Herpes Simplex Virus Type 2 IgG

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1 DCM006i-0 Ed. 08/2012 Herpes Simplex Virus Type 2 IgG per analisi di routine Test immunoenzimatico per la determinazione qualitativa e semiquantitativa di anticorpi umani di classe IgG diretti contro l'herpes Simplex Virus di tipo 1 nel siero e plasma umano IVD LOT Vedere etichetta esterna Σ = 96 test REF DKI006 DESTINAZIONE D USO Il kit ELISA Diametra Herpes Simplex Virus Type 2 IgG è un metodo immunoenzimatico per la determinazione qualitativa e semiquantitativa di anticorpi umani di classe IgG diretti control l'herpes Simplex Virus di tipo 2 nel siero e plasma umano. Il kit Herpes Simplex Virus Type 1 IgG è destinato al solo uso di laboratorio. 1. SIGNIFICATO CLINICO L'Herpes simplex virus (HSV) è un virus a DNA con capside ( nm di diametro) appartenente alla classe alphaherpesviridae. Sulla base di considerazioni antigeniche, e di differenze biochimiche e biologiche può essere diviso in due sierotipi: HSV-1 e HSV-2. L'uomo è il solo ospite conosciuto in natura e fonte del virus. L'HSV di tipo 1 provoca in genere herpes orale, mentre l'hsv di tipo 2 colpisce in genere la zona genitale. Il più delle volte, HSV-1 e HSV-2 sono inattivi, o "silenziosi", e non causano sintomi, ma alcune persone infette hanno "focolai" di vesciche e ulcere. Una volta infettati con HSV, le persone rimangono infette per tutta la vita. Gli Herpes Simplex Virus sono tra i più comuni agenti infettivi dell'uomo, ed entrambi i tipi di HSV sembrano capaci di infettare siti corporei simili. Una percentuale elevata della popolazione adulta è sieropositiva (circa il 90% di infezione HSV-1 è dipendente dalla condizione socio-economica, il 10-30% è infetto da HSV-2). L'infezione primaria da HSV-1 si verifica di solito nella prima infanzia (da 6 a 18 mesi di età). L'HSV-2 di solito produce sintomi lievi, e la maggior parte delle persone non hanno sintomi riconosciuti. 2. PRINCIPIO DEL METODO Il kit ELISA Diametra Herpes Simplex Virus Type 2 IgG è un metodo immunoenzimatico (ELISA). I micropozzetti della fase solida sono rivestiti con antigene di Herpes Simplex Virus di tipo 2. I campioni diluiti dei pazienti e i controlli pronti per l'uso sono pipettati in questi pozzetti. Durante l'incubazione, gli anticorpi specifici contro l'herpes simplex virus di tipo 2 dei campioni positivi e dei controlli si legano agli antigeni immobilizzati. Dopo la fase di lavaggio che rimuove il campione e il materiale di controllo non legato, vengono dispensati nei pozzetti anticorpi umani anti IgG coniugati a perossidasi di rafano. Durante una seconda incubazione questi anticorpi si legano specificamente agli anticorpi IgG con conseguente formazione di immunocomplessi enzimatici. Dopo un secondo lavaggio per rimuovere il coniugato non legato, gli immunocomplessi formati (in caso di risultato positivo) vengono individuati mediante incubazione con il substrato TMB e lo sviluppo di un colore blu. Il colore blu si trasforma in giallo dopo aver stoppato la reazione enzimatica con acido solforico. L'intensità di questo colore è direttamente proporzionale alla quantità di anticorpi IgG specifici per Herpes Simplex Virus di tipo 2 nel campione del paziente. L'assorbanza a 450 nm viene letta con un lettore di piastre ELISA. 3. REATTIVI, MATERIALI E STRUMENTAZIONE 3.1. Reattivi e materiali forniti nel kit 1. Controls (3 flaconi, pronti all'uso) Negative Control (2 ml) REF DCE045/00601i-0 Positive Control (1 ml) REF DCE045/00602i-0 Cut-off Control (2 ml) REF DCE045/00603i-0 2. Conjugate (1 flacone, 20 ml) Anticorpi anti IgG coniugati con perossidasi REF DCE002/00602i-0 3. Coated Microplate (1 micropiastra breakable coattata con antigeni di HSV-2) REF DCE002/00603i-0 4. TMB Substrate (1 flacone, 14 ml) H 2 O 2 -Tetrametibenzidina (TMB) (evitare il contatto con la pelle) REF DCE004/00604i-0 5. Stop Solution (1 flacone, 14 ml) Acido Solforico 0,2 mol/l (evitare il contatto con la pelle) REF DCE005/00605i X Conc Wash Solution (1 vial, 30 ml) Contiene preservante privo di mercurio REF DCE007/00607i-0 7. Sample diluent (1 vial, 100 ml) Soluzione tampone a ph 7.2 REF DCE053/00653i-0

