RICERCA DI CEPPI ALTOPRODUTTORI

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1 RICERCA DI CEPPI ALTOPRODUTTORI Metodiche random / Metodiche ricombinanti preferibile disporre di ceppi preselezionati prodotti a basso valore aggiunto ridurre i tempi e i costi esempio: 1,3 propandiolo (1,3-PD) da Eneterobacteriaceae (Klebsiella pneumoniae) Preselezione in base all ORP (potenziale redox) essendo 1,3-PD prodotto nel ramo bioriduttivo selezionati i mutanti con ORP inferiori al ceppo parentale in quanto un ambiente + riduttivo dovrebbe favorire la produzione

2 1. Mutagenesi ceppo parentale (5% sopravvivenza) 2. Colonie inoculate in aerobiosi 2h e trasferite in fermentatore 1. ORP -240 mv (rapporto flussi N2/aria) 2. ORP -280 mv (rapporto flussi N2/aria e aggiunte di NaBH4 e NaOH) 3. In prima fase esponenziale trasferite su terenno agarizzato 4. Colonie ottenute previa crescita aerobica (8h) trasferite in anaerobiosi (36h) per valutarne la produzione di 1,3-PD

3 Solo i mutanti ottenuti da ORP -280mV mostravano migliore produttività! O = ceppo parentale V = media dei mutanti

4 METODI DI CONSERVAZIONE DEI CEPPI A basse T Forma anidra Agar slopes (4 C o -20 C) refresh 6-12 mesi H2O sterile (4 C) spore Azoto liquido (-180 C) Criopreservanti: DMSO, PEG, Gly Terreno deidratato Liofilizzazione

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15 La fermentazione alcolica: downstream Recupero prodotto per DISTILLAZIONE Processo di separazione di una o più sostanze da una miscela liquida sfruttando i loro differenti punti di ebollizione Acqua ed alcol sono liquidi miscibili fra loro in tutte le proporzioni e con punti di ebollizione vicini (rispettivamente per p = 1 atm di 100 C e 78,3 C). La separazione per distillazione procede fino ad ottenere una miscela composta dal 96,6% in peso di alcol ed il 4,4% in peso di acqua. Tale miscela è detta azeotropica

16 LA DISTILLAZIONE SEMPLICE La distillazione semplice comprende due stadi: Vaporizzazione della miscela; Condensazione dei vapori nel condensatore. La distillazione semplice è poco efficace per separare ed ottenere sostanze liquide con elevato grado di purezza da una miscela, soprattutto se i loro punti di ebollizione - come nel caso di acqua ed alcol etilico - sono abbastanza vicini.

17 LA DISTILLAZIONE FRAZIONATA 1. Vaporizzazione 2. Frazionamento dei vapori 3. Liquefazione del vapore Soluzione verde = miscela liquido blu (t. eb. = 80 ºC; bassobollente) e liquido giallo (t. eb = 100 ºC; altobollente). Il vapore entra nella colonna di frazionamento, inizia a raffreddarsi ed a condensare. Il componente più altobollente condensa e quello più bassobollente sale. Risalendo la colonna, il componente giallo ed il componente blu si separano. Il componente giallo condensa e ricade nel bollitore; il componente blu distilla e viene raccolto.

18 COLONNE DI DISTILLAZIONE T2>T1 T1 T2 1. Ingresso miscela dal centro 2. Liquido e vapore in controcorrente 3. Evaporazione (+ volatile)/ Condensazione (-volatile) 4. Rettifica (elevata concentrazione + volatile) 5. Stripping (bassa concentrazione + volatile) 6. Condensatore (ad acqua fredda) 7. Evaporatore (a vapore)

19 LA PRODUZIONE DI ETANOLO

20 Problematiche e prospettive del processo Problematiche: Costo delle materie prime Velocità di reazione Ottenimento di co-prodotti Richiesta di energia per la distillazione del prodotto Prospettive: Riduzione costi materia prima (microrganismi ingegnerizzati); Fermentatori a letto fluido e/o cellule immobilizzate; Processi continui (rimozione in continuo dell etanolo senza avvelenamento del catalizzatore e con risparmio energetico); Termocompressione (compressori che aumentano la P dei vapori di testa che diventano i fluidi termici per la colonna); Colonne termicamente accoppiate (condensatore e ribollitore).

21 ASPETTI METABOLICI Fermentazione ± O2 Respirazione +O2

22 ANAEROBI FACOLTATIVI capacità di utilizzare glucosio in presenza e in assenza di O2 METABOLISMO DEL LIEVITO

23 EFFETTO DEL GLUCOSIO E OSSIGENO SULLA CRESCITA DEL LIEVITO

24 Effetti della concentrazione di glucosio: Effetto Crabtree Alte concentrazioni di glucosio = Alte velocità di glicolisi = Fermentazione aerobica. In presenza di ossigeno NADH glicolitico ossidato durante la fermentazione piuttosto che respirazione; 2 ordini di grandezza: a breve termine (overflow metabolico): fast response regolazione enzimatica piruvato decarbossilasi minore affinità per piruvato rispetto alla piruvato deidrogenasi basse concentrazioni piruvato favorita respirazione (PDH) invece alte concentrazioni piruvato favorita la fermentazione (PDC) a lungo termine: slow response espressione genica repressione da glucosio (sia geni coinvolti importazione di altri zuccheri sia geni respiratori) accumulo di piruvato favorita la fermentazione per rigenerare NAD+ S. Cerevisiae Crabtree positivo

25 Effetti dell ossigeno: Effetto Pasteur Inibizione del processo fermentativo da parte dell ossigeno e riduzione della velocità di glicolisi S. Cerevisiae Pasteur negativo Altri effetti: Effetto Custer Inibizione della fermentazione con il passaggio in anaerobiosi S. Cerevisiae Custer negativo Effetto Kluyver Capacità di metabolizzare particolari disaccaridi aerobicamente ma non anaerobicamente anche se sono in grado di utilizzare uno o + singoli esosi anaerobicamente S. Cerevisiae Kluyver negativo

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