Fisiologia cellulare e Laboratorio di Colture cellulari

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1 Corso di laurea BIOTECNOLOGIE UNIVERSITA DEGLI STUDI DI TERAMO Fisiologia cellulare e Laboratorio di Colture cellulari Prof.ssa Luisa Gioia

2 CdL BIOTECNOLOGIE - II anno - C.I. FISIOLOGIA CELLULARE ED IMMUNOLOGIA (11 CFU) Modulo: Fisiologia cellulare e Laboratorio Colture Cellulari (6 CFU) Prof.ssa L. Gioia Modulo: Immunologia e Tecniche Immunologiche (5 CFU) Prof. P.G. Tiscar

3 Libri di testo per Fisiologia cellulare Zanichelli editore S.p.A. via Irnerio, Bologna tel / fax Zanichelli B. ALBERTS - A. JOHNSON - J. LEWIS - M. RAFF - K. ROBERTS - P. WALTER BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA (esiste anche la V edizione)

4 Libri di testo per Fisiologia cellulare FISIOLOGIA Molecole, cellule e sistemi Egidio D Angelo e Antonio Peres Edi-Ermes Editore Volume 1: Principi e Fisiologia cellulare (per background generale e ulteriore approfondimento: Volume 2: Funzioni d organo e integrazione sistemica)

5 Libri di testo per il Lab di COLTURE CELLULARI INTRODUZIONE ALLE COLTURE CELLULARI G.L. Mariottini, V. Capicchioni, L. Guida, F. Mattioli, S. Penco, P. Romano, L. Scarabelli II edizione - Tecniche Nuove "Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications" 6th Ed. book. R. Ian Freshney, Wiley-Liss, Inc., New York, NY, 2010

6 Alcune indicazioni pratiche Prenotazione esame finale on line obbligatoria all appello del C.I. Fisiologia cellulare e Immunologia ( NON PRENOTARSI ALL APPELLO DI FISIOLOGIA CELLULARE I né di STRUTTURA E FUNZIONE CELLULARE perché sono appelli relativi ad insegnamenti di precedenti ordinamenti!) Modalità di svolgimento esame finale di Fisiologia cellulare e Laboratorio Colture cellulari: -verifica orale per la parte di Fisiologia cellulare -verifica orale o scritta per la parte di Laboratorio di Colture cellulari Piattaforma e-learning PATTO prove di valutazione intermedie

7 Corso di laurea BIOTECNOLOGIE Fisiologia cellulare e Laboratorio di Colture cellulari UNIVERSITA DEGLI STUDI DI TERAMO IL MATERIALE CONTENUTO IN QUESTE DIAPOSITIVE E AD ESCLUSIVO USO DIDATTICO PER L UNIVERSITA DEGLI STUDI DI TERAMO. ALCUNE IMMAGINI CONTENUTE SONO STATE TRATTE DAI SEGUENTI LIBRI: Biologia molecolare della cellula Bruce Alberts et al. (Ed. Zanichelli) FISIOLOGIA Molecole, cellule e sistemi Egidio D Angelo e Antonio Peres (Edi-ermes) Introduzione alle colture cellulari - G.L. Mariottini et al. (Ed. Tecniche nuove) Cell Biology: a short course S.R. Bolsover et al. (Ed. Wiley-Blackwell)

8 Oggi sulla Terra vi sono da 10 a 100 milioni di specie viventi Gli organismi viventi appaiono straordinariamente diversi tra loro eppure tutti sono fatti di CELLULE The cell is the basic unit of life

9 CELLULE La conoscenza della struttura e delle funzioni delle cellule è stata resa possibile dallo sviluppo delle tecniche microscopiche Generalmente di dimensioni dell ordine dei µm (poche eccezioni) Una singola cellula può costituire un organismo vivente (microrganismi: batteri, lieviti, amebe) o milioni di cellule insieme possono essere organizzate in tessuti (organismi pluricellulari) Nei tessuti le cellule specializzate originano da cellule non specializzate (stem cells)