2 3.2. Reattivi necessari non forniti nel kit Acqua distillata Materiale e strumentazione ausiliari Dispensatori automatici. Lettore per micropiastre (450 nm). Note Conservare tutti i reattivi a 2 8 C, al riparo dalla luce. Una volta aperto, il kit mantiene la sua funzionalità per 2 mesi se conservato a 2-8 C. Aprire la busta del Reattivo 3 (Coated Microplate) solo dopo averla riportata a temperatura ambiente e chiuderla subito dopo il prelievo delle strip da utilizzare. 4. AVVERTENZE Questo test kit è per uso in vitro, da eseguire da parte di personale esperto. Non per uso interno o esterno su esseri Umani o Animali. Usare i previsti dispositivi di protezione individuale mentre si lavora con i reagenti forniti. Seguire le Buone Pratiche di Laboratorio (GLP) per la manipolazione di prodotti derivati da sangue. Tutti i reattivi di origine umana usati nella preparazione dei reagenti sono stati testati e sono risultati negativi per la presenza di anticorpi anti- HIV 1&2, per HbsAg e per anticorpi anti-hcv. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Calibratori ed i Controlli devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi. Alcuni reagenti contengono piccole quantità di Sodio Azide (NaN 3 ) o di Proclin 300 R come conservante. Evitare il contatto con la pelle e le mucose. La Sodio Azide può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi; inoltre, può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, lasciar scorrere grandi quantità di acqua per prevenire la formazione di azidi. Il TMB Substrato contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. La Stop Solution è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. Evitare l esposizione del reagente TMB/H 2 O 2 a luce solare diretta, metalli o ossidanti. Non congelare la soluzione. 5. PRECAUZIONI Si prega di attenersi rigorosamente alla sequenza dei passaggi indicata in questo protocollo. I risultati presentati qui sono stati ottenuti usando specifici reagenti elencati in queste Istruzioni per l Uso. Tutti i reattivi devono essere conservati a temperatura controllata di 2-8 C nei loro contenitori originali. Eventuali eccezioni sono chiaramente indicate. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. Prima dell uso lasciare tutti i componenti dei kit e i campioni a temperatura ambiente (22-28 C) e mescolare accuratamente. Non scambiare componenti dei kit di lotti diversi. Devono essere osservate le date di scadenza riportate sulle etichette della scatola e di tutte le fiale. Non utilizzare componenti oltre la data di scadenza. Qualora si utilizzi strumentazione automatica, è responsabilità dell utilizzatore assicurarsi che il kit sia stato opportunamente validato. Un lavaggio incompleto o non accurato dei pozzetti può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. Per la riproducibilità dei risultati, è importante che il tempo di reazione di ogni pozzetto sia lo stesso. Per evitare il time shifting durante la dispensazione degli reagenti, il tempo di dispensazione dei pozzetti non dovrebbe estendersi oltre i 10 minuti. Se si protrae oltre, si raccomanda di seguire lo stesso ordine di dispensazione. Se si utilizza più di una piastra, si raccomanda di ripetere la curva di calibrazione in ogni piastra. L addizione del TMB Substrato dà inizio ad una reazione cinetica, la quale termina con l addizione della Stop Solution. L addizione del TMB Substrato e della Stop Solution deve avvenire nella stessa sequenza per evitare tempi di reazione differenti. Osservare le linee guida per l esecuzione del controllo di qualità nei laboratori clinici testando controlli e/o pool di sieri. Osservare la massima precisione nella ricostituzione e dispensazione dei reagenti. Non usare campioni microbiologicamente contaminati, altamente lipemici o emolizzati. I lettori di micropiastre leggono l assorbanza verticalmente. Non toccare il fondo dei pozzetti. 6. PROCEDIMENTO 6.1. Preparazione della Wash Solution Diluire la soluzione di lavaggio concentrata 20X con acqua distillata; ad esempio per preparare 600 ml di soluzione di lavaggio diluita aggiungere 30 ml di soluzione di lavaggio 20X a 570 ml di acqua distillata. Se la " 20X Wash Solution" presenta i cristalli, scioglierli scaldando il flacone in acqua calda a 37 C prima dell'uso. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 mese a 2-8 C Preparazione del Campione Il kit ELISA Diametra Herpes Simplex Virus Type 2 IgG può essere utilizzato con siero o plasma (EDTA-, eparina e citrato-plasma) umano. Tutti i campioni devono essere pre-diluiti con Sample Diluent 1:101; ad esempio 10 µl di

