gr% Umidità 15 Carboidrati 59 Proteine 11,9 Ceneri 4,8 Grassi 1,7 Fibra 8,3 Vitamine mg % Tiamina "B1" 0,20 Riboflavina "B2" 0,35 Vitamina "C" 2,50 Niacina 43,03 Minerali mg/100 gr Calcio 220 Fosforo 180 Ferro 15,5 Manganese 0,8 Cobalto 5,9 Zinco 3,8 Sodio 18,7 Potassio 2050 Iodio 520 Magnesio 720 Amminoacidi mg/g Proteina Acido Aspartico 91,7 Acido Glutammico 156,5 Serina 50,4 Istidina 21,9 Glicina 68,3 Treonina 33,1 Alanina 63,1 Arginina 99,4 Tirosina 30,6 Fenilalanina 55,3 Valina 79,3 Metionina 28 Isoleucina 47,4 Leucina 91 HO-Prolina 26 Prolina 0,5 Sarcosina 0,7

11 2. Costituenti fitochimici PROPRIETA ED APPLICAZIONI NUTRITIVE. In virtù delle sue eccellenti qualità nutrizionali, molto simili a quelle dei cereali, la radice del Lepidium meyenii costituisce tuttora un componente fondamentale della dieta delle popolazioni andine. Studi scientifici confermano che il Lepidium Meyenii è veramente un alimento completo, ed essiccato è in grado di mantenere inalterate per anni le sue caratteristiche nutritive. La radice disidratata, infatti, è ricca in carboidrati (59%) e proteine (10.2%), ma possiede un modesto tenore di lipidi (2.2%)e un discreto contenuto di fibre (8.5%); particolarmente rilevante è il contenuto di aminoacidi e acidi grassi essenziali, nonché di vitamine (A, B1, B2, B12, C, D, E), sali minerali (calcio, ferro, fosforo, rame, potassio, magnesio, zinco). 1) Alcaloidi, Beta-ecdysone, p-metossibenzil isotiocianato. General structure of an isothiocyanate l'attività afrodisiaca e antiserilità della lepidium meyenii. BETA-ECTDYSONE A quest ultimo è imputata l azione anabolizzante. 2) Vitamine (A,B1,B2, B12,C,D,E) e flavonoidi (vitamina P). Fra i componenti biologicamente attivi del lepidium meyenii, ricordiamo i glucosinolati, contenenti glicosidi solforati che si trovano anche in altre specie della famiglia delle Brassicacee (ad esempio nei broccoli). La maca è ricca in glucosinolati benzilici, glucotropolina e in p-metossi benzil glucosinolato. Questi sono 10 volte più concentrati nella radice fresca che in quella essiccata. Triturando la radice, l enzima mirosinasi, contenuto nei vacuoli della pianta, fuoriesce nel citosol della cellula, andando ad agire su tali composti e trasformandoli in isotiocianati. Gli isotiocianati aromatici, specie il benzil isotiocianato e il p-metossibenzil isotiocianato, sono composti biologicamente attivi, che in diversi studi farmacologici hanno mostrato attività antitumorali. Nel lepidium meyenii sono stati individuati quattro alcaloidi (Obregon Vilches 1998): macaina 1,2,3 e 4. La presenza di questi composti è stata messa in relazione con Struttura di un isoflavonoide 3) Carboidrati Il lepidium meyenii contiene, tra i carboidrati, del fruttosio che aiuta a combattere la stanchezza. Inoltre, il plasma seminale utilizza questo fruttosio per fornire energia agli spermatozoi. 4) Aminoacidi e acidi grassi essenziali Praticamente tutti gli amminoacidi essenziali, a parte il triptofano, sono presenti. (Espinoza e Poma 1995).In particolare, sono presenti aminoacidi (soprattutto acido aspartico, acido glutammico, serina, istidina, glicina, treonina, cisteina, alanina, arginina, tirosina, fenilalanina, valina, lisina e triptofano), apprezzabili quantitativi di alcuni acidi grassi, tra i quali sono compresi anche l acido linolenico, l acido palmitico e l acido oleico.

