Analisi delle Risposte della VEQ in Coagulazione. Anna Paola Cellai

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1 Analisi delle Risposte della VEQ in Coagulazione Anna Paola Cellai

2 Centro di Riferimento Sicurezza di Qualità Valutazione esterna di qualità V.E.Q. Coagulazione 2013 Laboratori partecipanti: 541

3 Tempo di Protrombina (PT: INR) Imprecisione-Inesattezza metodi

4 Tempo di Tromboplastina Parziale Attivato (APTT:Ratio) Imprecisione-Inesattezza metodi

5 Fibrinogeno Imprecisione-Inesattezza metodi

6 Valutazione esterna di qualità (VEQ) L analisi dei risulati di un programma di VEQ sufficientemente ampio, permette non solo di valutare l accuratezza del singolo lab ma anche di verificare la qualità dei reagenti e la performance di singoli metodi ovvero di identificare quei reagenti/metodi producono risultati inaffidabili

7 D-Dimero

8 COS E IL D-DIMERO? Il D-Dimero è un frammento proteico rilasciato in circolo durante il processo di degradazione della fibrina cross-linked Significato: la presenza indica attivazione della fibrinolisi successiva ad attivazione della coagulazione

9 FIBRINOLISI Fibrinogeno D E D trombina Fibrina D D D E D E D fattore XIII D D E D F.A.B F.A.B PLASMINA Fibrinopeptidi A, B PLASMINA D D Frammenti X, Y, E, D Fibrinogen Degradation Products D-Dimero (+ D-Dimero contenuto nei frammenti:, DDE, YD/YD, YY/DXD)

10 Degradazione della fibrina stabilizzata due domini-d tenuti insieme da catene γ - Il D-dimero rappresenta una piccolissima quota dei diversi prodotti di degradazione della fibrina stabilizzata presenti nel plasma - Il plasma contiene una miscela di prodotti di degradazione (ciascuno dei quali contiene il D-dimero) che sono molto diversi tra loro (anche per peso molecolare)

11 METODI DI DETERMINAZIONE DEL D-DIMERO La misura del D Dimero è stata resa possibile dallo sviluppo di anticorpi monoclonali in grado di legarsi ad epitopi presenti sul frammento D-D ma assenti sulla fibrina, sul fibrinogeno o su frammenti non cross-linked della fibrina. Il complesso D Dimero-anticorpo monoclonale viene rivelato o dall aggiunta di un secondo anticorpo marcato con una sostanza fluorescente o cromogenica o mediante la rivelazione turbidimetrica di agglutinati

12 Metodi per la determinazione del D-Dimero ELISA (test quantitativo): richiede tempi di esecuzione lunghi, ha elevata sensibilità, ha elevato VPN Agglutinazione di particelle di lattice su vetrino (semiquantitativo, manuale): ha bassa sensibilità e basso VPN, operatore dipendente Immunoturbidimetrico:(quantitativo, automatizzato): rapido, buona sensibilità e buon VPN Agglutinazione su sangue intero: (qualitativo/quantitativo), eseguibile al letto del paziente, buona sensibilità e buon VPN, operatore dipendente.

13 Summary of the characteristics of various DD assays Prisco D, Semin Thromb Hemost 2009

14 PROBLEMI Standardizzazione dei metodi eterogeneità dell analita scelta del calibratore tipo di anticorpi monoclonali utilizzati

15 Eterogeneità dell analita D Dimero isolato presente in piccola quantità Frammenti più grandi frequentemente aggregati Miscela di prodotti di degradazione

16 Dosaggio del D-Dimero: calibratori La scelta del calibratore è complessa, poiché difficilmente essa rifletterà l eterogeneità dei prodotti di degradazione Due possibili tipi di calibratori: - D-Dimero purificato = risultati in unità D-Dimero - Fibrina stabilizzata digerita con plasmina = risultati in unità di fibrinogeno equivalenti (FEU) o in unità D- Dimero. Una unità FEU due unità D-Dimero

17 Dosaggio del D-Dimero: specificità degli anticorpi Il D-Dimero, contenuto all interno dei diversi prodotti di degradazione, può avere una diversa immunoreattività per l anticorpo usato, in funzione della diversa esposizione degli epitopi - lo stesso Ab monoclonale può reagire differentemente con frammenti diversi - lo stesso frammento può reagire differentemente con differenti Ab monoclonali

