Lipoprotein (a) ELISA
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- Michelina Baldini
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1 Istruzioni per l Uso Lipoprotein (a) ELISA Saggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di Lipoproteina a [Lp(a)] in siero umano, citrato e plasma EDTA. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 1. USO PREVISTO Saggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di Lipoproteina a [Lp(a)] in siero umano, citrato e plasma EDTA. 2. SOMMARIO E SPIEGAZIONI La lipoproteina(a) [Lp(a)] è un fattore di rischio per l aterosclerosi geneticamente determinato ed indipendente. Poco si sa riguardo alla funzione fisiologica ed al metabolismo della Lp(a). La concentrazione di questa lipoproteina nel siero può variare tra mg/dl. Con concentrazioni superiori a 30 mg/dl il rischio di sviluppo di aterosclerosi aumenta notevolmente, specialmente se si riscontra contemporaneamente un aumento di colesterolo LDL. La struttura della Lp(a) deriva dalla struttura della particella LDL. La Lp(a) è una particella LDL legata all apolipoproteina (a) [apo(a)] altamente glicosilata da uno o più ponti disolfuri. Omologie nelle sequenze di apo(a) e plasminogeno indicano una correlazione tra processi trombotici ed aterosclerotici. La composizione di proteine e lipidi dell Lp(a) è caratterizzata da eterogeneità intra- ed interindividuale. Finora sono state caratterizzate più di 30 isoforme. Non si sa se questa eterogeneità influenzi il rischio relativo di sviluppo dell aterosclerosi. In contrasto con altre lipoproteine, le concentrazioni di Lp(a) non si possono influenzare con un regime dietetico mirato. Farmaci che abbassano i valori dei lipidi riducendo le concentrazioni di LDL non esercitano alcun effetto sulla Lp(a). 3. PRINCIPIO DEL TEST Lp(a) è un test ELISA monofase, basato sul principio del sandwich. I pozzetti per il test ELISA sono rivestiti da anticorpi policlonali specifici anti-apo(a). In una prima fase d incubazione i campioni diluiti vengono incubati insieme al coniugato (incubazione del campione). Il coniugato consiste di un frammento Fab specifico, monovalente, anti-apo(a) abbinato a perossidasi (anti-apo(a) perossidasi coniugato). Durante il periodo d incubazione le particelle di Lp(a) sono legate in fase solida e contemporaneamente marcate dal coniugato. Componenti del siero aspecifici e coniugato non legato vengono rimossi con il lavaggio. In una seconda fase d incubazione (reazione del substrato) ha luogo la reazione enzimatica. La perossidasi è parte del coniugato e ossida la tetrametilbenzidina di substrato (TMB) dandole una colorazione blu. Per fermare la reazione si aggiunge acido solforico e la colorazione vira al giallo. L intensità della colorazione è direttamente proporzionale alla concentrazione di Lp(a) nel campione. La densità ottica si misura su una lunghezza d onda di 450 nm mediante un lettore per ELISA. La concentrazione di Lp(a) nel campione è indicata quantitativamente dalla curva di riferimento che si determina contemporaneamente. 4. AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Solo per uso diagnostico in-vitro. Solo per uso professionale. 2. Leggere attentamente le istruzioni prima di iniziare il test. Utilizzare il manuale fornito nel kit. Assicurarsi di aver compreso tutte le indicazioni. 3. In caso di danneggiamento del kit contattare IBL o il Vostro fornitore entro 1 settimana dal ricevimento della merce. Non utilizzare i componenti danneggiati ma conservarli per fornire prove del danno assieme al reclamo che inoltrerete al produttore/fornitore. 4. Rispettare lotto e scadenze. Non scambiare o mescolare tra loro reagenti di lotti diversi. Non usare i reagenti scaduti. 