Principi E Procedure. Materiali E Metodi

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1 Identificazione Prodotto N Catalogo Descrizione Caldesmon 0,1 R (E89) Caldesmon 1 R (E89) Caldesmon RTU R (E89) Definizione Dei Simboli P C A E S DIL DOC# DIS pronto uso concentrato asciti siero supernatante range di diluizione di concentrato numero documento distribuito da Finalità D Uso Questo anticorpo è destinato per l uso diagnostico in vitro (IVD). Anticorpo Caldesmon è indicato per i laboratori qualificati per l identificazione qualitativa tramite microscopio ottico della presenza di antigeni associati in sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina utilizzando metodi di test IHC (immunoistochimici). L uso di questo anticorpo è indicato, in seguito a diagnosi clinica differenziale di patologie, come ausilio per l identificazione di tumori del tessuto muscolare liscio nel contesto di un pannello di anticorpi, dell anamnesi del paziente e di altri test diagnostici stabiliti da un patologo qualificato. Sommario E Spiegazione L anti-caldesmon è una proteina regolatrice che si trova nel muscolo liscio e in altri tessuti che interagiscono con actina, miosina, tropomiosina e calmodulina. L anticorpo anti-caldesmon etichetta il muscolo liscio e i tumori del muscolo liscio, differenziandoli in miofibroblastici e mioepiteliali. L anti-caldesmon è stata usata anche per differenziare l epitelioidmesotelioma dal carcinoma papillare sieroso delle ovaie. Principi E Procedure L anticorpo primario citato può essere utilizzato quale anticorpo primario per la colorazione immunoistochimica delle sezioni di tessuto fissate in formalina e incluse in paraffina. In generale, la colorazione immunoistochimica insieme al sistema di rilevazione biotinastreptavidina consente la visualizzazione degli antigeni tramite l applicazione sequenziale di un anticorpo specifico (anticorpo primario) all antigene, di un anticorpo secondario (anticorpo di collegamento) all anticorpo primario, un complesso enzimatico e un substrato cromogeno con fasi di lavaggio interposte. In alternativa può essere utilizzato un sistema di rilevamento privo di biotina. L attivazione enzimatica del cromogene causa la produzione di una reazione visibile sul sito dell antigene. Il campione può essere quindi contro colorato ed è possibile applicarvi del copri vetrino. I risultati vengono interpretati utilizzando un microscopio ottico e consentono la diagnosi differenziale dei processi patofisiologici, associabili o meno a un particolare antigene. I prodotti prediluiti sono diluiti in modo ottimale per l uso con un ampia varietà di kit di rivelazione offerti da altri produttori. Materiali E Metodi Per i dettagli specifici dei lotti dei seguenti, fare riferimento all etichetta del prodotto: 1. Concentrazione di immunoglobulina dell anticorpo 2. Dettagli sull origine Reagenti Forniti Prediluito Il prodotto anticorpo primario citato contiene il reagente pronto per l uso. Il tasso di concentrazione di immunoglobuline prediluite per questo prodotto è di 0,17-0,32 µg/ml. Concentrato Il prodotto anticorpo primario citato contiene reagente concentrato. DIS A.Menarini Diagnostics S.r.l. Via Sette Santi, Firenze Italy DOC# MEN IT Rev. 0,0 Cell Marque Corporation 6600 Sierra College Blvd Rocklin California USA EMERGO EUROPE Molenstraat 15, 2513 BH The Hague NL

2 Sia il formato prediluito sia quello concentrato di questo anticorpo sono diluiti in Tampone Tris, ph 7,3-7,7, con BSA 1% e azoturo di sodio <0,1%. Il tasso di concentrazione di immunoglobulina concentrata per questo prodotto è di 5,1-9,6 µg/ml. La gamma operativa di diluizione raccomandata per il prodotto concentrato è di 1:25-1:100 e si trova sull etichetta del prodotto. Isotipo: IgG Ricostituzione, Miscelazione, Diluizione, Titolazione L anticorpo prediluito è pronto all uso e ottimizzato per la colorazione. Non è necessaria alcuna ricostituzione, miscelazione, diluizione o titolazione. L anticorpo concentrato è ottimizzato per essere diluito entro il range di diluizione. L utente deve convalidare la diluizione operativa del prodotto concentrato. Differenze nelle procedure tecniche e nel trattamento del tessuto in