18 STANDARDIZZAZIONE dei metodi per il dosaggio dei D-Dimeri Dal 1993 il SSC per la standardizzazione dei metodi della ISTH ha fatto vari tentativi di standardizzazione utilizzando materiali diversi (D-Dimero purificato, plasma di pazienti con CID) ma nessuno di questi materiali ha permesso la standardizzazione dei vari metodi commerciali

19 DD HS DD VIDAS DEU FEU < 250 ng/ml < 500 ng/ml paziente A paziente B paziente C paziente D paziente E paziente F

20 Range di normalità e cut-off clinici

21 Piccole quantità di D-Dimero sono rilevabili in bassa concentrazione nel plasma di soggetti sani, il che indica che esiste uno stato di equilibrio fra la formazione di fibrina e la sua lisi anche in condizioni fisiologiche. I livelli di D-Dimero aumentano in tutte quelle condizioni che comportano la formazione e la successiva degradazione della fibrina stabilizzata

22 Cut-off clinici Nella maggior parte delle applicazioni cliniche non interessa sapere se un valore dei D-dimeri è normale o patologico riferendosi ad una popolazione sana, bensì se si può escludere/confermare sulla base del risultato la presenza di una certa patologia

23 Uso del D-Dimero nella diagnosi della trombosi venosa profonda e dell embolia polmonare I metodi per il dosaggio del D-Dimero hanno un elevata sensibilità ma bassa specificità e vengono utilizzati per il loro ELEVATO VALORE PREDITTIVO NEGATIVO. Un valore elevato di D-Dimero non è diagnostico per la trombosi venosa o l embolia polmonare, mentre un risultato normale esclude il sospetto di tali patologie

24 D-Dimero e tromboembolia venosa Scelta del cut-off Ottimale se calcolato in uno studio pilota (curva ROC) Buono se derivato dalla letteratura Evitare l uso del range di normalità

25 D-Dimero Imprecisione-Inesattezza metodi FEU

26 Documento di consenso AcEMC, CISMEL, SIBioC e SIMeL sull utilizzo del D-dimero per il sospetto di tromboembolismo venoso in urgenza. G.Lippi, G.Cervellin, I.Casagranda, B. Morelli, S.Testa, A.Tripodi SIBioC

27 Riassunto delle indicazioni di consenso per la determinazione del D- dimero in urgenza in pazienti con sospetto tromboembolismo venoso (TEV). Tab SIBioC

28 Potential of an age adjusted D-dimer cut-off value to improve the exclusion of pulmonary embolism in older patients: a retrospective analysis of three large cohorts R.A.Douma et al BMJ 2010

29 Proteina C

30 Proteina C Glicoproteina vitamina K-dipendente Doppia catena (catena leggera PM 21 KD, catena pesante PM 41 KD) Sintetizzata nel fegato ed escreta dai reni Emivita di 7 ore Forma nativa non attiva Primo difetto ereditario scoperto nel 1981

31 L attivazione della PC avviene a livello della superficie endoteliale dal complesso Trombina-Trombomodulina La PS agisce come cofattore della APC Thrombin Protein C P s APC Thrombin Protein C THROMBOMODULIN

32 a R La proteina C attivata (APC) degrada i fattori Va e VIIIa della coagulazione

33 Proteina C Difetto congenito Trasmissione autosomica dominante mutazioni genetiche identificate ~ 160 Fenotipicamente si distinguono difetti: (tipo I) quantitativi (tipo II) qualitativi Aumento del rischio associato a trombosi venoso, dubbio quello arterioso Livelli attesi: eterozigoti 40-60% omozigoti 0-15%

34 PROTEINA C Prevalenza del deficit congenito Popolazione generale : % Soggetti con manifestazioni tromboemboliche : 3.2 % Soggetti con tromboembolismo recidivante e in età giovanile (< 45 a.) : %

35 Approccio della diagnosi di laboratorio dei difetti di Proteina C Metodi immunologici ELISA Immunodiffusione radiale Immunoturbidimetria Nefelometria Metodi funzionali Cromogenici, Coagulativi Attivazione con Trombina Attivazione con Trombina-Trombomodulina Attivazione con veleno di rettile -Protac

36 DEFICIT DI PROTEINA C I dosaggi funzionali si basano sull attivazione della Proteina C con veleno di serpente (Protac) e sua valutazione come capacità di allungare un aptt (metodo coagulometrico) o di agire su di un substrato cromogenico (metodo cromogenico) Il metodo coagulativo evidenzia tutti i difetti di tipo II, sensibile a tutte le possibili alterazioni della PC (interazione PC/ Ca 2+,fosfolipidi, PS, FV e FVIII) I livelli misurati con metodo coagulometrico possono diminuiti, nei pazienti con APC-resistence, FVIII risultare Falsi valori normali in soggetti con LAC