5. Attenersi alle Buone Pratiche di Laboratorio e alle direttive di sicurezza. Indossare camici, guanti in lattice e occhiali protettivi se necessario. 6. Alcuni reagenti del kit contengono sostanze pericolose che potrebbero causare irritazioni a pelle ed occhi. Consultare la sezione MATERIALE FORNITO e le etichette per i dettagli precisi. Schede di sicurezza del prodotto sono disponibili sul sito web IBL o su richiesta specifica ad IBL/fornitore. 7. I reagenti preparati e usati e le sostanze chimiche del kit devono essere trattati come rifiuti pericolosi secondo le normative di sicurezza e la legislazione vigente nel Paese in cui il prodotto viene usato. 8. Il personale delle pulizie dev essere informato dal personale specializzato sui possibili rischi e sulle procedure da adottare. 9. Evitare il contatto con la soluzione stop. Può causare irritazioni e ustioni della pelle. 10. Tutti i reagenti del kit contenenti siero umano o plasma sono risultati negativi rispetto a HIV I/II, HBsAg e HCV. Si raccomanda tuttavia di trattarli come potenzialmente pericolosi poiché non si può escludere in maniera assoluta la presenza di questi o di altri agenti infettivi. Version / 6
3 5. CONSERVAZIONE E STABILITÀ Il kit è spedito e trasportato a temperatura ambiente e deve essere conservato a 2-8 C. Non esporre a luce solare diretta e ad alte temperature. Le informazioni relative a conservazione e stabilità di tutti i reagenti e dei campioni sono riportate nel capitolo corrispondente. La micropiastra, il Substrato TMB ed il Tampone aperti sono stabile fino a 6 mesi se conservata nel suo involucro ben chiuso riposta a 2 8 C. 6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI Siero, Plasma (EDTA, Citrato) I campioni devono essere freschi. Ad una temperatura di -20 C possono essere conservati per vari mesi. I campioni non devono essere congelati/scongelati più volte. Osservare le classiche precauzioni durante il prelievo venoso. Conservare l integrità del campione di sangue dal momento del prelievo al momento dell esecuzione del test. Non usare campioni emolizzati, itterici o lipemici. I campioni torbidi devono essere centrifugati per rimuovere il materiale particolato al loro interno. Nota bene: Un aumento della concentrazione di Ca 2+ e ripetuti congelamenti/scongelamenti possono causare un aggregazione delle particelle di LDL, il che influenza i valori dell Lp(a). 7. MATERIALE FORNITO Quantità Simbolo Componente 1 x 12 x 8 MTP 1 x 1.3 ml ENZCONJ LYO 1 x 5 x 0.2 ml CAL 1-5 LYO 1 x 2 x 0.2 ml CONTROL LL LYO CONTROL HL LYO 2 x 100 ml CONC 2 x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP Micropiastra Pronto/a all uso. Strisce separabili. Rivestito con anticorpi anti-apo(a) da ovini, purificati per affinità, specifici, policlonali.. Coniugato Enzimatico liofilizzato Di colore blu. Contiene: perossidasa anti-apo (a), frammenti Fab da ovini policlonali, specifici, monovalenti. CAL 1-5 liofilizzato Contiene: Siero umano, stabilizzatori, conservativos. Per le concentrazioni esatte vedere le etichette o il Certificato di Controllo Qualità. Control LL+HL liofilizzato Controllo Positivo Siero, LL, Low Level, HL, High Level. Contiene: Siero umano, stabilizzatori, conservativos. Range accettabili vedere le etichette sulle provette o il certificato QC. Tampone Concentrato (10x) Contiene: detergenti, stabilizzatori, 0.01 % (w/v) Thimerosal, 0.4 M Tris/HCl; ph 8.4. Soluzione Substrato TMB Pronto/a all uso. Contiene: TMB (Tetramethylbenzidine). Soluzione Stop TMB Pronto/a all uso. Contiene: 0.5 M H 2SO 4. 2 x FOIL Pellicola Adesiva 8. MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI 1. Micropipette (Multipette Eppendorf o similari, < 3 % CV). Volumi: 5, 50, 100, 200, 1000 µl 2. Vortex mixer 3. Tubi per diluizione dei campioni 4. Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti 5. Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico 6. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d onda di riferimento nm) 7. Acqua bidistillata o deionizzata 8. Carta assorbente, puntali per pipette e timer Version / 6