laboratorio possono produrre importanti variabilità nei risultati e richiedere di conseguenza l uso regolare di controlli (fare riferimento alla sezione Procedure di controllo della qualità). Materiali E Reagenti Necessari Ma Non Forniti I seguenti reagenti e materiali possono essere necessari per la colorazione ma non sono forniti con l anticorpo primario: 1. di controllo positivo e negativo 2. Vetrini per microscopio, caricati positivamente 3. Forno per essicazione in grado di mantenere una temperatura di C ± 5 C 4. Ampolle o bagni di colorante 5. Timer 6. Xilene o sostituto di xilene 7. Etanolo o alcool reagente 8. Acqua deionizzata o distillata 9. Pentola a pressione elettrica per la fase di pretrattamento del tessuto 10. Sistema di rilevamento e cromogeno 11. Soluzioni per lavaggio 12. Ematossilina o altro contro colorante 13. Diluenti di anticorpi 14. Blocco perossido per uso con HRP 15. Blocco avidina-biotina 16. Reagente di controllo negativo 17. Soluzione montante 18. Copri vetrino 19. Microscopio ottico (40-400x) Conservazione E Manipolazione Conservare a 2-8 C. Non congelare. Per garantire un erogazione adeguata di reagente e la stabilità dell anticorpo dopo ciascuna analisi, riposizionare il tappo e riporre immediatamente il flacone in frigorifero in posizione verticale. Ogni reagente di anticorpi è provvisto di data di scadenza. Se conservato adeguatamente, il reagente resta stabile fino alla data indicata sull etichetta. Non utilizzare il reagente oltre la data di scadenza relativa al metodo di conservazione indicato. Non vi sono segni evidenti che indichino l instabilità di questo prodotto. Pertanto, è consigliabile eseguire contemporaneamente controlli positivi e negativi sui campioni da testare. Contattare il Servizio Clienti A.Menarini Diagnostics in caso di segni sospetti d instabilità del reagente. Prelievo Di Campioni E Preparazione Per L Analisi I tessuti ordinariamente trattati, fissati in formalina tamponati neutri, inclusi in paraffina sono adatti all uso con questo anticorpo primario. Il fissativo consigliato per i tessuti è formalina neutra tamponata al 10%. È possibile che si ottengano risultati variabili dovuti a processi di fissaggio prolungati o speciali come la decalcificazione di preparati di midollo osseo. Ogni sezione va tagliata per garantire uno spessore adeguato (circa 3 μm) e posizionata su un vetrino con carica positiva. I vetrini contenenti la sezione di tessuto possono essere cotti per almeno 2 ore (ma non oltre le 24 ore) in un forno a una temperatura di C ± 5 C. Avvertenze E Precauzioni 1. Manipolando i reagenti adottare ragionevoli precauzioni. Quando si manipolano materiali sospetti carcinogeni o tossici (ad esempio xilene) servirsi di guanti monouso e di grembiuli di laboratorio. 2. Evitare il contatto di reagenti con occhi e membrane di mucose. Se i reagenti vengono a contatto con aree sensibili, lavare con abbondante acqua corrente. 3. I campioni dei pazienti e tutti i materiali che entrano a contatto con loro devono essere manipolati come materiali a rischio biologico e smaltiti con adeguate precauzioni. Non pipettare mai con la bocca. 4. Evitare la contaminazione microbica di reagenti, per non causare risultati scorretti. 5. L utente è tenuto a convalidare i tempi di incubazione e le temperature. 6. I reagenti prediluiti, pronti all uso sono stati diluiti in modo ottimale e un ulteriore diluizione può causare una perdita di colorazione antigenica. 7. I reagenti concentrati possono essere diluiti in modo ottimale in base alla convalida dell utente. Qualsiasi diluente utilizzato non specificatamente raccomandato da questo documento deve essere quindi convalidato dall utente sia per la compatibilità sia per l effetto sulla stabilità. 8. Se utilizzato secondo le istruzioni il prodotto non è classificato come sostanza pericolosa. Il conservante nel reagente è azoturo di sodio in misura inferiore allo 0,1% e alle concentrazioni dichiarate non soddisfa i criteri UE REACH (registrazione, valutazione, autorizzazione e restrizione delle sostanze chimiche) per le sostanze pericolose. 2