10 In base alla struttura cellulare gli organismi viventi si dividono in 2 gruppi principali: Vibrio cholerae PROCARIOTI Batteri E. coli EUCARIOTI Vegetali Funghi Animali Cellula eucariotica animale

11 Organizzazione delle cellule procariotiche ed eucariotiche From: Cell Biology A short course SR Bolsover et al. Wiley-Blackwell

12 DIMENSIONI DELLE CELLULE Cellule procariotiche: dimensioni 1-2 µm Cellule eucariotiche: dimensioni da 5 a100µm (mediamente 20µm) From: Cell Biology A short course SR Bolsover et al. Wiley-Blackwell

13 DIMENSIONI DELLE CELLULE E DEI LORO COMPONENTI

14 Scala tra cellule viventi e atomi e tipi di microscopio per la loro visualizzazione

15 La cellula osservata al microscopio ottico o al microscopio elettronico Il microscopio ottico usa luce visibile di lunghezza d onda di circa 500 nm ed ha un potere di risoluzione di circa 250 nm, pertanto consente di visualizzare solo i più grandi organelli intracellulari della cellula Il microscopio elettronico usa un fascio di elettroni ed ha un potere di risoluzione pari a circa 0,2 nm, pertanto consente di visualizzare l ultrastruttura degli organelli cellulari From: Cell Biology A short course SR Bolsover et al. Wiley-Blackwell

16 In tutti gli esseri viventi le STRUTTURE della cellula sono in stretta relazione con le loro FUNZIONI «Una struttura senza la funzione è un cadavere, mentre la funzione senza una struttura è un fantasma»: questa simbiosi avviene a tutti i livelli di organizzazione, da quello molecolare a quello dell individuo ogni sistema biologico è il risultato di struttura, funzione e dinamica

17 Nelle cellule i parametri chimico-fisici fondamentali (temperatura, ph, composizione dei liquidi intra ed extracellulari) devono essere mantenuti pressochè costanti affinchè vengano mantenute le funzioni cellulari fisiologiche OMEOSTASI animali meno avanzati nella scala evolutiva hanno minore capacità omeostatica

18 La cellula ed il genoma Gli esseri viventi si riproducono trasmettendo la loro informazione genetica alla progenie La cellula è l unità minima che si riproduce Ogni cellula esistente sulla Terra conserva tutte le sue informazioni nella stessa forma chimica, il DNA, una molecola a doppio filamento

19 Gli esseri viventi si riproducono trasmettendo la loro informazione genetica alla progenie Ogni cellula esistente sulla Terra conserva tutte le sue informazioni nella stessa forma chimica, il DNA, una molecola a doppio filamento

20 Il DNA nelle cellule eucariotiche è contenuto nel nucleo e può essere evidenziato mediante colorazioni specifiche

21 alcune informazioni. La molecola a doppia elica del DNA se srotolata sarebbe lunga 1,8 metri! in essa sono scritte sotto forma di geni le istruzioni necessarie a determinare tutte le nostre caratteristiche Il genoma degli Eucarioti è ricco di porzioni di DNA che hanno solo funzioni di regolazione I geni umani sono (batteri: geni) Più di 200 famiglie di geni sono in comune tra tutti gli organismi viventi carattere Alcuni geni evolvono rapidamente, altri sono altamente conservati geni proteine ambiente

22 ORGANISMI PLURICELLULARI sono organizzati in modo progressivamente più complesso cellula tessuti organo apparati organismo

23 La cellula è l unità minima che si riproduce

24 CICLO CELLULARE duplicazione DNA 2 cellule figlie aventi le stesse informazioni genetiche della cellula madre

25 Tutte le cellule di un organismo derivano da un unica cellula (zigote) da cui si sviluppa l embrione Tutte le cellule dell organismo possiedono pertanto lo stesso patrimonio genetico eppure.