12 5) Minerali (Calcio, fosforo, ferro, iodio, magnesio, potassio, rame, zinco) Il lepidium meyenii cresce unicamente nei suoli ricchi in minerali e contiene: calcio, magnesio, potassio, ferro, silicio e tracce di iodio, manganese, zinco, rame. e sodio. 6) Steroli (stigmasterolo, sitosterolo, campesterolo, ergosterolo)e saponine Questi composti sono stati rilevati anche nel Tropaeolum tuberosum, una specie ritenuta capace di incrementare la fertilità umana. Struttura dello sterolo, composto capostipite degli steroli. Struttura del colesterolo. Notare la ramificazione al C17 dell'anello D. 7) Tannini Il termine tannino indica una classe di composti aromatici di natura polifenolica, di sapore astringente, capaci di tannare (interagire con proteine) la pelle animale, quando trattata con un'infusione acquosa di galle di quercia, per renderla impermeabile all'acqua e imputrescibile, producendo cuoio. I tannini possiedono le caratteristiche tipiche dei fenoli, come la capacità di formare complessi colorati con sali di ferro, di subire facilmente reazioni di sostituzione elettrofila aromatica, ecc.. I tannini sono ampiamente diffusi nel regno vegetale, polifenoli naturali delle piante, si trovano comunemente nella frutta (uva, cachi, mirtillo, melograno..), nel tè, nel cioccolato, nel trifoglio, negli alberi ( quercia, acacia, mirto..) in alcune erbe (sorgo..). Effetti dei tannini in vitro: Azione antivirale Inibitori della formazione dell'anione superossido Azione radical scavenger Probabile stimolazione del sistema immunitario Antitumorali PROPRIETA ED APPLICAZIONI NUTRICEUTICHE Il concetto che alimentazione umana e salute siano intimamente legate è noto sin dalla antichità. Con il termine nutriceutico si intende un alimento in grado di avere effetti positivi sulla salute. Gli alimenti, infatti, sono sostanze chimiche capaci di influenzare le funzioni dell organismo. La radice del Lepidium Meyenii svolge molteplici azioni fisiologiche che sono brevemente riportate di seguito. Attività immunostimolante. Il Lepidium meyenii è noto per il suo potere adaptogeno: aumenta le resistenze aspecifiche dell organismo contro lo stress psico-fisico e diverse infezioni patologiche (come ad esempio la tubercolosi), ottimizza il metabolismo energetico cellulare e normalizza le funzioni fisiologiche, ristabilendo l omeostasi. Prerogativa dell adaptogeno, inoltre, è l assoluta sicurezza, non presenta cioè effetti tossici o collaterali indesiderati. Attività anti-tumorale. Il contenuto in glucocinolati del tubero, associato alla presenza di diversi alcaloidi e steroli, conferisce al Lepidium meyenii effetti terapeutici nel trattamento in alcuni tipi di tumore. Attività anti-invecchiamento. L assunzione del Lepidium meyenii aiuta a ritardare i processi dell invecchiamento. Grazie all apporto di vitamine antiossidanti (vit. A, C, E), flavonoidi, acidi grassi essenziali, fosforo ed oligoelementi in genere, la radice del Lepidium meyenii possiede straordinarie virtù energizzanti, contribuendo al mantenimento del vigore fisico, compreso quello sessuale, e della lucidità mentale. Attività anabolizzante. Per il suo contenuto in steroli quali il b-ecdisone, il Lepidium meyenii costituisce un alternativa naturale e sicura agli anabolizzanti.

13 Il lepidium meyenii è un adattogeno che stimola l ipofisi e l ipotalamo a produrre una quantità maggiore di testosterone nell organismo così da garantire una riserva ormonale a lungo termine. Alcune proprietà del Lepidium Meyenii : Produrre testosterone in modo spontaneo Costituire una maggiore riserva energetica Offrire una maggiore vitalità Integrare il bilancio ormonale Incremento della densità ossea. La radice del Lepidium Meyenii apporta alti livelli di calcio (22% RDA) e sali minerali in genere in forma facilmente assorbibile. La sua assunzione, quindi, è consigliabile quando il fabbisogno di questi elementi aumenta, ad esempio durante la crescita, la gravidanza e l allattamento, la menopausa; si è inoltre rivelato utile per accelerare la guarigione delle fratture e nel trattamento delle patologie legate al decremento della densità ossea, quali decalcificazione e osteoporosi. Coadiuvante nel trattamento delle anemie. L elevato contenuto di ferro e vitamina B12 stimola la produzione dei globuli rossi, rendendo il Lepidium Meyenii un valido coadiuvante nel trattamento delle anemie di modesta e media entità. Regolazione dell asse ipotalamo-ipofisario. L attività adaptogena del Lepidium Meyenii si esplica in modo particolare a livello della regolazione dell attività endocrina, specie quella sotto il controllo dell asse ipotalamoipofisario. Per questo motivo il Lepidium meyenii trova impiego nel trattamento di molte disfunzioni ormonali legate alla sfera sessuale, e riguardanti la fisiologia sia maschile che femminile. Il Lepidium Meyenii ha azione stimolante sulle ghiandole surrenali ed il relativo effetto energizzante. Secondo alcuni recenti studi sembra che il Lepidium Meyenii sia inoltre in grado di stimolare nelle ovaie ed in altre ghiandole la produzione di ormoni, oltre ad esercitare un effetto regolatore sugli organi interni di secrezione, quali il pancreas, l ipofisi, ed appunto, le ghiandole surrenali.. Attività afrodisiache e trattamento dell impotenza. Studi clinici condotti da numerosi medici americani dimostrano che l assunzione del Lepidium meyenii ha effetti positivi sulla vita sessuale di entrambi i sessi, incrementando la libido e migliorando le prestazioni sessuali. Inoltre si è rivelato estremamente efficace nel trattamento delle disfunzioni erettili e dell impotenza maschile, sia che si manifesti come stato patologico, sia che insorga fisiologicamente con l avanzare dell età. Un ipotesi possibile, ma ancora da dimostrare, potrebbe comprendere un azione rivolta al miglioramento della circolazione a livello dei vasi responsabili della