Cenni storici. Tale tecnica trova largo impiego in tutte le aree di ricerca biologica:

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1 DNA Microarray: griglia di DNA costruita artificialmente, in cui ogni elemento della griglia riconosce una specifica sequenza target di RNA o cdna. Tale tecnica trova largo impiego in tutte le aree di ricerca biologica: 1) consente di identificare e comprendere meccanismi e origine molecolare di patologie ereditarie, infettive, autoimmuni, oncologiche 2) identificare differenze nell espressione genica di tessuti esposti a diversi composti farmacologici 3) identificare set di geni che permettono di distinguere una malattia da un altra. Cenni storici La tecnica dei microarray utilizzata nel monitoraggio dell espressione espressione genica, è stata descritta per la prima volta nel 1994: utilizzazione di target radioattivi ibridizzati a probe di cdna immobilizzati su filtro. 1995: ibridizzazione di target marcati con due fluorescenti diversi a probe di cdna stampati su una superficie di vetro. Il principio chiave per la fabbricazione di microarray è che filamenti di DNA a singola catena legati fortemente a supporti rigidi non interagiscano tra loro e si possano ibridare con RNA complementare. La produzione di un array comincia quindi con la scelta delle sonde che devono essere posizionate sull array. Le sonde possono essere prelevate da librerie genomiche, da tessuti o cellule o da raccolte di cdna. Le sonde scelte sono quindi amplificate in PCR e, dopo purificazione, posizionate con un opportuno robot su un supporto rigido. 1

2 Il robot deposita un campione di ciascun gene precedentemente selezionato in posizioni prestabilite. Il supporto dell array, inizialmente era costituito da membrane di nylon o nitrocellulosa, attualmente è realizzato con vetrini da microscopio (tale materiale sopporta meglio alte temperature, non è poroso e quindi il volume del materiale depositato può essere ridotto e si evita il rischio diffusione, minimizza il rumore di fondo). Il DNA viene fissato alla matrice con raggi UV. Il DNA fissato sul vetrino viene poi denaturato tramite riscaldamento, in modo da ottenere singoli filamenti pronti per legare i propri complementari. In base all uso i microarray si distinguono in: 1) cdna microarray: per analizzare gli mrna e valutare l espressione genica. 2) Microarray SNP e array di mutazione: per rilevare polimorfismi o mutazioni conosciute. 2

3 Procedimento: 1) si estrae l RNA da un campione test che vogliamo esaminare. 2) Si retrotrascrive l mrna in cdna marcandolo con composti fluorescenti. 3) Si procede allo stesso modo con un campione di riferimento (es. un tessuto normale) marcandolo con un fluorocromo differente. 4) I due campioni vengono posizionati sul microarray 5) Si lasciano ibridare con le sonde 6) Si verifica il profilo dell espressione genica del test rispetto al controllo Esempio del funzionamento del microarray nel caso di misurazione dell espressione dell mrna: Un alternativa alla deposizione di cdna su chip è data dalla sintesi di oligonucleotidi in situ su strati di silicio o vetro. Sulla matrice sono posizionate molecole di collegamento sintetiche (linker). Le molecole linker forniscono una superficie di aggancio per le sonde. La sintesi delle sonde avviene in parallelo essendo conseguenza dell aggiunta di un nucleotide a più catene che crescono contemporaneamente. 3

4 Per definire quali catene oligonucleotidiche dovranno ricevere un oligonucleotide ad ogni passo, maschere fotolitografiche, con finestre di dimensioni pari a quelle di una singola locazione, sono poste sopra la matrice su cui sono posizionate le molecole linker. Le molecole linker sono modificate con gruppi di protezione rimuovibili fotochimicamente. Quando la luce UV colpisce la maschera i linker esposti vengono deprotetti e sono disponibili par l accoppiamento con il nucleotide. Nel passo successivo, un altra maschera viene posizionata per permettere un ulteriore ciclo di deprotezione e accoppiamento. Il tutto si ripete fino a raggiungere la lunghezza voluta delle sonde. 4

5 Disegno sperimentale mrna qualità ed omogeneità La fonte di RNA oggetto di studio dovrebbe essere isolata da una popolazione omogenea di cellule, trattate in modo da preservarne la qualità Le linee cellulari soddisfano nel modo migliore questo criterio, poichè si originano per espansione clonale Tessuti umani o animali sono più difficili da studiare per possibile perdita di omogeneità In sezioni di tumore infatti, la popolazione cellulare può essere e facilmente rappresentata da una miscela di cellule tumorali e normali, comprendenti cellule infiammatorie e del tessuto connettivo Importante è anche la qualità dell RNA estratto, che non deve essere contaminato da DNA genomico e proteine e deve essere conservato nel modo adeguato per evitarne la degradazione 5

6 6

7 Microarray a DNA spottato Disegno sperimentale: numero di replicati e ibridizzazione La marcatura dei target con diverse molecole fluorescenti può produrre una differente efficienza di incorporazione.. Quindi è importante avere: La marcatura reciproca dello stesso campione con entrambi i fluorescenti Repliche dei campioni di esperimenti diversi, da utilizzare come controllo per la variabilità sperimentale Più di una ibridizzazione: : replicati su vetrini diversi Cy3- Cy5- Cy5- Cy3- Cy3- Cy5- Cy5- Cy3-7