26 differenziamento

27 FLUSSO DELL INFORMAZIONE GENETICA DNA RNA proteine Tutte le cellule trascrivono porzioni del proprio materiale genetico in una stessa forma intermedia: l RNA Tutte le cellule allo stesso modo traducono l RNA in proteina Il frammento di informazione genetica corrispondente ad una proteina è il GENE

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29 Le cellule contengono 4 famiglie di piccole molecole organiche: 1. zuccheri (fonte di energia e subunità dei polisaccaridi) 2. acidi grassi (componenti delle membrane cellulari) 3. amminoacidi (subunità delle proteine) 4. nucleotidi (subunità del DNA ed RNA) Le macromolecole sono costituite da queste piccole molecole legate insieme in lunghe catene zuccheri acidi grassi amminoacidi nucleotidi polisaccaridi Grassi, lipidi, membrane proteine Acidi nucleici (DNA, RNA)

30 Le caratteristiche universali delle cellule La vita richiede energia libera Le cellule funzionano come fabbriche biochimiche che utilizzano le stesse unità molecolari di base zuccheri acidi grassi amminoacidi nucleotidi polisaccaridi grassi, lipidi, membrane proteine acidi nucleici (DNA, RNA) Una macromolecola è formata da più molecole organiche (monomeri) legati insieme da legami covalenti in lunghe catene macromolecole

31 Le caratteristiche universali delle cellule Tutte le cellule Contengono 4 famiglie principali di piccole molecole organiche zuccheri (fonte di energia e subunità dei polisaccaridi) acidi grassi (componenti delle membrane cellulari) amminoacidi (subunità delle proteine) nucleotidi (ATP; subunità del DNA ed RNA) Le piccole molecole organiche sono basate sul carbonio ; sono essenzialmente le stesse per ogni specie vivente; sono tutte costituite da una piccola serie di atomi legati tra loro con legami covalenti.

32 Una macromolecola è dissociata per IDROLISI dei legami che la tengono unita (reazioni catalizzate da enzimi specifici) idrolisi rottura di un legame per intervento dell acqua reazioni catalizzate da enzimi specifici

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34 Tutte le cellule sono fatte principalmente di acqua

35 Le proteine svolgono diverse funzioni nella cellula Catalizzatori delle reazioni Componenti strutturali Produzione di movimento Diffusione piccole molecole fuori e dentro la cellula Comunicazione cellula/cellula e cellula/ambiente Sistema immunitario Altro -ENZIMI -TUBULINA, ISTONI -MIOSINA/ACTINA (muscolo) -CANALI E POMPE DI MEMBRANA -NEUROTRASMETTITORI -RECETTORI -ANTICORPI -ORMONI, TOSSINE, La forma di una proteina è determinata dalla sequenza dei suoi amminoacidi Le proteine si ripiegano nella conformazione con energia libera più bassa

36 LA MEMBRANA CELLULARE Tutte le cellule sono delimitate da una membrana plasmatica attraverso la quale devono passare nutrienti e materiali di rifiuto continui processi di trasporto bidirezionali

37 Tutte le cellule sono racchiuse da una MEMBRANA PLASMATICA (membrana cellulare) Struttura comune generale: film di molecole lipidiche e proteiche tenute insieme principalmente da interazioni non covalenti I lipidi di membrana più abbondanti sono i fosfolipidi Le membrane delle cellule eucariote contengono anche COLESTEROLO

38 Struttura dei FOSFOLIPIDI Orientamento dei fosfolipidi nelle membrane Struttura di un ACIDO GRASSO (acido palmitico)

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41 Struttura di un ACIDO GRASSO (acido palmitico)

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43 Le membrane biologiche sono come liquidi bidimensionali Fluidità di membrana Rapida diffusione laterale spontanea dei fosfolipidi Flip-flop raro in assenza dei traslocatori dei fosfolipidi

44 Traslocatori dei fosfolipidi: catalizzano il trasferimento attraverso il bilayer enzimi

45 Le membrane biologiche sono come liquidi bidimensionali Fluidità di membrana Colesterolo regola la plasticità delle membrane La composizione della M. è varia: diversi fosfolipidi con ruolo strutturale (fosfatidilserina carica negativa); inositol fosfolipidi (ruolo importante nel signaling)