3 campione può essere diluito con 1000 µl di Sample Diluent. I controlli sono pronti all'uso e non devono essere diluiti! Per ottenere il siero, raccogliere il sangue venoso, far coagulare e separare il siero centrifugando a temperatura ambiente. Non centrifugare prima che la coagulazione sia completata. I pazienti trattati con terapia anticoagulante possono richiedere un tempo di coagulazione più lungo. Per ottenere il plasma, il sangue intero deve essere raccolto in provette contenenti anti-coagulante e centrifugati subito dopo la raccolta. Non usare campioni emolitici, itterici o lipemici. I campioni devono essere chiusi e possono essere conservati per un massimo di 24 ore a 2-8 C prima di essere analizzati. Per conservazioni più lunghe, tenere i campioni congelati a -20 C prima del dosaggio; congelare una sola volta. I campioni scongelati devono essere miscelati bene prima della prova. Nota: i campioni contenenti Sodio Azide non devono essere utilizzati nel saggio Procedura Portare tutti i reagenti a temperatura ambiente (22-28 C). Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate a 2-8 C. Per evitare potenziali contaminazioni microbiche e/o chimiche non rimettere i reagenti inutilizzati nei flaconi originali. Al fine di aumentare l accuratezza dei risultati del test è necessario operare in doppio, allestendo due pozzetti per ogni Controllo, due per ogni Campione ed uno per il Bianco. Reagente Controlli Campione Bianco Controlli (Neg, Pos, Cut-Off) Campione diluito 100 µl 100 µl Coprire la piastra con la pellicola adesiva. Incubare per 1 ora a 37 C. Rimuovere il contenuto da ogni pozzetto. Lavare i pozzetti 5 volte con 300 µl di soluzione di lavaggio diluita. Rimuovere l'eccesso di soluzione sbattendo delicatamente la piastra capovolta su carta assorbente. Nota importante: la sensibilità e la precisione di questo kit sono fortemente influenzate dal corretto svolgimento della procedura di lavaggio! Conjugate 100 µl 100 µl Incubare 30 minuti a temperatura ambiente (22-28 C). Non esporre alla luce solare diretta. Rimuovere il contenuto da ogni pozzetto. Lavare i pozzetti 5 volte con 300 µl di soluzione di lavaggio diluita. Rimuovere l'eccesso di soluzione sbattendo delicatamente la piastra capovolta su carta assorbente. TMB Substrate Misurazione: Settare il lettore di micropiastra ELISA a zero usando il bianco. Se - per motivi tecnici - il lettore ELISA non può essere regolato a zero usando il bianco, sottrarre il valore di assorbanza del bianco a tutti i valori delle altre assorbanze misurate in modo da ottenere risultati attendibili! Misurare l'assorbanza di tutti i pozzetti a 450 nm e registrare tutti i valori di assorbanza di ogni controllo e campione. Si raccomanda una lettura a doppia lunghezza d'onda utilizzando 620 nm come lunghezza di riferimento. Laddove applicabile calcolare la media delle assorbanze di tutti i duplicati. 7. CONTROLLO QUALITA Si raccomanda di utilizzare i controlli secondo le norme statali e federali. L'uso di controlli è consigliato per assicurare la validità dei risultati durante i test. Utilizzare controlli sia a livello normale che patologico. Si raccomanda inoltre di utilizzare programmi per la valutazione della qualità nazionali o internazionali, al fine di assicurare l'accuratezza dei risultati. Se i risultati del test non rientrano nei range di accettazione dei controlli, i risultati devono essere considerati non validi. In questo caso, si prega di consultare i seguenti parametri tecnici: pipettaggio e apparecchiature di cronometraggio; fotometro, date di scadenza dei reagenti, metodi di conservazione e condizioni di incubazione, aspirazione e lavaggio. Se dopo il controllo dei suddetti fattori non è rilevabile alcun errore, contattare il proprio distributore o Diametra direttamente. 8. RISULTATI 100 µl 100 µl 100 µl Incubare 15 minuti al buio a temperature ambiente (22-28 C). Stop Solution 100 µl 100 µl 100 µl Agitare delicatamente la micropiastra. (Nota: campioni altamente positivi possono causare precipitati scuri del cromogeno!) Leggere l'assorbanza (E) a 450 nm con una lunghezza d'onda di riferimento di 620 nm o contro il Bianco entro 30 minuti dopo l'aggiunta della Stop Solution Validazione del dosaggio Il dosaggio può essere considerato valido se sono soddisfatti i seguenti criteri: Assorbanza (OD) Bianco minore di 0,100 Controllo Negativo minore di 0,200 Controllo Cut-off compresa tra 0,350-0,850 Controllo Positivo compresa tra 0,650-3,000