3 9. L utente deve convalidare qualunque condizione di conservazione diversa da quelle specificate nel foglietto illustrativo. 10. Il diluente può contenere albumina di siero bovino e il supernatante può contenere siero bovino. I prodotti contenenti siero bovino fetale e i prodotti contenenti albumina di siero bovino vengono acquistati presso fornitori commerciali. I certificati di origine della sorgente animale utilizzata in questi prodotti sono nell archivio di Cell Marque. I certificati sostengono che le origini bovine provengono da Paesi che presentano un rischio trascurabile di BSE e dichiarano che le origini bovine sono statunitensi e canadesi. 11. Come per qualsiasi prodotto derivato da sorgenti biologiche, è necessario seguire procedure corrette di manipolazione. Istruzioni Per L uso Procedura Passo-Passo Protocollo di colorazione raccomandato per l anticorpo primario citato: Colorazione Manuale 1. Deparaffinizzazione, reidratazione e recupero dell epitopo; il metodo preferito è l utilizzo delle tecniche di smascheramento termoindotto dell epitopo (HIER, Heat Induced Epitope Retrieval). Il metodo preferito consente nello stesso tempo la deparaffinizzazione, la reidratazione e il recupero dell epitopo. Al termine, sciacquare 5 volte con acqua distillata o deionizzata. 2. Se si utilizza un sistema di rilevamento HRP, collocare i vetrini in un bloccante perossido per 10 minuti, quindi sciacquare. Se si utilizza un sistema di rilevamento AP, saltare questo passaggio. 3. Applicare l anticorpo e incubare per minuti, quindi sciacquare. 4. Per la rivelazione del polimero in 2 fasi, il sistema applica l amplificatore in base alle istruzioni del produttore 5. Applicare il reagente di rivelazione per il numero di minuti raccomandato dal produttore, quindi sciacquare. 6. Applicare una quantità generosa di cromogeno e incubare per 1-10 minuti, quindi sciacquare. 7. Disidratare e applicare il vetrino coprioggetto. Procedure Di Controllo Della Qualità Controllo Positivo Del È necessario effettuare un controllo positivo del tessuto per ciascuna procedura di colorazione eseguita. Il tessuto può contenere sia cellule che componenti con colorazione positiva e negativa e serve sia come tessuto di controllo positivo che negativo. I tessuti di controllo devono provenire da un autopsia recente, da una biopsia o da campioni chirurgici preparati o fissati prima possibile, in modo identico alle sezioni da esaminare. L uso di una sezione di tessuto fissata o trattata diversamente dai campioni da esaminare, servirà per fornire un controllo di tutti i reagenti e le fasi del metodo, eccetto il fissaggio e il trattamento del tessuto. Un tessuto con una colorazione positiva debole è più indicato per effettuare un controllo ottimale della qualità e per rilevare livelli minori di degradazione del reagente. Il controllo tissutale positivo per l anticorpo primario citato, può comprendere quanto segue: Controllo Positivo Del Appendice Seno Visualizzazione Citoplasmatico Citoplasmatico Utilizzare i controlli positivi noti solo per monitorare le adeguate prestazioni dei tessuti trattati e dei reagenti del test, non come aiuto per formulare una diagnosi specifica dei campioni del paziente. Se i controlli positivi del tessuto non si colorano positivamente in modo adeguato, i risultati con i campioni da esaminare devono essere considerati non validi. Controllo Negativo Del Per il controllo negativo del tessuto, è possibile impiegare lo stesso tessuto utilizzato per il controllo positivo del tessuto. La varietà di tipi di cellule presenti nella maggior parte delle sezioni dei tessuti forniscono siti di controllo negativi, che devono essere tuttavia verificati dall utente. I componenti che non si colorano devono dimostrare l assenza di colorazione specifica e fornire un indicazione sulla colorazione di fondo non specifica. Se è presente una colorazione specifica nei siti di controllo negativi del tessuto, i risultati con i campioni del paziente devono essere considerati non validi. Discrepanze Inspiegabili Segnalare immediatamente all assistenza clienti di A.Menarini Diagnostics tutte le discrepanze inspiegabili rilevate nei controlli. Se i risultati del controllo di qualità non soddisfano le specifiche, i risultati del paziente non sono validi. Vedere la sezione Risoluzione dei problemi di questo inserto. In tal caso, è necessario identificare e correggere il problema e ripetere l intera procedura con i campioni del paziente. Reagente Di Controllo Negativo È necessario eseguire un controllo negativo del reagente per ciascun campione per riuscire a interpretare meglio i risultati. Per valutare colorazioni non specifiche viene utilizzato un controllo negativo del reagente invece dell anticorpo primario. Il vetrino dovrà essere trattato con controllo negativo del reagente, abbinandosi alle specie ospiti dell anticorpo primario e avendo idealmente la stessa concentrazione di IgG. Il periodo di incubazione del reagente di controllo negativo deve essere uguale a quello dell anticorpo primario. Interpretazione Dei Risultati La procedura di immunostaining causa la precipitazione di un prodotto di reazione colorato ai siti antigenici localizzati dall anticorpo primario. Fare riferimento al foglietto illustrativo del sistema di rilevamento per reazioni del colore previsto. È opportuno che un patologo qualificato esperto in procedure immunoistochimiche valuti i controlli su tessuti positivi e negativi prima di interpretare i risultati. Controllo Positivo Del Esaminare prima il controllo positivo del tessuto colorato per determinare se tutti i reagenti funzionano correttamente. La presenza di un prodotto di reazione con colorazione appropriata nelle cellule target indica una reattività positiva. Fare riferimento al foglietto illustrativo del sistema 3

4 di rilevamento per reazioni del colore previsto. A seconda della durata del periodo di incubazione e della potenza dell ematossilina utilizzata, la contro colorazione darà luogo ad una colorazione da azzurro chiaro a blu scuro nei nuclei delle cellule. Una contro colorazione eccessiva o incompleta può compromettere l interpretazione corretta dei risultati. Se il controllo positivo del tessuto non si colora positivamente, i risultati con i campioni da esaminare sono considerati non validi. Controllo Negativo Del Dopo il controllo positivo del tessuto, è necessario esaminare quello negativo per verificare la marcatura specifica dell antigene target dall anticorpo primario. L assenza di colorazione specifica nel controllo negativo del tessuto conferma l assenza di reattività crociata tra l anticorpo e le cellule o i componenti cellulari. Se si nota una colorazione specifica nel controllo negativo del tessuto, i risultati con i campioni del paziente sono considerati non validi. La colorazione non specifica, se presente, sarà diffusa. Nelle sezioni di tessuto che non sono fissate in maniera ottimale, il tessuto connettivo potrebbe presentare una lieve colorazione sporadica. In questo caso è necessario utilizzare le cellule intatte per interpretare i risultati della colorazione. Le cellule necrotiche o degenerate mostrano una colorazione non specifica. Del Paziente I campioni del paziente devono essere esaminati per ultimi. L intensità della colorazione positiva dovrà essere valutata nel contesto di qualsiasi colorazione di fondo del controllo negativo del reagente. Come in qualsiasi altro test immunoistochimico, un risultato negativo indica che l antigene in questione non è stato rilevato, non che l antigene è assente nelle cellule o nei tessuti esaminati. Un pannello di anticorpi può aiutare nell identificazione di false reazioni negative (vedere la sezione Sintesi dei risultati previsti). È necessario anche esaminare la morfologia di ciascun campione del tessuto utilizzando una sezione colorata con ematossilina ed eosina durante l interpretazione dei risultati immunoistochimici. I risultati morfologici del paziente e i dati clinici pertinenti devono essere interpretati da un patologo qualificato. Limitazioni 1. Questo reagente è esclusivamente per uso professionale dal momento che l immunoistochimica è un processo a fasi multiple che richiede una formazione specialistica per la scelta adeguata di reagenti, tessuti, fissaggio, trattamenti; della preparazione del vetrino per immunoistochimica e dell interpretazione dei risultati di colorazione. 2. Ad uso esclusivo di laboratorio. 3. Esclusivamente per uso diagnostico in vitro. 