Metodologie citogenetiche. Metodologie molecolari. Formulare la domanda Utilizzare la metodica appropriata

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1 In base al potere di risoluzione della tecnica Metodologie citogenetiche Metodologie molecolari Formulare la domanda Utilizzare la metodica appropriata 1

2 DNA RNA PROTEINE DNA Cromosomi (cariotipo, FISH, CGH) Geni (analisi di mutazioni specifiche o ricerca di mutazioni in un gene candidato) Genomi (Genomica Strutturale, Genomica funzionale, Genomica comparata) RNA Studi espressione di un singolo gene codificante proteine (o di pochi geni) Studi di RNA non codificanti Trascrittomica (studi di espressione di tutti i trascritti presenti in una specifica cellula in uno specifico momemento) Proteine Analisi Western - Microscopia Proteomica 2

3 Metodologie molecolari Analisi Southern (DNA) Analisi Northern (RNA) Analisi Western (Proteine) PCR (DNA) RT-PCR (RNA) Microarray (DNA RNA Proteine) 3

4 Sonde Molecolari Sequenze nucleotidiche marcate a singolo filamento in grado di riconoscere sequenze complementari 4

5 5

6 Denaturazione di una molecola di acido nucleico a doppia elica Rinaturazione o ibridazione di polinucleotidi a filamento singolo in una molecola a doppia elica 6

7 Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare 7 Piccin Nuova Libraria S.p.A.

8 Marcatura Radioisotopi ( 32 P, 3 H, 35 S) Fluorescenti (biotina-avidina) Chemiluminescenti (fosfatasi alcanica) 8

9 Analisi Southern Estrazione del DNA Quantificazione e Controllo Qualità Digestione con Enzimi di Restrizione Elettroforesi preparativa Trasferimento del DNA dal gel ad un supporto di nylon Ibridazione con la sonda Autoradiografia 9

10 Enzimi di Restrizione Endonucleasi che riconoscono e tagliano il DNA a livello di specifiche sequenze 10

11 Elettroforesi 11

12 Elettroforesi di DNA genomico umano tagliato con enzimi di restrizione 12

13 13

14 Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare 14 Piccin Nuova Libraria S.p.A.

15 Immagine ottenuta dopo: ibridazione della membrana con una specifica sonda esposizione della membrana su lastra autoradiografica sviluppo della lastra 15

16 Diagnosi di malattie da espansione di triplette ripetute 16

17 Analisi Northern Estrazione dell RNA totale Isolamento degli mrna o Arricchimento dei mirna Elettroforesi Trasferimento del RNA dal gel ad un supporto di nylon Ibridazione con la sonda Autoradiografia 17

18 Elettroforesi di RNA totale 18

19 19

20 Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare 20 Piccin Nuova Libraria S.p.A.

21 Limiti Notevole quantità di DNA - RNA Proteine (numero elevato di cellule da analizzare) Uso di sostanze radioattive Tempo impiegato 21

22 PCR - Polymerase Chain Reaction ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). Questa tecnica, utilizzando i principi della duplicazione del DNA, permette di ottenere in poco tempo notevoli quantità di materiale specifico 22

23 23

24 PCR schema 24

25 25

26 DNA bersaglio Primers Enzima Nucleotidi trifosfati Ioni Mg ++ 26

27 DNA bersaglio Campione Primers Oligonucleotidi sintetici complementari a sequenze fiancheggianti il tratto di DNA da studiare bp Enzima DNA polimerasi Nucleotidi trifosfati 27

28 28

29 29

30 Termociclatori Denaturazione del DNA (94 C) Ibridazione dei primers al bersaglio (40 C 60 C) Sintesi del DNA (72 C) 30

31 Denaturazione Ibridazione Sintesi Denaturazione Ibridazione Sintesi 31

32 Vantaggi Si può evitare l uso di tecniche più laboriose. Velocità di esecuzione Si possono analizzare campioni di poche cellule (anche 1 cellula). Elevata sensibilità 32

33 Biopsie Analisi prenatale e Analisi preimpianto Tracce di infezioni virali Malattia mimima residua Medicina forense 33

34 Real Time PCR 34

35 Permette di quantificare il DNA del campione analizzato Ricerca di DNA virali Ricerca di OGM negli alimenti 35

36 RT-PCR Reverse transcription-pcr 36

37 Sequenziamento 37

38 Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare 38 Piccin Nuova Libraria S.p.A.

39 Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare 39 Piccin Nuova Libraria S.p.A.

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