Bio-Rad Laboratories Zoonosis Control and Monitoring. Trichin-L

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1 Trichin-L

2 Produzione annua suini USA 110 Milioni EC Milioni Cina 600 Milioni Brasile 34 Milioni

3 Trichinella nel mondo Europa La Danimarca è l unico paese esente da Trichinella Il Belgio potrebbe diventare a breve il secondo paese esente Il controllo di Trichinella è obbligatorio in tutti gli altri paesi europei 170 Milioni di suini vengono ispezionati ogni anno USA L obiettivo è il raggiungimento dello status esente da Trichinella Programma di sorveglianza passiva Solo i suini esportati inb EU, Russia, Singapore e Cile vengono testati 18 Milioni di suini vengono ispezionati ogni anno Resto del mondo Alta frequenza di Trichinella nei suini (4%) Problema crescente in Cina

4 Norme sui controlli ufficiali Specie animali: Suini domestici, cavalli, cinghiali e altri animali selvatici o da allevamento soggetti a infestazione datrichinella Frequenza dei test: ogni carcassa al mattatoio Metodo di riferimento: agitatore magnetico per la digestione su campione composito Metodi equivalenti: Digestione meccanicamente assistita su campione composito/sedimentazione Digestione meccanicamente assistita su campione composito/isolamento su filtro Digestione automatica su campione composito fino a 35 g Deroghe: campioni congelati, regioni a rischio trascurabile

5 Confronto con altri metodi Digestione con pepsina Sedimentazione Filtrazione Digestione automatica Metodo antiquato Nessun kit validato disponibile finora Programmi di monitoraggio di Trichinella mediante sierologia (o metodo della digestione) validi solo per: allevamenti dichiarati esenti da Trichinella paesi con rischio Trichinella trascurabile

6 Metodo della digestione 1- Campionamento / Pesatura campione 20 min Preparazione Buffer 5 min 2- Digestione enzimatica a 46 C 30 min Digestione Trasferimento campione 2 min 3-1a sedimentazione 30 min Tempo totale 120 min 100 min Trasferimento 1 min Manodopera 50 min 30 min 4-2a sedimentazione: 10 min Trasferimento 1 min 5- Osservazione al microscopio: 10 min Lavaggio 10 min

7 Metodo della digestione + & - Pro Metodo approvato dall EU Contro Metodo manuale che richiede molto lavoro tecnico (50 min/campione) Dispendioso (il lavoro del tecnico rappresenta l 80% del costo) Lento (2 hr/campione composito) Richiede esperienza per la lettura e l interpretazione (microscopio) Scarsa sensibilità Troppi contenitori da lavare dopo ogni ciclo di analisi Rottura dei contenitori in vetro

8 Soluzioni Bio-Rad Bio-Rad è la prima azienda a proporre una soluzione che si adatta ad entrambe le esigenze del mercato (Controllo & Monitoraggio) Controllo di Trichinella con Trichin-L Antigen test Kit Monitoraggio di Trichinella con Trichinella Spiralis Ab Test Kit Licenziato dall USDA In via di approvazione presso la EC Bio-Rad è la prima azienda a proporre un metodo validato ed approvato dall EU (DG-SANCO) per il controllo Trichinella

9 Trichin-L Test-Kit Format

10 Trichin-L: caratteristiche Metodo ufficiale alternativo per la rilevazione di Trichinella in carne suina Campionamento: analogo al metodo ufficiale Step di decantazione: NON richiede imbuti, meno lavaggi Rilevazione di larve: NON richiede microscopio Tempo per il risultato: tempo inferiore al metodo ufficiale Manodopera: manodopera inferiore del metodo ufficiale Protocollo più semplice: NON richiede esperienza per riconoscere le larve di Trichinella, il risultato è quindi oggettivo Costo globale: considerando i reagenti e la manodopera risulta nettamente poco dispendioso

11 Trichin-L: Principio del metodo Il kit Trichin-L è basato sulla stessa principio di analisi del metodo ufficiale della digestione, approvato dalla EC Il kit Trichin-L è in grado di rilevare T. spiralis, T. britovi, T. pseudospiralis, T. papuae, ed altri È adatto a suini (1), cavalli ed altre specie di cinghiali selvatici. (1)Solo l applicazione ai suini è validata dalla Comunità Europea

12 Trichin-L: protocollo di analisi 1.Campionamento del tessuto 1 g. di tessuto (suino) 2.Macinazione e digestione della carne g di carne campionata dal gruppo ml di buffer di digestione (20 s) Digestione con pepsina : 30 minuti a 45 C +/- 1 C 3.Filtrazione Filtrazione su membrana da 20 µm 4.Solubilizzazione dell antigene Spezzettare il filtro con un pestello 5.Rilevazione dell antigene Reazione immunologica con Latex