37 Metodo di riferimento per il dosaggio della Proteina C Proteina C (PC) metodo cromogenico (con veleno di rettile) non risente di lievi carenze fattoriali non risente di fattori interferenti ( FVIII, FVLeiden) migliore standardizzazione del metodo

38 Coagulazione ciclo 2013 Proteina C Metodi di dosaggio Il 6% esegue solo la Proteina C Totale(immunologica)

39 Coagulazione Ciclo 2013 Proteina C funzionale

40 Proteina S

41 Proteina S Glicoproteina vitamina K-dipendente Peso molecolare 64 KD Singola catena Sintetizzata dal fegato, dalle piastrine, dalle cellule endoteliali e dai megacariociti midollari ed è escreta dai reni Agisce come cofattore della proteina C attivata nella inattivazione dei fattori Va e VIIIa Emivita ore Primo difetto ereditario scoperto nel 1984

42

43 IL SISTEMA PROTEINA C / PROTEINA S Trombina Proteina S Proteina C Ca++ Proteina C attivata Va VIIIa Superficie piastrina Superficie cellula endoteliale Trombomodulina Degradazione proteolitica estensiva del Va e del VIIIa, primariamente sulla superficie piastrinica, ma anche su quella endoteliale e leucocitaria

44 Plasma Phenotype classification of protein S deficiencies and the estimated incidence Type PS activity Free PS antigen Total PS antigen Estimated Incidence* I Decreased Decreased Decreased Up to 80% II Decreased Normal Normal 0,1-5% III Decreased Decreased Normal Up to 20% * % for each type Marlar R, Am.J. of Hematology 2011

45 Prevalence of thrombophilia and rela1ve risk es1mates for various clinical manifesta1ons Protein S deficiency Prevalence in the general popula1on %?? Rela1ve risk for a first venous thrombosis 1 10 Rela1ve risk for recurrent venous thrombosis Rela1ve risk for arterial thrombosis No consistent associa1on Rela1ve risk for pregnancy complica1ons Middeldorp s et al., British Journal of Haematology, 2008

46 Metodi per la determinazione della Proteina S Immunologici Coagulativi Immunoelettroforesi bidimensionale Elettroimmunodiffusione IRMA ELISA (PS tot PS libera) Immunoturbidimetrico (PS libera) Prolungamento dei tempi di coagulazione: aptt o PT, con fattore Xa, indotto dalla PC attivata in funzione della proteina S (Interferenze: Fatt.V Leiden, elevati livelli di Fatt. VII e Fatt.VIII)

47 Metodi funzionali basati sul PT Il test coagulativo determina l attività funzionale della proteina S eseguendo un tempo di protrombina (PT) modificato in presenza di Fattore tissutale, fosfolipidi, ioni calcio e Proteina C attivata (apc). L attività della proteina S è direttamente proporzionale all allungamento del tempo di coagulazione del plasma carente di Proteina S che diluisce il plasma del campione in esame Evidenzia tutti e tre i tipi di deficit

48 Metodo di riferimento per il dosaggio della Proteina S Proteina S (PS) libera metodo immunologico non risente di fattori interferenti ( FVIII, FVIIa, FVLeiden) migliore standardizzazione del metodo

49 Proteina S totale immunologica Immunoelettroforesi secondo Laurell RIA (RadioImmunoAssay) IRMA (ImmunoRadioMetricAssay) ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) La scelta di un kit tra quelli che offre il mercato deve essere operata sulla base delle caratteristiche di sensibilità e di specificità del kit stesso. Inoltre è importante che: 1- sia la PS libera che la PS legata al C4bBP siano riconosciute dall anticorpo utilizzato nel kit 2- I risultati non devono essere influenzati dalle variazioni della frazione legata al C4bBP In alternativa occorre ricorrere a diluizioni piuttosto elevate dei campioni e a lunghi tempi di incubazione per la completa dissociazione dei complessi C4bBP-PS