risposta erettile. Più semplicemente, l effetto potrebbe essere dovuto ad un generale incremento dell energia, della vitalità non accompagnato da un parallelo aumento di nervosismo (nel lepidium meyenii non sono presenti, ad esempio, sostanze quali la caffeina), aspetto questo che potrebbe avere una certa influenza sulla libido e sul livello delle prestazioni sessuali.. Trattamento della sterilità maschile e femminile. Da secoli il lepidium meyenii è impiegato per aumentare le capacità riproduttive di uomini e animali. Oggi esistono numerosi studi a riguardo: quattro alcaloidi isolati dalla radice del Llepidium meyenii, somministrati a ratti di entrambi i sessi, hanno dimostrato di incrementare l oogenesi nelle femmine e la spermatogenesi nei maschi, e gli stessi risultati sono stati raggiunti con l assunzione della radice essiccata. Gli effetti su ovaie e testicoli compaiono già dopo 72 ore dalla somministrazione, e non sono dovuti ad ormoni vegetali, ma all azione dei suddetti alcaloidi sull asse ipotalamo-ipofisario, che nella specie umana si ripercuote anche sui reni, sul pancreas e sulla tiroide. Questa azione è stata oggi dimostrata in alcuni esperimenti su animali da allevamento. L'assunzione regolare di lepidium meyenii induce un aumento dei rapporti sessuali e ad un aumento dei follicoli di Graaf negli animali femmina, mentre negli animali maschi aumenta il volume di fluido seminale del 20%, la

14 motilità spermatica del 40% e il numero di spermatozoi del 33%: tutto ciò si traduce alla fine in un maggior numero di parti a termine (Obregon Vilches 1998). Per raggiungere tali risultati la percentuale di farina di lepidium meyenii nell'alimentazione dovrebbe corrispondere a circa il 6%. Il limite di tali studi consiste principalmente nell'assenza di un gruppo controllo. Tale effetto è stato oggetto successivamente di almeno quattro studi su animali (con relativo gruppo di controllo) che hanno quantomeno confermato l'effetto afrodisiaco. Sulla base di tali ricerche è probabile che la frazione attiva sia quella che riguarda gli acidi grassi polinsaturi: tra questi due in particolare assumerebbero particolare importanza, il macaene ed il macamide (Muhammad et al. 2002). La presenza di questi composti varia comunque enormemente nei vari preparati in commercio oscillando tra un 0.15% ed un 0.84%, con il risultato che il consumo di questi composti oscilla tra 1-52 e mg/die (Ganzera et al. 2002). Altri Autori avevano ipotizzato in questo senso un ruolo degli isotiocianati (Johns 1981) o delle sostanze steroidee (Dini et al. 1994).. Disfunzionalità ovarica, menopausa. I ginecologi americani prescrivono il Lepidium meyenii per regolare la funzionalità ovarica. In menopausa è preferito alla terapia ormonale sostitutiva, perché, al contrario degli ormoni esogeni, stimola naturalmente le ovaie e le altre ghiandole endocrine a produrre gli ormoni di cui l organismo ha bisogno. E dimostrato che l assunzione del Lepidium meyenii allevia in maniera significativa i sintomi tipici che precedono e accompagnano la menopausa (vampate di calore, depressione e stanchezza, tachicardia, costipazione, perdita di tessuto osseo, secchezza vaginale). In caso di menopausa precoce l uso del Lepidium meyenii può consentire la ripresa di un ciclo mestruale regolare, mentre in seguito ad isterectomia, con o senza rimozione delle ovaie, fa registrare in breve tempo un incremento dei livelli ematici di estradiolo e un miglioramento delle condizioni generali. In base agli studi clinici si consiglia l assunzione del Lepidium meyenii prima della menopausa, per mantenere le ovaie in buono stato ed ottenere in seguito maggiori benefici.. Nello sportivo Il lepidium meyenii è alimento ideale proprio per la ricchezza in quei nutrienti essenziali allo sviluppo di una massa muscolare adeguata per sostenere sforzi notevoli e, soprattutto, prolungati. Questo ovviamente non significa che siamo davanti alle concentrazioni che ci hanno abituato, con grosse preoccupazioni per la sicurezza e perplessità per la reale efficacia, certi integratori "da palestra". La posizione della Lepidium meyenii come integratore alimentare è più diversificata e in un certo senso più "completa". Contiene in pratica, alle corrette concentrazioni alimentari, tutti gli alimenti di cui necessita una persona sottoposta a intensi sforzi fisici (quale è un contadino costretto a lavorare per 8-10 ore ad oltre m. di quota). Inoltre l'azione energizzante del lepidium meyenii non si limita al suo valore nutritivo. Esperimenti su ratti hanno dimostrato che l'assunzione di lepidium meyenii a dosaggi alimentari è in grado di aumentare i livelli di glucosio in ratti ipoglicemici dopo digiuno prolungato (18 h.) o dopo induzione farmacologica (insulina): tale dato è particolarmente significativo in quanto evidenza un'azione sulla glucogenesi, la produzione di glucosio a partire dalle riserve di glicogeno dell'organismo (Miura et al. 1999). La disponibilità di glucosio viene messa in relazione con le riserve energetiche dell'organismo e la crisi ipoglicemica è il primo segnale del "crollo" negli atleti sottoposti a sforzi prolungati. L'utilità della maca per lo sportivo è quindi particolarmente indicata per coloro che cercano un miglioramento nella resistenza fisica e nello sforzo prolungato. La concentrazione di rivelanti dosi di minerali (Dini et al. 1994) la rendono ulteriormente utile a questo fine. La presenza di rilevanti concentrazioni di ferro e calcio la rendono inoltre adatta ad integrare tutte le situazioni di aumentato fabbisogno, soprattutto nella donna: gravidanza ed invecchiamento innanzitutto. In particolare la concomitante presenza di elevate concentrazioni di questi minerali e di tutti gli amminoacidi essenziali necessari per la crescita del feto ne fanno un eccellente alimento in gravidanza, come riportato dalla tradizione andina.