4. La colorazione del tessuto dipende dalla manipolazione e dal trattamento precedenti del tessuto. Fissaggio inadeguato, congelamento, scongelamento, lavaggio, asciugatura, riscaldamento, sezionamento o contaminazione con altri tessuti o fluidi possono produrre artefatti, l intrappolamento dell anticorpo o risultati falsonegativi. Variazioni nel fissaggio e nei metodi di inclusione, come anche le irregolarità intrinseche del tessuto possono provocare risultati non uniformi. 5. Una contro colorazione eccessiva o incompleta può compromettere l interpretazione corretta dei risultati. 6. L interpretazione clinica di ogni colorazione positiva, o della sua assenza, deve essere valutata in un contesto anamnestico, morfologico e di altri criteri istopatologici, oltre che di altri test diagnostici. Questo anticorpo è destinato a essere utilizzato in un pannello di anticorpi, secondo il caso. Spetta al patologo qualificato assicurarsi di conoscere adeguatamente gli anticorpi, i reagenti, i pannelli diagnostici e i metodi utilizzati per produrre la preparazione colorata. È necessario eseguire la colorazione in un laboratorio certificato e autorizzato sotto la supervisione di un patologo responsabile della revisione dei vetrini colorati che garantisca l adeguatezza dei controlli positivi e negativi. 7. Anticorpi e reagenti pronti all uso sono forniti in diluizione ottimale per un utilizzo conforme a quanto specificato nelle istruzioni. Qualsiasi deviazione dalle procedure di analisi raccomandate può inficiare i risultati. È indispensabile utilizzare e documentare controlli appropriati. Gli utenti che comunque modificano le procedure di analisi consigliate si assumono ogni responsabilità per l interpretazione dei risultati. 8. Si forniscono prodotti concentrati in modo che l utente possa successivamente diluirli in maniera ottimale per l uso previsto nel rispetto di tecniche di validazione adeguate. Gli utenti sono tenuti a convalidare l utilizzo di eventuali diluenti diversi da quelli qui raccomandati. Dopo la convalida degli anticorpi primari per l uso, qualsiasi deviazione dalle procedure di analisi raccomandate può inficiare i risultati previsti. È indispensabile utilizzare e documentare controlli appropriati. Gli utenti che comunque modificano le procedure di analisi consigliate si assumono ogni responsabilità per l interpretazione dei risultati. 9. Questo prodotto non è destinato all uso nella citometria a flusso. 10. I reagenti possono presentare reazioni inattese in tessuti non precedentemente testati. La possibilità di reazioni inattese anche in gruppi di tessuti già testati non può essere eliminata completamente a causa della variabilità biologica dell espressione dell antigene in neoplasie o in altri tessuti patologici. In caso di reazioni sospette, inattese documentate, contattare l assistenza clienti di A.Menarini Diagnostics. 11. I tessuti di persone infette dal virus di epatite B e contenenti antigene di superficie dell epatite B (HBsAg) possono evidenziare una colorazione non specifica con perossidasi di rafano. 12. Se utilizzati in fasi di bloccaggio, i normali sieri della stessa origine animale, come l antisiero secondario, possono causare risultati positivi o negativi falsi a causa dell effetto degli autoanticorpi o degli anticorpi naturali. 13. È possibile che si ottengano falsi risultati positivi a causa di legami non immunologici di proteine o di prodotti di reazione al substrato. Essi possono anche essere causati dall attività di pseudoperossidasi (eritrociti), attività di perossidasi endogena (citocromo C) o di biotina endogena (ad esempio: fegato, cervello, seno, rene) in base al tipo di tecnica di immunostaining utilizzata. 14. Come in qualsiasi altro test immunoistochimico, un risultato negativo indica che l antigene in questione non è stato rilevato, non che l antigene è assente nelle cellule o nei tessuti esaminati. Limitazioni Specifiche 1. I prodotti di anticorpi prediluiti sono ottimizzati come prodotti pronti all uso. A causa della possibilità di variazione nella fissazione e 4