4 8.2. Calcolo dei risultati Valore medio di assorbanza del Controllo Cut-off (CO) Calcolare il valore medio di assorbanza dei due valori del controllo Cut-off ottenuti. Esempio: (0,44 + 0,46): 2 = 0,45 = CO 8.3. Interpretazione dei risultati POSITIVO Assorbanza media del paziente oltre il 10% al di sopra del CO (Media OD paziente > 1.1 x CO) ZONA INCERTA Assorbanza media del paziente dal 10% sopra al 10% sotto il CO: ripetere il test 2-4 settimane dopo con un campione fresco del paziente (0.9 x CO Media OD paziente 1.1 x CO) Risultato nel second test ancora nella zona incerta NEGATIVO NEGATIVO Assorbanza media del paziente oltre il 10% al di sotto del CO (Media OD paziente < 0.9 x CO) Risultati in unità arbitrarie Assorbanza media del paziente x 10 = AU CO Esempio: x 10 = 35 AU 0.45 Interpretazione dei risultati in AU Valore di Cut-off Zona Incerta Negativo Positivo 10 AU 9-11 AU < 9 AU > 11 AU È importante tenere presente che la determinazione di un range di valori attesi in un dato metodo per una popolazione normale è dipendente da molteplici fattori, quali la specificità e sensibilità del metodo in uso, e la popolazione in esame. Perciò ogni laboratorio dovrebbe considerare i range indicati dal Fabbricante come un indicazione generale e produrre range di valori attesi propri basati sulla popolazione indigena dove il laboratorio risiede Nota importante per l'interpretazione dei risultati Poiché gli Herpes simplex virus di tipo 1 e 2 sono sierotipi molto simili, per loro natura presentano un alto grado di reattività crociata. Pertanto, infezioni con uno dei due HSV aumentato il titolo anticorpale anche dell'altro sierotipo eterologo. Per questo motivo i risultati positivi per HSV-2 IgG presi singolarmente non rappresentano una detezione definitiva di una infezione da HSV-2! Per determinare il sierotipo a cui il paziente è stato precedentemente esposto, il campione del paziente deve essere analizzato impiegando in parallelo i kit Diametra Herpes Simplex Virus IgG per il tipo 1 e Diametra Herpes Simplex Virus IgG per il tipo 2. La concentrazione anticorpale più alta indica l'anticorpo predominante e definisce il sierotipo HSV corrispondente. 9. PARAMETRI CARATTERISTICI 9.1. Specificità Diagnostica La specificità diagnostica é definita come la probabilità del test di fornire un risultato negativo in assenza di anticorpi specifici. La specificità diagnostica del kit Diametra Herpes Simplex Virus Type 2 IgG è 99,9% Sensibilità Diagnostica La sensibilità diagnostica è definita come la probabilità di fornire un risultato positivo in presenza di anticorpi specifici. La sensibilità diagnostica del kit Diametra Herpes Simplex Virus Type 2 IgG è 99,9% Precision Intra-assay La precisione intra-assay del kit Diametra HSV-2 IgG ELISA è stata determinata con 20 replicati di 3 campioni positivi. Campione Media OD CV % n 1 0,92 3, ,36 5, ,82 2, Inter-assay La precisione inter-assay del kit Diametra HSV-2 IgG ELISA è stata determinata con 3 campioni, 2 kit diversi e 10 dosaggi indipendenti. Campione Media OD CV % n 1 0,76 4, ,24 4, ,79 4, Sostanze interferenti Emoglobina (fino a 4 mg/ml), Bilirubina (fino a 0,5 mg/ml) e Trigliceridi (fino a 30 mg/ml) non influenzano i risultati del saggio. 10. LIMITAZIONI DEL SAGGIO La contaminazione batterica o ripetuti cicli di congelamento e scongelamento del campione possono influenzare i valori di assorbanza. Nei pazienti immunocompromessi e nei neonati i valori sierologici hanno un valore limitato. 11. DISPOSIZIONI PER LO SMALTIMENTO I reagenti devono essere smaltiti in accordo con le leggi locali.

5 BIBLIOGRAFIA 1. Spaar, F.-W.: Die menschliche Herpes simplex Enzephaltits und Meningitis. Eine klinischneurologische Untersuchung. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York (1976) 2. Corey, L.; P.G. Spear: Infections with herpes simplex viruses. N. Engl. J. Med. 314 (1986) Felgenhauer, K.: Diagnostische Bedeutung der lokal synthetisierten spezifischen Antikörper des Liquor cerebrospinalis. Lab. Med. 15 (1991) Dörries, R., R. Kaiser, H. Imrich et al.: Neuere Aspekte zur Diagnose zentralnervöser Virusinfektionen. Lab. Med. 15 (1991) Ed. 08/2012 DCM006i-0 DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, SEGRATE (MI) Italy Tel Fax Manufactory: Via Pozzuolo 14, SPELLO (PG) Italy Tel Fax

6 DCM006i-0 Ed. 08/2012 Herpes Simplex Virus Type 2 IgG for routine analysis Enzyme immunoassay for the qualitative and semiquantitative determination of human IgG antibodies to Herpes Simplex Virus Type 2 in human serum and plasma. IVD LOT See external label Σ = 96 tests REF DKI006 INTENDED USE Diametra Herpes Simplex Virus Type 2 IgG ELISA assay is an immunoenzymatic method for the qualitative and semiquantitative determination of human IgG antibodies against Herpes Simplex Virus Type 2 in human serum and plasma. Herpes Simplex Virus Type 2 IgG kit is intended for laboratory use only. 1. CLINICAL SIGNIFICANCE Herpes simplex is an enveloped DNA virus ( nm in diameter) belonging to the alphaherpesviridae. Based on antigenic, biochemical and biological differences it can be divided into two serotypes, HSV- 1 and HSV-2. Man is the only known natural host and source of the virus. HSV-type 1 typically causes oral herpes, while HSV-type 2 typically affects the genital area. Most of the time, HSV-1 and HSV-2 are inactive, or silent, and cause no symptoms, but some infected people have outbreaks of blisters and ulcers. Once infected with HSV, people remain infected for life. Herpes simplex viruses are among the most common infectious agents of man, and either HSV type appears to be capable of infecting similar body sites. A high percentage of the adult population is seropositive (approx. 90% HSV-1 is dependent on socio-economic status, 10-30% HSV-2). Primary HSV-1 infection usually occurs in early childhood (6 to 18 months of age). HSV-2 usually produces mild symptoms, and most people have no recognized symptoms. 2. PRINCIPLE OF THE METHOD Diametra HSV 2 IgG ELISA Kit is a solid phase enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Microtiter wells as a solid phase are coated with HSV 2 antigen. Diluted patient specimens and ready-for-use controls are pipetted into these wells. During incubation HSV 2-specific antibodies of positive specimens and controls are bound to the immobilized antigens. After a washing step to remove unbound sample and control material horseradish peroxidase conjugated anti-human IgG antibodies are dispensed into the wells. During a second incubation this anti-igg conjugate binds specifically to IgG antibodies resulting in the formation of enzyme-linked immune complexes. After a second washing step to remove unbound conjugate the immune complexes formed (in case of positive results) are detected by incubation with TMB substrate and development of a blue color. The blue color turns into yellow by stopping the enzymatic indicator reaction with sulfuric acid. The intensity of this color is directly proportional to the amount of HSV 2-specific IgG antibody in the patient specimen. Absorbance at 450 nm is read using an ELISA microtiter plate reader. 3. REAGENTS, MATERIALS AND INSTRUMENTATION 3.1. Reagents and materials supplied in the kit 1. Controls (3 vials, ready to use) Negative Control (2 ml) REF DCE045/00601i-0 Positive Control (1 ml) REF DCE045/00602i-0 Cut-Off Control (2 ml) REF DCE045/00603i-0 2. Conjugate (1 vial, 20 ml) Anti human IgG antibodies conjugated with peroxidase REF DCE002/00602i-0 3. Coated Microplate (1 breakable microplate coated with HSV-2 antigen) REF DCE002/00603i-0 4. TMB Substrate (1 vial, 14 ml) H 2 O 2 -Tetramethylbenzidine (avoid any skin contact) REF DCE004/00604i-0 5. Stop Solution (1 vial, 14 ml) Sulphuric acid 0.2M (avoid any skin contact) REF DCE005/00605i X Conc. Wash Solution (1 vial, 30 ml) Contain non-mercury preservative REF DCE007/00607i-0 7. Sample Diluent (1 vial, 100 ml) Buffered solution ph 7.2 REF DCE053/00653i-0