15 Studi clinici e di farmacologia sperimentale Due studi sono stati realizzati in Italia, uno in Cina ed uno in Perù. Due studi sono stati realizzati all'università di Modena. Nel primo è stato dimostrato su ratti da esperimento, come l'effetto afrodisiaco, evidenziabile attraverso un aumento delle performance copulatorie, sia indipendente dal valore nutritivo del lepidium meyenii (Cicero et al. 2001). Nel secondo invece è stato dimostrato come soprattutto l'estratto esanico sia responsabile di questo e non quello cloroformio(cicero et al. 2002). Lo studio cinese ha evidenziato che integrando l'alimentazione di ratti da esperimenti con un tale estratto allo 10% per 22 giorni si assisteva nel gruppo trattato ad un aumento del numero di intromissioni sessuali di quattro volte maggiore e ad un aumento del numero di femmine positive per la presenza di sperma di 2.5 volte. (Zheng et al 2000). Mentre uno studio peruviano ha simostrato che un estratto acquoso di maca (66.7 mg/ml), somministrato per 14 giorni risulta in un aumento di peso dei testicoli e dell'epididimo, con un aumento del numero di spermatozoi maturi (Gonzales et al 2002).Gli ultimi due studi sostanzialmente sosterrebbero come l'impiego del lepidium meyenii abbia come indicazione primaria la sterilità maschile piuttosto che un semplice effetto afrodisiaco e tale azione, da un punto di vista terapeutico risulterebbe senza dubbio più affascinante e in sintonia con la medicina tradizionale andina. Va sottolineato che un recente lavoro peruviano ha dimostrato come l'assunzione protratta per quattro mesi di lepidium meyenii ( mg/die) ha portato in nove soggetti di età compresa tra i anni ad un aumento del volume seminale, della conta di spermatozoi, ad un aumento della motilità spermatica e del numero di spermatozoi mobili. Nessuno di questi effetti era in qualche maniera riconducibile ad un'azione ormone-mediata dovuta ad un incremento di ormone luteinizzante, follicolo stimolante, ad un aumento di prolattina, testosteroneo di estradiolo (Gonzales et al. 2001). Dati i preoccupanti rischi a lungo andare connessi con un aumento di tali ormoni, non è un risultato da poco. L'interesse primario del lepidium meyenii come antisterilità risiede proprio nel fatto che esso sembra dipendere da composti che contribuiscono in qualche maniera al suo valore alimentare. Si tratterebbe cioè di sostanze naturali con un ampio margine di sicurezza (test su animali non hanno evidenziato alcun segno di tossicità a dosaggi di 3 gr/kg). Il lepidium meyenii è un alimento naturale utilizzabile per lunghi tempi e con un margine di sicurezza eccellente: i popoli andini lo impiegano da millenni a dosaggi elevati senza che nessun segno di tossicità sia stato evidenziato. Produzione ed usi Come detto precedentemente per il lepidium meyenii esiste un serio problema di disponibilità di terreni: i popoli andini hanno di conseguenza sviluppato nei secoli un raffinata tecnologia per massimizzare al massimo la conservazione delle benefiche proprietà di questo alimento. Conclusioni Le caratteristiche potenzialmente attribuibili alla radice del lepidium meyenii sono molteplici e si rivelano particolarmente promettenti nei confronti della risoluzione di alcune problematiche ormai largamente diffuse nel mondo occidentale moderno. Sebbene, gli studi che riguardano il lepidium meyenii siano prevalentemente indirizzati alla determinazione della sua dinamica d azione a livello della funzione ovarica nelle donne e della risposta erettile nell uomo, non è da escludersi che prossimamente emergano altre proprietà interessanti, quali ad esempio quelle di antiossidante (in seguito al suo contenuto in Vit E e Vit. C) ed anticancerogeno, caratteristiche già attribuibili ad alcune delle sostanze in esso contenute, quali i glucosinolati e gli isotiocianati. Tabella riassuntiva delle proprietà, gruppi di sostanze contenute nel Lepidium meyenii. MACA (Lepidium meyenii) Proprietà/azioni Anti fatica, afrodisiaco, nutritivo, immunostimolante, steroidale, tonico Sostanze Alcaloidi, proteine, aminoacidi, carboidrati, calcio, ferro, magnesio, fosforo, silice, zinco, Vit. B1, Vit. B2, Vit B12, Vit.C, Vit. E, p-metossibenzil isotiocianato, saponine, stigmasterolo, sitosterolo, tannini, beta ecdisone,