4 9. NOTE PER LA PROCEDURA 1. Qualsiasi manipolazione impropria dei campioni o modifica alla procedura può compromettere i risultati. Rispettare rigorosamente i volumi, i tempi e le temperature di incubazione e i passaggi di pretrattamento dei campioni indicati in metodica. Utilizzare pipette calibrate. 2. Una volta iniziato il test completare tutti i passaggi senza interruzioni. Assicurarsi che tutti i reagenti siano stati precedentemente preparati in tempo utile. Far raggiungere la temperatura ambiente ai campioni e ai componenti del kit (18-25 C) e mescolare delicatamente ciascun reattivo liquido e campione prima dell uso. Non creare schiuma durante il mescolamento. 3. Evitare la contaminazione di reagenti, pipette, pozzetti o provette. Usare puntali di plastica nuovi per ogni reagente, standard e campione. Non scambiare i tappi tra loro. Tappare sempre i flaconi non utilizzati. Non riutilizzare pozzetti/provette o reagenti. 4. Si consiglia di saggiare i campioni in doppio per poter identificare eventuali errori di pipettamento. 5. Usare uno schema di pipettamento per realizzare un appropriata distribuzione sulla piastra. 6. Il tempo di incubazione influisce sui risultati. Tutti i pozzetti dovrebbero essere dispensati nello stesso ordine e sequenza temporale. Si raccomanda una pipetta multicanale a 8 canali per pipettare le soluzioni in tutti i pozzetti. 7. Il lavaggio della micropiastra è importante. Pozzetti lavati in modo inappropriato possono portare a risultati erronei. Si raccomanda una pipetta multicanale o un lavatore automatico per piastre. Non far asciugare i pozzetti tra le varie incubazioni. Non graffiare i pozzetti rivestiti durante risciacqui e aspirazioni. Risciacquare e versare i reagenti con cura. Durante i risciacqui assicurarsi che i pozzetti siano ben riempiti con la soluzione di lavaggio e che non ci siano residui nei pozzetti. 8. L umidità influisce sui pozzetti/tubi rivestiti. Non aprire l involucro finché non ha raggiunto la temperatura ambiente. Riporre immediatamente i tubi/pozzetti non utilizzati nell involucro con il disseccante. 10. ISTRUZIONI PRE-TEST Preparazione di componenti concentrati Diluire / dissolvere Componente con Diluente Rapporto Note Conservazione Stabilità 100 ml CONC 900 ml acqua bidist. 1:10 Mischiare bene. 2-8 C 2 mesi Preparazione di Componenti liofilizzati Diluire / Componente dissolvere con Diluente Note Conservazione Stabilità CAL C 2 settimane 1 flaconi Control LL Control HL 200 µl 1 flaconi ENZCONJ 1.30 ml Lasciare per 15 minuti a temperatura ambiente (18-25 C) e miscelare per 10 secondi sul miscelatore per campioni (evitare la generazione di schiuma). Dopo la ricostituzione, i calibratori ed i sieri di controllo sono chiari o leggermente torbidi Diluizione dei Standard, Controlli e Campioni CAL 1-5 Control LL Control HL Siero, Plasma ENZCONJ da diluire con Rapporto Note sempre sempre sempre 1: C 6 mesi 2-8 C 1 settimana -20 C 6 mesi p.e. 5 µl CAL + 10 ml p.e. 5 µl Control + 10 ml 1:2001 p.e. 5 µl + 10 ml 1:11 p.e. 400 µl ENZCONJ + 4 ml Stabilità: 60 min (18-25 C). Version / 6