13 Trichin-L: vantaggi chiave Metodo affidabile Sensibile e specifico come il metodo ufficiale Costo inferiore di analisi 10 minuti di manodopera in meno per campione Maggior rapidità nel processare le carcasse al mattatoio 20 minuti in meno per il risultato Semplice da leggere e da interpretare No osservazione al microscopio Controlli negativo e positivo inclusi per ogni analisi

14 Metodo altamente specifico Studi interni (R&D): Trichin-L: Affidabilità (1) 100% specificità (N=118/118) sui gruppi negativi, composti da vari tipi di tessuto carneo (base del diaframma, diaframma, lingua, massetere). Studi esterni (laboratori indipendenti): 100% specificità (N=90/90) sui gruppi negativi, composti da base del diaframma. Studi esterni (laboratori indipendenti): 100% specificità (N=167/167) sui gruppi negativi, composti da base del diaframma.

15 Trichin-L: Affidabilità (2) Sensibilità Valutazioni interne (R&D) 100% sensibilità (N=10/10) su campioni contaminati con 3 larve di T. spiralis o T. britovi per gruppo. 100% sensibilità (N=10/10) su campioni contaminati con 3 larve di T. spiralis per gruppo. Valutazioni esterne (laboratori indipendenti) 96.3% sensibilità (N=26/27)* su campioni contaminati** con 3 larve per gruppo. * Solo un campione contaminato con T. pseudospiralis non è stato rilevato. Le larve di T. pseudospiralis sono non incapsulate perciò più sensibili alla macinazione e alla digestione della carne ** campioni di carne da 100 g infettati con larve di 3 diverse specie di Trichinella: T. spiralis,t. britovi e T. pseudospiralis.

16 Trichin-L: Affidabilità (3) Rileva i ceppi più frequenti di Trichinella T.Spiralis T.pseudospiralis T.britovi T.papuae

17 Cross-Reattività Trichin-L: Affidabilità (4) Nessuna cross reattività in campioni infettati da: Anisakis pegreffi (0.1-1 mg) Ascaris lumbricoides (0.1-1 mg) Toxoplasma gondii (0.1-1 mg) Trichuris ( mg) Effetto Hook (falsa negatività da eccesso di antigene) Nessun effetto Hook testato fino a 2,000 larve per campione.

18 Trichin-L: vantaggi chiave Metodo affidabile Sensibile e specifico come il metodo ufficiale Costo inferiore di analisi Almeno 20 minuti di manodopera in meno per campione Maggior rapidità nel processare le carcasse al mattatoio 20 minuti in meno per il risultato Semplice da leggere e da interpretare No osservazione al microscopio Controlli negativo e positivo inclusi per ogni analisi

19 Trichin-L: vantaggi chiave Metodo affidabile Sensibile e specifico come il metodo ufficiale Costo inferiore di analisi Almeno 20 minuti di manodopera in meno per campione Maggior rapidità nel processare le carcasse al mattatoio 40 minuti in meno per il risultato Semplice da leggere e da interpretare No osservazione al microscopio Controlli negativo e positivo inclusi per ogni analisi

20 Trichin-L: rapidità 1- Campionamento/Pesatura campione 20 min Preparazione Buffer 5 min 1- Campionamento/Pesatura campione 20 min Preparazione Buffer 5 min 2- Digestione enzimatica a 46 C 30 min 2- Digestione enzimatica a 46 C 30 min Trasferimento 2 min 3- Filtrazione: 5 min 3-1a sedimentazione 30 min Trasferimento 1 min 4- Solubilizzazione antigene: 3 min 4-2a sedimentazione: 10 min Trasferimento 1 min 5- Detection : 2 min + 10 min (incubazione) 5- Osservazione al microscopio: 10 min Lavaggio 5 min Lavaggio 10 min

21 Trichin-L: vantaggi chiave Metodo affidabile Sensibile e specifico come il metodo ufficiale Costo inferiore di analisi 10 minuti di manodopera in meno per campione Maggior rapidità nel processare le carcasse al mattatoio 20 minuti in meno per il risultato Semplice da leggere e da interpretare No osservazione al microscopio Controlli negativo e positivo inclusi per ogni analisi

22 Semplicità di interpretazione (1) Nessuna interpretazione al microscopio Meno tempo sprecato sul microscopio Oggettività del risultato: riduzione del rischio di falsi negativi e delle responsabilità dell operatore conseguenti riduzione del rischio di falsi positivi e dei blocchi produttivi conseguenti