16 Bibliografia - Alvarez Mayta T (1973): Estudio de la Maca y su valor nutritivo. Tesis. Faculdad de Ciencias de la Educacion. Especialidad de Ciencias Quimicas y Biologicas. Universidad Nacional del Centro del Perù (Huancayo). - Brako L and Zaruchi J (1993): Catalogos de las Angiospermas y Gimnospermas del Perù. Missouri Botanical Garden, St. Luis. - Canales OG (1992): Coltivo de maca. INIAA y TTA, Lima. - Castro de Leon (1990): Un coltivo andino en extincion: el caso de la Maca. Perù Indigena, 12(28): Chacon G. (1990): La maca, Lepidium peruvianum Chacon sp. Nov. Y su habitat. Revista Peruana de Biologia, 3, pp Cicero AFG, Bandieri E e Arletti (2001): Journ. of Ethnopharmacol., vol. 75, pp Dini A, Migliuolo G, Ratselli L, Saturnino P e Schettino O (1994): Chemical composition of Lepidium meyenii. Food Chemistry, 49, Espinoza T and Poma I (1995): Determinacio de aminoacidos essenciales de la Maca y elaboracion de una mezcla proteica a base de alimentos andinos. Tesis. Faculdad de Ingegneria en Industrias Alimentarias. Universidad Nacional del cebtro del Perù. Huancayo. - Ganzera M, Zhano J, Muhammad I, Khan IA (2002). Chemical profiling and standardization of Lepidium meyenii (Maca) by reversed phase high performance liquid chromatography. Chem. Pharm. Bull., 50(7), Gonzales GF, Cordova A, Gonzales C, Chung A, Vega K and Villena A. Lepidium meyenii (Maca) improved semen parameters in adult men. Asian J. Androl., 3(4), Gonzales GF, Ruiz A, Gonzalez C, Villegas L, Cordova A (2001). Effect of Lepidyum meyenii (maca) roots on spermatogenesis of male rats. Asian J. Androl., 3(3), Johns T (1981): The anu and the maca. Journ. of Ethnobiol., 1(2), Muhammad I, Zhao J, Dunbar DC, Khan IA (2002). Cotituents of Lepidium meyenii 'maca'. Phytochemistry, 59(1), Miura T, Hayashi M, Naito Y and Suzuki I (1999): Antihypoglycemic effect of Maca in fasted and insulininduced hypoglicemic mice. Journ. of Tradit. Medicine, 16, Obregon Vilches L (1998): Maca. Planta Medicinal y Nutritiva del Perù. Istituto de Fitoterapia Americano, Lima, - Piacente S, Carbone V, Plaza A, Zampilli A e Pizza C (2002). Investigation of the Tuber Costituents of Maca (lepidium meyenii). J. Agric. Food Chem., 50(20), Tello JM, Herman M and Calderon A (1992): La maca: cultivo alimenticio potencial para las zonas altoandinas. Boletin de Lima, 14(81): Yllessca Gutierrez MG (1994): Estudio Quimico y Fitoquimico Comparativo de 3 Ecotipos de Lepidium meyenii. Catedra de Bromatologia, Faculdad de Farmacia y Bioquimica. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. - Vasquez Baquerizo G. (1968): Estudio quimicobromatologico del Lepidium meyenii. Tesis. Bachiller en Medicina. Faculdad de Medicina. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima. - Zheng BL, He K, Kim CH, Rogers L, Shao Y, Huang ZY, Lu Y, Yan SJ, Qien LC and Zheng QY (2000): Effect of a Lipidic Extract from Lepidium meyenii on Sexual Behavior in Mice and Rats. Urology, 55(4), pp

17 SELENIO E FUNZIONE RIPRODUTTIVA MASCHILE Andrea Garolla Centro di Crioconservazione dei Gameti Maschili Dipartimento di Istologia, Microbiologia e Biotecnologie Mediche Università degli Studi di Padova Via Ospedale Padova L enzima Phospholipid Hydroperoxide Glutathione Peroxidase (PHGPx), è una selenoproteina appartenente alla famiglia delle glutation-perossidasi. Nelle prime fasi della spermatogenesi, si comporta come una vera glutationperossidasi svolgendo una azione anti-ossidante. Negli spermatozoi maturi, si trova in forma inattiva come costituente della capsula mitocondriale, di cui rappresenta oltre il 50% del contenuto proteico. Tuttavia, mediante adeguate metodiche è possibile ottenere il recupero dell attività enzimatica, e rendere possibile la sua misurazione nei campioni seminali. Tale attività può risultare alterata per carenza di selenio, per ridotta sintesi della proteina, o per un difetto del gene che codifica la proteina. Recenti studi sperimentali hanno dimostrato che il selenio è essenziale per la riproduzione maschile, e in animali tenuti a dieta priva di selenio si assiste alla comparsa di anomalie morfologiche e strutturali degli spermatozoi con conseguente infertilità. Inoltre, alcuni autori norvegesi hanno osservato che le concentrazioni seminali di selenio correlano con la concentrazione degli spermatozoi nei soggetti infertili. Il selenio è distribuito nell ambiente allo stesso modo dello iodio, viene assunto con la dieta ed è un oligoelemento di fondamentale importanza per la biologia umana. La dimostrazione che la carenza di iodio nelle aree montane determina importanti disfunzioni tiroidee, ne ha comportato una supplementazione nelle aree carenti, ma allo stato attuale non vi sono studi sulle conseguenze di una selenio deficienza e sulle concentrazioni di questo oligoelemento nelle diverse aree geografiche. Sulla base di queste osservazioni, abbiamo studiato 120 soggetti infertili, 80 dei quali residenti nella Regione Veneto e 45 in Alto Adige. I risultati ottenuti mostravano una netta differenza tra le due popolazioni: i campioni provenienti dall Alto Adige presentavano in media una quantità di selenoproteina, ridotta di circa due terzi rispetto a quella riscontrata nei campioni Veneti. Dai risultati emergeva inoltre che nei campioni provenienti dal Veneto la riduzione della quantità di proteina era sempre associata ad