5 11. PROCEDURA DEL TEST 1. Pipettare 100 µl di Soluzione di Coniugato in ogni pozzetto impiegato e in aggiunta pipettare 100 µl di calibratori diluiti controlli o campioni diluiti nei rispettivi pozzetti della piastra per microtitolazione (i calibratori devono essere collocati sulle strip 1 e 2). 2. Coprire la piastra con pellicola adesiva. Incubare per 120 min a TA (18-25 C). 3. Rimuovere la pellicola adesiva. Eliminare la soluzione d incubazione. Lavare la piastra 3 x con 250 µl Tampone diluito. Rimuovere l eccesso di soluzione picchiettando la piastra capovolta su una salvietta di carta. 4. Per aggiungere le Soluzioni Substrato e Stop usare, possibilmente, una micropipetta 8-canali. Pipettare con intervalli di tempo costanti per le Soluzioni Stop e Substrato. 5. Pipettare 200 µl di Soluzione Substrato TMB in ogni pozzetto. 6. Incubare per 30 min a TA (18-25 C). 7. Fermare la reazione del substrato aggiungendo 50 µl of Soluzione Stop TMB in ogni pozzetto. Mescolare delicatamente il contenuto agitando leggermente la piastra. 8. Misurare la densità ottica con un fotometro a 450 nm (lunghezza d onda di riferimento: nm) entro 10 min dopo aver pipettato la Soluzione Stop. 12. CONTROLLO DI QUALITA I risultati del test sono validi solo se il test è stato eseguito seguendo le istruzioni per l uso. L utente deve inoltre attenersi rigorosamente ai principi della BPL (Buona Pratica di Laboratorio) o a norme equivalenti. Gli utenti e il laboratorio devono avere un sistema di formulazione della diagnosi conforme alle Buone Pratiche di Laboratorio. Tutti i controlli devono risultare compresi entro gli intervalli accettabili indicati sulle etichette e il Certificato QC. Se i criteri non sono soddisfatti il test non è valido e dovrebbe essere ripetuto. Ogni laboratorio dovrebbe usare campioni noti come ulteriori controlli. Si consiglia la partecipazione a programmi di controllo qualità periodici. In caso di deviazioni devono essere forniti i seguenti dati: Scadenza dei reagenti (preparati), condizioni di conservazione, pipette, strumenti, condizioni d incubazione e metodi di lavaggio. 13. CALCOLO DEI RISULTATI La DO ottenute per gli standard (asse y, lineare) sono messe in grafico rispetto alla loro concentrazione (asse x, logaritmico) sia su carta per grafico semilogaritmico che con metodo automatico. Buoni risultati si ottengono con grafici cubic spline, 4 Parametri Logistica o Logit-Log. Per il calcolo della curva standard utilizzare ogni segnale degli standard (omettere ovviamente i valori dei duplicati molto al di fuori dei risultati attesi e impiegare il valore singolo più plausibile). La concentrazione dei campioni può essere ricavata dalla curva standard. La diluizione iniziale è stata presa in considerazione quando si sono letti i risultati sul grafico. I risultati di campioni con prediluizioni superiori devono essere moltiplicati per il fattore di diluizione. I campioni con concentrazioni superiori al più alto degli standards devono essere diluiti come descritto nel paragrafo ISTRUZIONI PRE-TEST e ritestati. La conversione del plasma citrato in valori sierologici si ottiene moltiplicando le concentraziioni registrate per il fattore 1.1. Tipica Curva di Calibrazione (Esempio. Non usare per il calcolo!) (OD) Lipoprotein (a) ELISA Standard mg/dl DO Media CAL CAL CAL CAL CAL (mg/dl) Version / 6
6 14. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI L interpretazione dei valori ottenuta è influenzata da fattori genetici (es. polimorfismo, differenze specifiche dei sessi e delle etnìe) e dalla distribuzione asimmetrica dell incidenza dei valori Lp(a): ad es. Il valore medio nelle popolazioni del Caucaso si avvicina a 10 mg/dl, nei Cinesi a 7 mg/dl e nei Sudanesi a 40 mg/dl. Per le popolazioni del Caucaso con livelli del plasma pari a mg/dl è stato descritta una percentuale di rischio dello sviluppo di sintomi aterosclerotici pari al 15-20%. I risultati dei test si interpretano secondo la tavola qui di seguito: Valutazione Lp(a) [mg/dl] I soli risultati non dovrebbero essere l unica motivazione Intervallo normale < 25 alla base di una scelta terapeutica. Devono essere Rischio elevato / limite correlati ad altre osservazioni cliniche e test diagnostici. Intervallo patologico >35 Si consiglia ad ogni laboratorio di calcolare i propri valori di riferimento. 15. PERFORMANCE Specificità Analitica (Reattività Crociate) Reazioni incrociate con plasminogeno e LDL sono al di sotto del limite di rilevamento. Gli anticorpi impiegati in questo dosaggio identificano tutte le isoforme conosciute di apo(a). Precisione Intervallo (mg/dl) CV Intervallo (%) Intra-Saggio Inter-Saggio Linearità Diluizione Misurato (mg/dl) Linearità (%) 1: : : : : : : : : : : : Sensibilità Analitica <5 mg/dl Confronto del metodo IBL-ELISA = x LEIA r = Standardizzazione: Non esiste né un metodo, né uno standard ufficiale per la determinazione dell Lp(a). Correlazione: I valori ottenuti con il Lipoprotein (a) ELISA hanno mostrato una buona correlazione con valori ottenuti con metodi turbidimetrici (vedi fig. 2). 100 Regression Plot 90% Confidence Bands Batch 0115 values found (mg/dl) Expected values (mg/dl) Y = 4, ,052 * X; R^2 =,95 Figura 2: Curva di correlazione ELISA/LEIA Version / 6
7 16. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 1. Berg, K.: A new serum type system in man - the Lp system; Acta Pathol. Microbiol. Scand. 59, (1963) 2. Dagen, M.M., Packard, C.J., Shepherd, J.: A comparison of commercial kits for the measurement of lipoprotein(a); Ann. Clin. Biochem. 28, (1991) 3. Dahlen, G.H.: Lipoprotein(a), Atherosclerosis and Thrombosis; Prog. Lipid. Res. 30/2+3, (1991) 4. Dahlen, G.H., Guyton, J.R., Attar, M., Farmer, J.A., Kautz, J.A., Gotto, A.M.: Association of levels of lipoprotein Lp(a), plasma lipids and other lipoproteins with coronary artery disease documented by angiography; Circulation 74, (1986) 5. Eaton, D.L., Fless, G.M., Kohr, W.J., McLean, J.W., Xu, Q-T., Miller, C.G., Lawn, R.M., Scanu, A.M.: Partial amino acid sequence of apolipoprotein(a) shows that it is homologous to plasminogen; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, (1987) 6. Edelberg, J.M., Pizzo, S.V.: Lipoprotein(a): The Link Between Impaired Fibrinolysis and Atherosclerosis; Fibrinolysis 3, (1991) 7. Kostner, G.M.: Immunochemische Bestimmung von Lipoprotein (a); Berichte der ÖGKC, Jg. 15, (1992) 8. Lawn, R.M.: Lipoprotein A und Herzinfarkt; Spektr. Wiss. 78 (08/1992) 9. Rhoads, G.G., Dahlen, G., Berg, K., Horton, N.E., Danneberg, A.L.: Lp(a) lipoprotein as a risk factor for myocardial infarction; JAMA 256, (1986) 10. Scanu, A.M.: Update on lipoprotein(a); Curr. Opin. Lipidol. 2, (1991) 11. Scanu, A.M.: Lipoprotein(a): A Genetic Risk Factor for Premature Coronary Heart Disease; JAMA 267/24, (1992) 12. Scanu, A.M. and Fless G.M.: Lipoprotein (a), heterogeneity and biological relevance; J. Clin. Invest. 85, (1990) 13. Steinmetz, A., Utermann, G.: Lipoprotein(a) als Risikofaktor für Arteriosklerose; Internist 33, (1992) 14. Utermann, G., Menzel, H.J., Kraft, H.G., Duba, H.C., Kemmler, H.G., Seitz, C.: Lp(a) glycoprotein phenotypes: inheritance and relation to Lp(a) concentrations in plasma; J. Clin. Invest. 80, (1987) 15. Utermann, G., Kraft, H.G., Menzel, H.J., Hopferweise, T., Seitz, C.: Genetics of the quantitative Lp(a) lipoprotein trait. I. Relation of Lp(a) glycoprotein phenotypes to Lp(a) lipoprotein concentrations in plasma; Hum. Genet. 78, (1988) Version / 6
8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /
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