5 nel trattamento dei tessuti, potrebbe essere necessario aumentare o diminuire il tempo di incubazione dell anticorpo primario su campioni singoli. 2. L anticorpo, se utilizzato in combinazione con sistemi di rilevazione e relativi accessori, rileva antigeni che sopravvivono al normale fissaggio in formalina, al trattamento del tessuto e al sezionamento. Gli utenti che si discostano delle procedure di analisi consigliate sono responsabili per l interpretazione e la convalida dei risultati, esattamente come in qualsiasi altra circostanza. Studio Normale (continuato) Casi Positivi Totale di Casi Testato Placenta 0 1 Note Questo anticorpo colora numerosi tessuti normali, come indicato nella documentazione. Sintesi Dei Risultati Previsti Consultare le seguenti tabelle di reattività: Studio Normale Casi Positivi Totale di Casi Testato Cervello 0 1 Corteccia surrenale 0 1 Ovaia 0 1 Pancreas 0 1 Paratiroide 0 1 Pituitaria 0 1 Testicolo 0 1 Tiroide 0 1 Seno 1 1 Milza 0 1 Tonsilla 0 1 Timo 0 1 Midollo osseo 0 1 Polmone 0 1 Cuore 0 1 Esofago 0 1 Stomaco 0 1 Intestino tenue 0 1 Colon 0 1 Fegato 0 1 Ghiandola salivare 0 1 Cistifellea 0 1 Rene 0 1 Vescica 0 1 Prostata 0 1 Utero 0 1 Tuba di Falloppio 0 1 Uretere 0 1 Cervice 0 1 Muscolo scheletrico 0 1 Muscolo liscio 1 1 Cute 0 1 Nervo periferico 0 1 Mesotelio 0 1 Adipe 0 1 Note Studio Su Malato Casi Positivi Totale di Casi Testato Leiomioma 2 2 Leiomiosarcoma 2 2 Note Questo anticorpo colora tumori, come indicato nella documentazione. Risoluzione Dei Problemi 1. Se il controllo positivo mostra una colorazione più debole del previsto, controllare altri controlli positivi eseguiti durante la stessa colorazione per determinare se il problema dipende dall anticorpo primario o da uno dei reagenti secondari comuni. 2. Se il controllo positivo è negativo, è necessario controllare altri controlli positivi esaminati durante la stessa analisi per determinare se la causa dipende dall anticorpo primario o da uno dei reagenti secondari comuni. È possibile che i tessuti siano stati prelevati, fissati o deparaffinizzati in modo inappropriato. Seguire la procedura appropriata per prelevare, conservare e fissare i campioni. 3. Se si presenta un eccessiva colorazione di fondo, possono essere presenti livelli elevati di biotina endogena. Una fase bloccante di biotina dovrà essere inclusa a meno che non sia utilizzato un sistema di rilevamento privo di biotina; in questo caso la presenza di biotina non rappresenterebbe un fattore che contribuisce alla colorazione di fondo. 4. Se non è stata rimossa tutta la paraffina, è necessario ripetere l operazione di deparaffinazione. 5. Se le sezioni di tessuto ripuliscono il vetrino, controllare i vetrini per accertarsi che siano caricati positivamente. Tra le altre possibilità che potrebbero pregiudicare l adesione del tessuto vi sono un insufficiente essiccamento della sezione di tessuto sul vetrino prima della colorazione o un fissaggio in formalina neutra non adeguatamente tamponato. Anche lo spessore del tessuto potrebbe essere un fattore che contribuisce. Per azioni correttive, fare riferimento alla sezione Procedura passo-passo, o contattare il servizio clienti A.Menarini Diagnostics. 5

6 Technology Caldesmon (E89) Bibliografia 1 Comin CE, Saieva C, Messerini L. h-caldesmon, calretinin, estrogen receptor, and Ber-EP4: a useful combination of immunohistochemical markers for differentiating epithelioid peritoneal mesothelioma from serous papillary carcinoma of the ovary. Am J Surg Pathol Aug;3198): Watanabe K, Kusakabe T, Hoshi N, Saito A, Suzuki T. h-caldesmon in leio myosarcoma and tumors with smooth muscle cell-like differentiation: its specific expression in the smooth muscle cell tumor. Hum Pathol Apr;30(4): McCluggage WC. A critical appraisal of the value of immunohistochemistry in diagnosis of uterine neoplasms. Adv Anat Pathol May; 11(3): Miettinen M., Lasota J. Gastrointestinal stromal tumors: review on morphology, molecular pathology, prognosis, differential diagnosis. Arch Pathol Lab Med Oct; 130(10): Comin CE. et al. h-caldesmon, a useful positive marker in the diagnosis of pleural mesothelioma, epitheliod type. Am J Surg Pathol Apr; 30(4): Powered by Monoclonali di coniglio prodotti utilizzando la tecnologia Epitomics, Inc. coperta da brevetto No. 5,675,063 6