alterazioni del numero degli spermatozoi, mentre i campioni provenienti dall Alto Adige frequentemente presentavano parametri seminali sostanzialmente normali in presenza di basse concentrazioni di selenoproteina. In conclusione, il riscontro di una riduzione della selenoproteina in soggetti infertili, ci ha permesso di individuare il meccanismo attraverso il quale il selenio determina infertilità. La riduzione dei livelli di PHGPx, riscontrata negli spermatozoi dei soggetti Alto Atesini, sembra esprimere una carenza di selenio nell ambiente. I risultati di questo studio, assumono un importante rilievo epidemiologico e sociale che potrebbe concretizzarsi in interventi sul territorio, per prevenire il problema dell infertilità in situazioni geografiche analoghe.

18 ORIGINAL ARTICLE Effect of chronic treatment with three varieties of Lepidium meyenii (Maca) on reproductive parameters and DNA quantification in adult male rats M. Gasco 1,2, J. Aguilar 1 & G. F. Gonzales 1,2 1 Department of Biological and Physiological Sciences, Faculty of Sciences and Philosophy, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Peru; 2 Instituto de Investigaciones de la Altura, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Peru Keywords Daily sperm production Lepidium meyenii sperm count in epididymis sperm count in vas deferens testis DNA levels Correspondence Manuel Gasco, Department of Biological and Physiological Sciences, Faculty of Sciences and Philosophy, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Av. Honorio Delgado 430, Lima 31, Peru. Tel./Fax: ; @upch.edu.pe Accepted: May 29, 2007 Summary The aim of this study was to evaluate the chronic effect of different varieties of Lepidium meyenii (Red Maca, Yellow Maca and Black Maca). Male rats were treated by gavage with aqueous extract of each variety of maca equivalent to 1 g hypocotyl kg )1 body weight (BW) for 84 days. At the end of the treatment, daily sperm production (DSP), epididymal sperm count (ESC) and sperm count in vas deferens (SCVD) were assessed. In addition, testis DNA quantification was also determined. Any toxic effect was assessed in liver and spleen by histological studies. The results indicate that Yellow Maca and Black Maca improved ESC and that three varieties of maca increased the SCVD without affecting DSP. Moreover, testis DNA levels were not affected by treatment with any of the three varieties of maca. Histological picture of the liver in animals treated with the three varieties of maca was similar to that observed in controls. In conclusion, Yellow and Black Maca increased epididymal sperm count after 84 days of treatment without affecting DSP. Maca seems to act as a modulator of sperm count at the reproductive tract level. Introduction Maca (Lepidium meyenii) is a plant that belongs to the family Brassicaceae, and grows exclusively between 4000 and 4500-m altitude at the central Peruvian Andes. Traditionally the hypocotyls of this plant are used mainly as a nutrient and for enhancing fertility (Valerio & Gonzales, 2005). Oral administration of an aqueous extract of L. meyenii (Yellow Maca) for 7 days at a dose of about 2 g kg )1 of body weight (BW) increased the length of the spermiation stage (stage VIII) of the seminiferous tubules in male rats (Gonzales et al., 2004; Chung et al., 2005). When the treatment was prolonged to 14 days, it increased the length of stages in which first mitosis occurs (stages IX-XI); however, sperm count was reduced with respect to values at day 7 of treatment (Gonzales et al., 2001a, 2004). Although yellow Maca is most popular and preferred by natives, several varieties are characterised by differently coloured hypocotyls (Valerio & Gonzales, 2005). Different biological properties have been described for red Maca (RM), yellow Maca (YM) and black Maca (BM) on spermatogenesis and as potential agents against cancer (Gonzales & Valerio, 2006). Long-term treatment for 42 days showed that black Maca has better effect than yellow Maca whereas red Maca was ineffective in increasing daily sperm production (Gonzales et al., 2006a). We have demonstrated that red Maca but not yellow Maca or black Maca reduced prostate size (Gonzales et al., 2005; Gonzales et al., 2007; Gasco et al., 2006). The duration of the seminiferous cycle in rat is 12.5 days (Aslam et al., 1999). In a recent study, it has been demonstrated that black Maca improved sperm counts in the epididymis as early as 1 day after treatment and that this effect seems to be a regulatory mechanism of the distribution of sperm produced in the testis rather than a real higher production of sperm (Gonzales et al., 2006b). After 42 days, epididymal sperm count was Journal Compilation ª 2007 Blackwell Publishing Ltd Æ Andrologia 39, No claim to original Peruvian government works 151

19 Effect of chronic treatment with three varieties of Lepidium meyenii M. Gasco et al. increased with yellow Maca and black Maca but not with red Maca, whereas DSP was increased only after treatment with black Maca (Gonzales et al., 2006a) suggesting that maca may be modulating sperm count first at the level of the reproductive tract and then on DSP. The same pattern should be observed after longer treatments. The present study was designed to determine whether treatment with diverse varieties of maca (RM, YM and BM) for 84 days affects daily sperm production (DSP), sperm counts in epididymal and vas deferens, and total DNA levels in testes. Material and methods Animals Three-month-old male Holtzman strain was used. Rats were housed 4 per cage and maintained at 22 C with a 12 : 12 light/dark cycle. Rats were provided with Purina laboratory chow and tap water ad libitum. The animals were treated according to the standards of the National Institute of Health for the care and use of laboratory animals (National Research Council, 1996). The Institutional Review Board of the Scientific Research Office from the Universidad Peruana Cayetano Heredia approved the study (SIDISI-UPCH: 50682). Experimental protocol Rats received freeze-dried Red Maca (RM), Yellow Maca (YM) and Black Maca (BM) in a single daily dose of 1gkg )1 suspended in around 2 ml of water. Another additional group received 2 ml of the vehicle (distilled water). Each group of treatment included eight animals. RM, YM, BM or vehicle were orally administerted from day 1 to day 84 using an intubation needle No 18 (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). At the end of each treatment, rats were killed by decapitation. Reproductive organs (testes, epididymal, seminal vesicle, ventral prostate and vas deferens), and non reproductive organs such as the liver and the spleen were dissected out, cleaned of the adhering connective tissues and weighed. Preparation of aqueous extract of the varieties of Maca The hypocotyls of Lepidium meyenii, which is cultivated by farmers, were obtained from Carhuamayo at an altitude of 4000 m in Junin (Central Andes of Peru), The maca used is prepared from raw material, which is converted into aqueous extract after a boiling process, this plant is harvested in autumn, the hypocotyls are naturally dried after harvesting and are stored for 2 years before further use. The identity of the plant was authenticated by Irma Fernandez, Botanist from the Department of Pharmaceutical Sciences, Universidad Peruana Cayetano Heredia. The hypocotyls correspond to the RM, YM and BM varieties. The vouchers for red Maca (IFV, 2378) yellow Maca (IFV 1885) and black Maca (IFV 2374) were deposited at the Department. An aqueous extract of the hypocotyls was prepared for each variety. In brief, 100 g of the dried pulverised hypocotyls was placed in a container with 600 ml of water, and boiled for 60 min. Each preparation was left standing to cool, filtered and freeze-dried. One gram of dried hypocotyls of RM, YM and BM produced 0.40, 0.36 and 0.56 g of freeze-dried aqueous extract respectively. The freeze-dried maca extracts were further diluted to obtain a dose equivalent to 1 g raw material/kg BW in around 2 ml of the vehicle. These solutions were placed in small vials and kept in a refrigerator at 4 C until use. Daily sperm production To calculate DSP, one testis (left testis) was homogenised in 10 ml of 0.9% saline-0.05% (v/v) Triton X-100 solution using a homogeniser ( Ò THOMAS, NJ, USA). After a 1/10th dilution, the number of homogenisation-resistant elongated spermatid nuclei was determined with a haemocytometer. Counts for four haemocytometer chambers were averaged. Daily sperm production and its efficiency (DSP/g testis) were determined by division of the elongated spermatid count per testis and spermatids per g testis by 6.3 days, which reflects the spermatogenesis time during steps spermatids for Holtzman rats (Kubota et al., 2003; Takahashi & Oishi, 2003). The epididymal sperm transit rate was calculated by dividing the cauda epididymal sperm number by the daily sperm production (Dalsenter et al., 2003). Epididymal sperm count Caput-corpus and cauda epididymis were separated and homogenised. Homogenisation was performed in 5 ml saline (NaCl 0.9%). Homogenates were kept refrigerated at 4 C for 24 h to allow the release of sperm from the walls. Then, 5 ml of eosine (2%) was added and vortexed. One ml of this mixture was diluted with 3 ml eosine (2%) and a sample was placed in a Neubauer chamber and head sperms were counted in 25 squares. Sperm counts in the 25 squares were multiplied by 0.06 (sperm 10 6 ml )1 ) and then by 5 ml (sperm 10 6 /caput/corpus or cauda). Data were calculated as sperm/epididymis ¼ sperm per caput/corpus plus sperm per cauda epididymis. Journal Compilation ª 2007 Blackwell Publishing Ltd Æ Andrologia 39, No claim to original Peruvian government works

20 M. Gasco et al. Effect of chronic treatment with three varieties of Lepidium meyenii Vas deferens sperm count Vas deferens was dissected in two parts (thin and thick), one corresponding to the proximal region (thin part) and the second to the distal region (thick part). Each part was sectioned and placed in a tube with 1 ml of saline. In brief, 2 ml of eosin (2%) was placed in the tube with the sample; this tube was waved in a vortex ( Ò SYBRON, Iowa, IA, USA). Sperm heads were counted in the 25 squares of the Neubauer chambers. Four chambers were measured in each sample and they were averaged. Results from each part (thin and thick) were multiplied by 0.03 and defined as sperm 10 6 /part of vas deferens. Data were expressed as total amount of sperms in vas deferens (sperm count in thin deferens + sperm count in thick deferens). Preparation of samples for DNA quantification The tissue samples were obtained from the right testis of rats treated with the three varieties of Maca (RM, YM and BM). The tissue was collected immediately after the death of the animal; 7 mg of tissue was used to extract DNA and two samples per animal were collected. Testis DNA extraction and purification All samples were collected in Eppendorf tubes. DNA extraction and purification were performed as indicated by the manufacturer using Gene Elute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit (Sigma, St. Louis, MI, USA). Pure Mammalian Genomic DNA was obtained at the end of the process. Samples were kept frozen at )20 C for further quantification and gel electrophoresis. DNA quantification The DNA obtained in the previous step was diluted in the Elution Solution included in each kit (Gene Elute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit; Sigma). The genetic material was quantified by spectrophotometer analysis (260 and 280 nm). An absorbance of 1 in a 1 ml quartz cuvette is equivalent to 50 lg of double stranded DNA. The purity of the samples was determined by the ratio of Abs260 nm/abs280 nm. Electrophoresis for the assessment of DNA integrity Genomic DNA purified from rat testis was analysed on a 1% agarose gel to illustrate the yield and integrity of DNA. Three microlitres of the solution containing the DNA was used per lane in the electrophoresis. The electrophoresis gels were prepared as described. The gel was immersed in tris borate EDTA buffer in an electrophoresis chamber. The samples (3 ll of solution with purified DNA per lane) were mixed with methylene blue, collocated in the gel and an electric field was applied. After 30 min (for the voltage used), the electric field was turned off and the gels were exposed to ethidium bromide. The DNA was visualised by exposing it to ultraviolet light. Histological study Left testis, epididymis and liver were excised and dissected free of fat. These organs were immersion-fixed in Bouin s fixative. After dehydration, the organs were embedded in formol (18%). The tissue blocks were sectioned into 5 lm thickness and stained with hematoxylin and eosine (H&E), and then observed under a light microscope. For testes, tubular area (lm 2 ) and lumen area (lm 2 ) were measured by sampling 10 random sections for each rat. In the epididymis, 10 random sections with 10 measurements of epididymal tubular areas were measured (lm 2 ). All assessments were performed using an axiostar plus microscope (Carl Zeiss, Thornwood, NY, USA). The images were captured by a Moticam2000 (Richmond, BC, Canada) coupled to a personal computer. Motic image plus 2.0 software (Motic Instruments Inc., Xiamen, China) was used for measurements of testicular seminiferous tubule area, duct luminal area and epididymal tubular area from the caudal segment, and anova test was used for statistical analysis. Statistical analysis Data were analysed using the statistical package STATA (version 8.0) for personal computer (Stata Corporation, College Station, TX, USA). Data are presented as mean ± standard error of the mean (SEM). Homogeneity of variances was assessed by the Bartlett test. If variances were homogeneous, differences between groups were assessed by two-way analysis of variance (anova) test. Differences between pair of means were assessed by the Scheffé test. In addition, Pearson s correlation was performed to analyse the relationship between DSP and total DNA. P < 0.05 was considered to be statistically significant. Results All animals showed an increase in body weight after 84 days of treatment. The average weight gain was ± g (mean ± SD). The weight of reproductive Journal Compilation ª 2007 Blackwell Publishing Ltd Æ Andrologia 39, No claim to original Peruvian government works 153