7 3.2. Reagents necessary not supplied Distilled water Auxiliary materials and instrumentation Automatic dispenser. Microplates reader (450 nm) Notes Store all reagents at 2 8 C in the dark. Opened kits retain activity for two months if stored as described above. Open the bag of reagent 3 (Coated Microplate) only when it is at room temperature and close it immediately after use. 4. WARNINGS This kit is intended for in vitro use by professional persons only. Not for internal or external use in Humans or Animals. Use appropriate personal protective equipment while working with the reagents provided. Follow Good Laboratory Practice (GLP) for handling blood products. All human source material used in the preparation of the reagents has been tested and found negative for antibody to HIV 1&2, HbsAg, and HCV. No test method however can offer complete assurance that HIV, HBV, HCV or other infectious agents are absent. Therefore, the reagents should be handled in the same manner as potentially infectious material. Some reagents contain small amounts of Sodium Azide or Proclin 300 R as preservative. Avoid the contact with skin or mucosa. Sodium Azide may be toxic if ingested or absorbed through the skin or eyes; moreover it may react with lead or copper plumbing to form potentially explosive metal azides. If you use a sink to remove the reagents, allow scroll through large amounts of water to prevent azide build-up. The TMB Substrate contains an irritant, which may be harmful if inhaled, ingested or absorbed through the skin. To prevent injury, avoid inhalation, ingestion or contact with skin and eyes. The Stop Solution consists of a diluted sulphuric acid solution. Sulphuric acid is poisonous and corrosive and can be toxic if ingested. To prevent chemical burns, avoid contact with skin and eyes. Avoid the exposure of reagent TMB/H 2 O 2 to directed sunlight, metals or oxidants. Do not freeze the solution. 5. PRECAUTIONS Please adhere strictly to the sequence of pipetting steps provided in this protocol. The performance data represented here were obtained using specific reagents listed in this Instruction For Use. All reagents should be stored refrigerated at 2-8 C in their original container. Any exceptions are clearly indicated. The reagents are stable until the expiry date when stored and handled as indicated. Allow all kit components and specimens to reach room temperature (22-28 C) and mix well prior to use. Do not interchange kit components from different lots. The expiry date printed on box and vials labels must be observed. Do not use any kit component beyond their expiry date. If you use automated equipment, the user has the responsibility to make sure that the kit has been appropriately tested. The incomplete or inaccurate liquid removal from the wells could influence the assay precision and/or increase the background. It is important that the time of reaction in each well is held constant for reproducible results. Pipetting of samples should not extend beyond ten minutes to avoid assay drift. If more than 10 minutes are needed, follow the same order of dispensation. If more than one plate is used, it is recommended to repeat the dose response curve in each plate Addition of the TMB Substrate solution initiates a kinetic reaction, which is terminated by the addition of the Stop Solution. Therefore, the TMB Substrate and the Stop Solution should be added in the same sequence to eliminate any time deviation during the reaction. Observe the guidelines for performing quality control in medical laboratories by assaying controls and/or pooled sera. Maximum precision is required for reconstitution and dispensation of the reagents. Samples microbiologically contaminated, highly lipemeic or haemolysed should not be used in the assay. Plate readers measure vertically. Do not touch the bottom of the wells. 6. PROCEDURE 6.1. Preparation of the Wash Solution Dilute the "20X Conc. Wash Solution" 1:20 with distilled water; for example to prepare 600 ml of diluted Wash Solution add 30 ml of "20X Wash Solution" to 570 ml of distilled water. If the "20X Wash Solution" presents crystals, dissolve them by warming up at 37 C in a water bath before use. The diluted Wash Solution is stable for 1 month at 2-8 C Preparation of the Sample Diametra Herpes Simplex Virus Type 2 IgG ELISA can be used with human serum and plasma (EDTA-, heparin or citrate plasma). All samples have to be pre-diluted with sample diluent 1:101; for example 10 µl of sample may be diluted with 1000 µl of sample diluent. The Controls are ready to use and must not be diluted!. To obtain the serum, collect blood by venipuncture, allow to clot, and separate serum by centrifugation at room temperature. Do not centrifuge before complete clotting has occurred. Patients receiving anticoagulant therapy may require increased clotting time. To obtain the plasma, whole blood should be collected into centrifuge tubes containing anti

8 coagulant and centrifuged immediately after collection. Do not use hemolytic, icteric or lipemic specimens. Specimens should be capped and may be stored for up to 24 hours at 2-8 C prior to assaying. Specimens held for a longer time should be frozen only once at 20 C prior to assay. Thawed samples should be inverted several times prior to testing. Please note: samples containing Sodium Azide should not be used in the assay Procedure Allow all reagents to reach room temperature (22-28 C). Unused coated microwell strips should be released securely in the foil pouch containing desiccant and stored at 2-8 C. To avoid potential microbial and/or chemical contamination, unused reagents should never be transferred into the original vials. As it is necessary to perform the determination in duplicate in order to improve accuracy of the test results, prepare two wells for each Control, two for each sample, one for Blank. Reagent Controls Sample Blank Controls (Neg, Pos, Cut-Off) Diluted Sample 100 µl 100 µl Cover the plate with the adhesive foil. Incubate 1 hour at 37 C. Remove the contents from each well. Wash the wells 5 times with 300 µl of diluted Wash Solution. Remove excess solution by tapping the inverted plate on a paper towel. Important note: the sensitivity and precision of this assay is markedly influenced by the correct performance of the washing procedure! Conjugate 100 µl 100 µl Incubate 30 minutes at room temperature (22-28 C). Do not expose to direct sunlight. Remove the contents from each well. Wash the wells 5 times with 300 µl of diluted Wash Solution. Remove excess solution by tapping the inverted plate on a paper towel. TMB Substrate 100 µl 100 µl 100 µl Incubate 15 minutes in the dark at room temperature (22 28 C). Measurement: Adjust the ELISA microplate or microstrip reader to zero using the substrate blank. If - due to technical reasons - the ELISA reader cannot be adjusted to zero using the substrate blank, subtract the absorbance value of the blank from all other absorbance values measured in order to obtain reliable results! Measure the absorbance of all wells at 450 nm and record the absorbance values for each control and patient sample. Dual wavelength reading using 620 nm as reference wavelength is recommended. Where applicable calculate the mean absorbance values of all duplicates. 7. QUALITY CONTROL It is recommended to use control samples according to state and federal regulations. The use of control samples is advised to assure the day to day validity of results. Use controls at both normal and pathological levels. It is also recommended to make use of national or international Quality Assessment programs in order to ensure the accuracy of the results. If the results of the assay do not fit to the established acceptable ranges of control materials patient results should be considered invalid. In this case, please check the following technical areas: pipetting and timing devices; photometer, expiration dates of reagents, storage and incubation conditions, aspiration and washing methods. After checking the above mentioned items without finding any error contact your distributor or Diametra directly. 8. RESULTS 8.1. Validation of the Test Run The test run may be considered valid provided the following criteria are met: Absorbance value (OD) Blank lower than 0,100 Negative Control lower than 0,200 Cut-Off Control between 0,350-0,850 Positive Control between 0,650-3, Calculation of Results Mean absorbance value of Cut-off Control (CO) Calculate the mean absorbance value of the two Cutoff Control determinations. Example: (0,44 + 0,46) : 2 = 0,45 = CO Stop Solution 100 µl 100 µl 100 µl Shake the microplate gently. (note: highly positive patient samples can cause dark precipitates of the chromogen!) Read the absorbance (E) at 450 nm with a reference wavwlenght of 620 nm or against Blank within 30 minutes after adding the Stop Solution.