50 Test di 1 livello: Proteina C e S Raccomandati i seguenti dosaggi - Proteina C (dosaggio funzionale cromogenico) - Proteina S (immunologico della frazione libera) Proteina S (dosaggio funzionale coagulativo, se usato come test di 1 livello eseguire anche test immunologico della funzionale libera in caso di valore ridotto) -causa delle numerose interferenze: (FVL,>FVIII,LAC,FVIIa, ecc-) In presenza di un valore ridotto escludere la possibile presenza di condizioni che determinino una riduzione acquisita (nel caso ripetere a distanza di tempo) Dosaggio immunologico di Proteina C e Proteina S totale (solo per tipizzare i difetti)

51 Coagulazione ciclo 2013 Proteina S funzionale Metodi di dosaggio

52 Coagulazione Ciclo 2013 Proteina S Funzionale

53 Coagulazione Ciclo 2013 Proteina S Totale: 12 Laboratori eseguono la proteina S Totale 1 laboratorio esegue sia la protena S totale sia la proteina S funzionale

54 Lupus Anticoagulant

55 Lupus Anticoagulant Famiglia eterogenea di immunoglobuline di tipo IgG, IgM, IgA Nel nostro organismo sono responsabili di trombosi arteriose e/o venose, di aborti ripetuti, morti fetali In vitro provocano allungamento dei test fosfolipide dipendenti

56 SCELTA DEI TEST I test raccomandati sono : drvvt, SCT I due test devono basarsi su principi diversi L utilizzo di più di due test fosfolipide dipendenti aumenta il rischio di risultati falsamente positivi

57 J Thromb Haemost 2009

58 J Thromb Haemost 2009

59 DIAGNOSTICA DEL LAC Kaolin o Silica Clotting Time (KCT, SCT) Non contengono PL Sono molto sensibili Molto influenzati dalla presenza di piastrine residue Specificità ridotta dalla presenza di carenza di fattori Il SCT è una modificazione del KCT che ne consente l impiego su tutti gli strumenti

60 DIAGNOSTICA DEL LAC drvvt Il veleno di vipera Russell attiva il fattore X in presenza di ioni Ca, FV,e PL. Esistono molti reagenti commerciali che sono però molto diversi per sensibilità e specificità Molti kit commerciali forniscono anche un reagente di conferma (fosfolipidi concentrati)

61 TEST DI SCREENING MODALITA DI ESPRESSIONE - SECONDI DEI RISULTATI - RATIO R = SEC Tempo di coagulazione campione SEC Tempo di coagulazione pool plasmi normali

62 Studi di mixing Ripetere il test sulla miscela: plasma del paziente e plasma di un pool di soggetti sani in rapporto 1:1 (La miscela comunemente non è incubata a 37 C) drvvt (ratio) Cut-off INIBITORE Carenza fattoriale Carenza fattoriale P P+N

63 TEST DI MIXING MODALITA DI ESPRESSIONE DEI RISULTATI RATIO R = SEC Tempo di coagulazione miscela (paziente/pool plasmi normali V/V) SEC Tempo di coagulazione pool plasmi normali ICA = SEC tempo di miscela - sec tempo pool normale x 100 SEC tempo del paziente ICA = (Indice di anticoagulante circolante)

64 TEST DI CONFERMA Tempo di coagulazione in presenza di fosfolipidi in eccesso: PNP Triplett, Am J Clin Pathol, 1983 Fosfolipidi in fase esagonale Rauch, Thromb Haemost, 1989 Triplett, Thromb Haemost, 1993 (Questo tipo di conformazione rende i PL più disponibili a legare il LA : maggiore specificità) valore assoluto - delta - ratio

65 Test di conferma 2.4 drvvt (ratio) Cut-off 0.8 P P+fosfolipidi

66 Test Integrati per la rilevazione del LUPUS ANTICOAGULANT Modalità di espressione dei risultati: Indice % Correzione = [(Screening ratio-confirmation ratio)/screening ratio] x 100 Ratio Normalizzata (TR) = Screening Ratio/ Confirmation Ratio

67 Coagulazione 2 Ciclo 2014 Lupus Anticoagulant (LAC) * * -Non di competenza -Non eseguito * * -Negativo debole -Positivo: medio forte

68 Coagulazione 2 Ciclo 2014 Lupus Anticoagulant (LAC) test utilizzati Laboratori partecipanti: 70

69 come sono stati utilizzati i test per la rilevazione del LAC? %

70

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72 REFERTO Risultati analitici accompagnati da un commento sulla loro compatibilità con la presenza o assenza di lupus anticoagulant Per i casi positivi alla prima determinazione consigliare di ripetere il test dopo almeno 12 settimane

73 Grazie per l attenzione