8 Limitazioni del DNA microarray Possibilità di cross-ibridazione tra sequenze simili: conferma dei dati con approcci più tradizionali per l analisi dell espressione genica (Realtime RT-PCR) La sensibilità non è elevata e quindi non permette di valutare cambiamenti minimi dell espressione genica La variazione dell espressione genica dovuta alla diversa espressione delle varianti di splicing non è identificata La variazione dell espressione genica dovuta a regolazione traduzionale e post-traduzionale non può essere rilevata Microarray di mutazioni: -Vengono sintetizzate sequenze da 20-25pb normali e mutate -Queste sequenze vengono legate su un chip da array -I campioni di DNA, controllo e potenziali mutati, vengono estratti, amplificati per PCR e marcati -Si segue lo schema già descritto (ibridazione, lavaggi ) -Si valuta l eventuale presenza di mutazioni Il vetrino contiene sequenze normali e mutate per 75 mutazioni differenti per un dato Gene, spottate in triplicato. A. Campioni di controllo B. DNA estratto e amplificato da pazienti che presentano il gene mutato in eterozigosi 8

9 Tecnologia Microarray Applicazioni cliniche Alcune delle possibili applicazioni cliniche dei microarray: Oncologia: in particolare nel settore delle leucemie questa tecnologia ha trovato buone possibilità di utilizzo in ambito diagnostico. Un lavoro pubblicato nel 2003 su Seminars in Hematology,, dimostra l applicabilitl applicabilità della tecnologia Microarray alla classificazione molecolare di leucemie. Sulla base dei differenti profili di espressione genica, si prospetta la possibilit ssibilità di utilizzare gli array come strumento sia diagnostico (identificando anche nuovi sottotipi di malattia), sia prognostico (predizione risposta a terapie, rischi di recidiva, ecc ). La tecnologia microarray può trovare impiego anche nell identificazione di trattamenti individuali in accordo con il profilo di espressione genica del paziente e di nuovi target malattia-specifici per scopi di drug discovery. Tecnologia Microarray Applicazioni cliniche Microbiologia: sono stati sviluppati array in grado di rilevare sequenze geniche di diversi tipi di patogeni. Sono stati realizzati array a oligonucleotidi,, contenenti sequenze virali di 70 pb altamente conservate all interno della stessa famiglia, in modo da rilevare anche varianti virali non conosciute (PNAS 2002). Lo studio propone l impiego l di questa nuova tecnologia in diagnostica e nell identificazione di malattie di eziologia sconosciuta. Altri studi hanno portato alla realizzazione di diversi tipi di chip, il cui impiego può spaziare dalla diagnosi di infezioni batteriche (con rilevazione di geni per la resistenza ad antibiotici), agli studi sulle relazioni filogenetiche tra diversi microorganismi. Tecnologia Microarray Applicazioni cliniche Farmacogenomica: studio della variazione individuale di risposta ai farmaci sulla base del corredo genetico. Alcuni polimorfismi genetici causano risposte differenti nei confronti di determinati farmaci. La tecnologia microarray può trovare impiego nello sviluppo di farmaci paziente-specifici. Microarray di SNP sono stati recentemente utilizzati anche per valutare il chimerismo dopo trapianti allogenici di cellule staminali (Leukemia 2004). 9

10 Ab Microarray I microarray di anticorpi consentono, in un tempo abbastanza breve, di valutare il profilo di espressione proteica di lisati cellulari, tissutali o altri campioni biologici. Gli anticorpi agiscono come un esca, legano le proteine preda presenti nel lisato. L avvenuta interazione viene visualizzata tramite chemiluminescenza o tramite l uso di marcatori fluorescenti. Sullo stesso vetrino vengono fissati covalentemente molteplici anticorpi (fino a circa ), ciascuno in triplicato e una serie di anticorpi diretti contro proteine house keeping. Tale metodica non consente di determinare la concentrazione assoluta della singola proteina nel lisato, ma fornisce una misura relativa del livello di espressione tra due campioni. Protocollo: estrazione delle proteine da tessuto, cellule o fluidi biologici marcatura delle proteine con Cys5 o Cys3 rimozione dell eccesso di fluorocromo non legato incubazione del lisato sul vetrino analisi per valutare i livelli di espressione Dopo aver effettuato un analisi di microarray di anticorpi i risultati ottenuti vanno validati con un metodo indipendente (Western blot; ELISA, Immunistochimica, ) 10

11 ELISA enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Tecnica che consente di rilevare la presenza di antigeni o di anticorpi. E un saggio immunologico quantitativo. Come si realizza? La tecnica usualmente si effettuata su piastre a 96 pozzetti. ELISA DIRETTO (rilevazione dell antigene) Dapprima si lega l Anticorpo alla piastra. Il legame e dovuto alle interazioni idrofobiche tra le proteine e la plastica. Si aggiunge l omogenato contenente l antigene, dopo il tempo opportuno, si aggiunge l Anticorpo secondario legato alla perossidasi (lega l antigene) e si lascia legare per il tempo opportuno. Si toglie l eccesso di secondario non legato. Si aggiungono quindi i substrati per il tempo necessario per avere il segnale e si blocca la reazione prima di effettuare la lettura spettrofotometrica. 11

12 ELISA INDIRETTO E' il metodo più utilizzato per la determinazione di anticorpi. Consiste nel fare aderire alla piastra ELISA l'antigene dal quale vogliamo sapere se nel siero campione esistono anticorpi specifici. Si possono utilizzare come antigeni, proteine virali o batteriche ed anche virus batterici. I passi successivi sono l'aggiunta del siero campione, l'incubazione e lavaggio, l aggiunta dell anticorpo secondario ed infine l'aggiunta del substrato, che reagisce con l'enzima e poi si passa alla lettura. 12

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