9 8.3. Interpretation of Results 9. PERFORMANCE AND CHARACTERISTICS POSITIVE GREY ZONE Patient (mean) absorbance values more than 10% above CO (Mean OD patient > 1.1 x CO) Patient (mean) absorbance values from 10% above to 10% below CO: repeat test 2-4 weeks later with new patient samples (0.9 x CO Mean OD patient 1.1 x CO) Results in the second test again in the grey zone NEGATIVE 9.1. Diagnostic Specificity The diagnostic specificity is defined as the probability of the assay of scoring negative in the absence of the specific analyte. The diagnostic specificity of Diametra Herpes Simplex Virus Type 2 IgG ELISA is 99,9% Diagnostic Sensitivity The diagnostic sensitivity is defined as the probability of the assay of scoring positive in the presence of the specific analyte. The diagnostic sensitivity of Diametra Herpes Simplex Virus Type 2 IgG ELISA is 99,9%. NEGATIVE Patient (mean) absorbance values more than 10% below CO (Mean OD patient < 0.9 x CO) Results in Arbitrary Units (AU) Patient (mean) absorbance value x 10 = AU CO Example: x 10 = 35 AU 0.45 Interpretation of Results in AU: Cut-off value Grey zone Negative Positive 10 AU 9-11 AU < 9 AU > 11 AU Please pay attention to the fact that the determination of a range of expected values for a normal population in a given method is dependent on many factors, such as specificity and sensitivity of the method used and type of population under investigation. Therefore each laboratory should consider the range given by the Manufacurer as a general indication and produce their own range of expected values based on the indigenous population where the laboratory works Important notes for the interpretation of results of the Diametra Herpes Simplex Virus Type 2 IgG ELISA Since Herpes simplex Virus Type 1 and 2 are very similar serotypes they show a high degree of crossreactivity by nature. Therefore, infections with the one HSV serotype cause increased antibody titers of the other, heterologous serotype. For this reason positive HSV-2 IgG results alone are no definite detection of a HSV-2 infection! In order to determine the serotype to which the patient has previously been exposed, the patient specimen should be analysed in parallel employing the Diametra Herpes Simplex Virus Type 1 and type 2 IgG ELISA test kits. The higher antibody concentration indicates the predominant antibody and defines the corresponding HSV serotype Precision Intra assay The intra-assay (within-run) precision of Diametra HSV-2 IgG ELISA was determined by 20x measurements of 3 positive samples. Sample Mean OD CV % n 1 0,92 3, ,36 5, ,82 2, Inter assay The inter-assay variation of Diametra HSV-2 IgG ELISA was determined 3 samples with 2 production kits in 10 independent runs. Sample Mean OD CV % n 1 0,76 4, ,24 4, ,79 4, Interfering Substances Haemoglobin (up to 4 mg/ml), Bilirubin (up to 0.5 mg/ml) and Triglyceride (up to 30 mg/ml) have no influence on the assay results. 10. LIMITATIONS OF USE Bacterial contamination or repeated freeze-thaw cycles of the specimen may affect the absorbance values. In immunocompromised patients and newborns serological data only have restricted value. 11. WASTE MANAGEMENT Reagents must be disposed off in accordance with local regulations. BIBLIOGRAPHY 1. Spaar, F.-W.: Die menschliche Herpes simplex Enzephaltits und Meningitis. Eine klinischneurologische Untersuchung. G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York (1976) 2. Corey, L.; P.G. Spear: Infections with herpes simplex viruses. N. Engl. J. Med. 314 (1986)

10 3. Felgenhauer, K.: Diagnostische Bedeutung der lokal synthetisierten spezifischen Antikörper des Liquor cerebrospinalis. Lab. Med. 15 (1991) Dörries, R., R. Kaiser, H. Imrich et al.: Neuere Aspekte zur Diagnose zentralnervöser Virusinfektionen. Lab. Med. 15 (1991) Ed. 08/2012 DCM006i-0 DiaMetra S.r.l. Headquater: Via Garibaldi, SEGRATE (MI) Italy Tel Fax Manufactory: Via Pozzuolo 14, SPELLO (PG) Italy Tel Fax