46 Il doppio strato lipidico di molte membrane cellulari contiene anche COLESTEROLO struttura del colesterolo aumenta le proprietà di barriera di permeabilità del doppio strato lipidico Le membrane plasmatiche dei batteri non contengono colesterolo

47 MEMBRANA CELLULARE asimmetria del bilayer domini specializzati

48 Asimmetria del bilayer Molte molecole sono localizzate prevalentemente su uno dei versanti del bilayer (ad es. alcuni fosfolipidi); i GLICOLIPIDI si trovano solo sul versante extracellulare; alcuni enzimi sono legati solo sul versante citosolico (es. la PKC) molti animali sfruttano l asimmetria dei fosfolipidi per distinguere cellule vive e morte apoptosi

49 Asimmetria della membrana cellulare

50 Saggio con l Annexin V A seguito dell incubazione con Annexin V nelle cellule vengono marcate in verde la PS e la PE esposte sul versante extracellulare (in questo esperimento un altro colorante rosso marca l intera membrana) L esposizione della PS e PE rappresenta un marker di cellula apoptotica Gadella and Harrison, (2002) Le cellule apoptotiche vengono riconosciute ed eliminate da cellule specializzate dell organismo (es. macrofagi)

51 Asimmetria del doppio strato lipidico: molti enzimi, ad es. PLC, PKC sono legati solo sul versante citosolico e sono generalmente coinvolti nei meccanismi di trasduzione della cellula Fosfolipasi (importanti per il signaling)

52 Zattere lipidiche (raft lipidici): piccole aree specializzate della membrana in cui si concentrano alcuni lipidi (soprattutto colesterolo sfingolipidi e gangliosidi) e proteine Caveole: sottoclasse di raft lipidici che contengono caveolina e dirigono la formazione di vescicole cellulari

53 Nella M. plasmatica sono presenti zone specializzate dalle quali originano VESCICOLE: le vescicole pinocitiche possono formarsi da fosse rivestite di clatrina; in altri casi le vescicole possono formarsi da zone dette CAVEOLE (piccole cavità)

54 pharmrev.aspetjournals.org

55 Asimmetria del bilayer I GLICOLIPIDI sono localizzati esclusivamente sul versante extracellulare del bilayer

56 La superficie cellulare è rivestita da residui di zuccheri (glicoproteine, glicolipidi, proteoglicani) GLICOCALICE Funzione protettiva contro danni meccanici e chimici Tiene a distanza corpi estranei e altre cellule, impedendo interazioni proteina-proteina non desiderate Alcune delle catene oligosaccaridiche sono riconosciute dalle LECTINE (proteine che legano carboidrati di membrana) che aiutano a mediare eventi di adesione cellulare

57 Funzioni della membrana cellulare Delimita la cellula Trasporto: attraverso la membrana avviene il trasporto di sostanze tra l interno della cellula e l ambiente esterno Raccoglie segnali dall esterno (recettori) e trasferisce le informazioni alla cellula Ruolo funzionale fondamentale proteine

58 Le PROTEINE possono essere associate con il doppio strato lipidico in diversi modi questo tipo di conformazione si presta a cambiamenti conformazionali conformazioni α elica barile β proteine transmembrana questo tipo di conformazione è rigida e poco si presta a cambiamenti conformazionali

59 Molte proteine transmembranarie sono glicosilate (i residui di zuccheri vengono aggiunti nel lume del RE e nel Golgi) L ambiente citosolico è riducente (bassa probabilità che si formino ponti S-S)

60 Le proteine di membrana possono essere solubilizzate con un DETERGENTE (distruggono il doppio strato lipidico e portano le proteine in soluzione come complessi detergente-lipide-proteina) I detergenti sono molecole anfipatiche che in acqua formano micelle I 2 detergenti più usati sono il TRITON X-100 (blando detergente non ionico) e il SDS (forte detergente ionico)