23 Semplicità di interpretazione (2) Il risultato del campione viene direttamente confrontato coi controlli Negativo / Positivo Lettura dopo 10 minuti 1 x Controllo Neg. + 1 x Controllo Pos. inclusi in ogni analisi

24 Il kit contiene reagenti per eseguire 80 tests (fino a 78 campioni) Reagenti inclusi nel kit Pepsina 2 x 300 gr Test cards x 10 Membrane filtranti x 60 Buffer di solubilizzazione x 1 Latex beads x 1 Negative control vial x 1 Positive control vial x 1 Sticks x 80 La shelf life del kit è 12 mesi Contenuto del kit

25 Accessori richiesti Gli accessori richiesti per il kit sono minimi Omogeneizzatore Agitatore magnetico riscaldante Unità di filtrazione e pompa da vuoto Pestello Agitatore orbitale Tri-dimensionale NO imbuti di vetro per separazione! NO microscopio! Tutti questi accessori sono disponibili a catalogo Bio-Rad Le performance del kit sono validate con gli accessori originali Bio-Rad

26 Accessori Richiesti Tutti i reagenti e i consumabili sono inclusi nel kit, eccetto: Un consumabile : tubi tipo Falcon da 15 ml Una soluzione: Soluzione di Acido Cloridrico (non fornita)

27 Tappe di validazione EURL Ott. 2010: formazione all ISS di Roma (EURL) Ott/Nov. 2010: studio di validazione multicentro NRL per Trichinella a Upssala, Svezia Dr Zakrisson NRL per Trichinella a Innsbruck, Austria Dr Glawischnig NRL per Trichinella a Bruxelles, Belgio Dr Claes NRL per Trichinella in Estonia Dr Musting EURL ISS Roma Dr Pozio (CRL) Dic. 2010: CRL report di validazione inviato a DG SANCO & Bio-Rad

28 Validazione EURL: risultati Materiale non digerito Sensibilità N=10 campioni Trichinella-negativi Criteri: < 5% del campione di partenza rimasto nel filtro Campione rimanente testato con Trichin-L: 1,7 g [0 4,9g] Campioni contaminati 15 larve (N=10) 6 larve (N=10) 3 larve (N=10) Criteri minimi richiesti 75 % 50% (3 larve) 33,3 % (1 larva) Trichin-L performances 100 % 100 % 100 % Conclusione «La conclusione complessiva è che il Trichin-L Antigen Test Kit soddisfa pienamente i requisiti per una rilevazione accurata di larve di Trichinella in carne suina»

29 Validazione EURL 01/2011: Dr Pozio presenta Trichin-L a DG SANCO Presenti: rappresentanti degli stati membri dell EU Presentazione del report di validazione 01/2011: Bio-Rad presenta Trichin-L a DG SANCO 03/2011: Dr Pozio risponde alle domande dell EU Domande presentate da ciascuno degli stati membri 04/2011: Approvazione EU per Trichin-L 11/2011: Publicazione in GUCE della variazione alla 2075/2005 ad includere Trichin-L

30 Codici Prodotto Trichin-L Antigen Test Kit (80 tests) Reagent kit for the detection of Trichinella antigens in swine meat Blender 1,25 L 2 speeds Manual Pestle D Giratory Rocker Filtration Ramp System One-branch Vented Filter Station Single Base with Frit ml Steel Funnel Heavy Wall Red Rubber Tube Sieve 100 mm (180 µm aperture) Thick Walled 10 L Bottle Closure 83 B, 2 ports ¼ Vacuum Pump IP-20T T.spiralis Antibody test kit (96 tests) ELISA assay for the detection of antibodies against Trichinella spiralis in swine sera, plasma or meat juice (96 test)

31 Contatti Generon è il distributore ufficiale dei prodotti Food Science di Bio-Rad per le regioni Piemonte Liguria e VDA, Lombardia, Emilia-Romagna, Marche, Puglia e Basilicata Responsabili commerciali di zona Piemonte, Liguria e VDA Stefano Callea - stefano.callea@gmail.com Lombardia Daniela Superchi - dsuperchi@gmail.com Triveneto Nicola Bortoletto - nicola.bortoletto@generon.it Emilia Romagna, Marche, Nord Toscana Caterina Novi - caterina.novi@gmail.com Sud Toscana (AR, SI, GR), Lazio, Abruzzo Antonio Caturani - antonio.caturani@biogenia.it Puglia e Basilicata Vito Lorusso - lorusso.v1@virgilio.it Altre regioni Enrico Arletti - enrico.arletti@generon.it Stradello Aggazzotti, S. Maria di Mugnano (Mo) Italy Tel Fax info@generon.it Web: