HTLV I/II ELISA 3.0 DATA DI REVISIONE: 11/05 MBN 0011-ITA-1 NOME E USO PREVISTO

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1 DESCRIZIONE DEI SIMBOLI UTILIZZATI Sui prodotti MP Diagnostics e relative confezioni si possono trovare i simboli grafici descritti di seguito. Sono i simboli generalmente utilizzati per l etichettatura dei dispositivi medici. Per informazioni più dettagliate consultare la norma britannica ed europea BS EN 980: HTLV I/II ELISA 3.0 DATA DI REVISIONE: 11/05 MBN 0011-ITA T : (kit per 96 test) T : (kit per 192 test) T : (kit per 480 test) NOME E USO PREVISTO Nota: modifiche evidenziate HTLV I/II ELISA 3.0 di MP Diagnostics (MPD) è un test immunoenzimatico indicato per il rilevamento degli anticorpi anti HTLV-I e HTLV-II nel siero o nel plasma umano. È concepito come test di screening e richiede di ripetere l esecuzione dell analisi del campione inizialmente reattivo. Utilizzare entro Sinonimo: Data di scadenza Codice partita Sinonimi: Numero di lotto: Numero di partita Limitazione di temperatura Produttore Contiene il necessario per l esecuzione di <n> analisi Non riutilizzare Dispositivo medico diagnostico in vitro Numero di catalogo Attenzione. Vedere le Istruzioni per l uso Rappresentante autorizzato per la Comunità Europea Vedere le Istruzioni per l uso INTRODUZIONE Recenti studi epidemiologici condotti negli Stati Uniti e in Europa confermano una prevalenza mista di HTLV-I e HTLV-II in varie popolazioni a rischio, come i tossicodipendenti, che utilizzano sostanze per via endovenosa e i soggetti che sono sottoposti a trasfusioni. Sulla base dell esistenza della reattività crociata dei sieri anti-htlv-i e anti-htlv-ii verso il lisato virale, i kit di screening di prima generazione utilizzavano lisato virale HTLV- I mentre quelli di seconda generazione impiegano lisato virale HTLV-I e antigeni ricombinanti. Tuttavia i test immunologici di screening per HTLV I/II di prima e seconda generazione oggi disponibili, basati sul lisato virale mostrano una ridotta sensibilità per la determinazione di HTLV-II e un elevata incidenza di falsi positivi per individui non infetti. Per la determinazione degli anticorpi anti HTLV I e II occorre un test ELISA estremamente sensibile e specifico. HTLV I/II ELISA 3.0 di MP Diagnostics utilizza esclusivamente un gruppo di antigeni ricombinanti. Questo tipo di test garantisce il rilevamento di HTLV-I e HTLV-II per epitopi specifici. HTLV I/II ELISA 3.0 di MP Diagnostics è un test immunoenzimatico indicato per il rilevamento qualitativo degli anticorpi anti HTLV-I e HTLV-II nel siero o plasma umano. È concepito per lo screening di prima linea, richiede l esecuzione di analisi ripetute su campioni inizialmente reattivi e la conferma dei campioni ripetutamente reattivi tramite un test aggiuntivo come HTLV BLOT 2.4 di MPD. PRINCIPI CHIMICI E BIOLOGICI DELLA PROCEDURA I pozzetti delle strisce di micropiastre in polistirene sono rivestiti da una miscela di antigeni ricombinanti HTLV-I e HTLV-II che corrispondono ai segmenti altamente antigenici dei virus HTLV- I e HTLV-II. Il siero o plasma umano, diluito in un apposito tampone, viene incubato nei pozzetti. Gli anticorpi specifici anti HTLV-I/II, se presenti, si legano agli antigeni immobilizzati nella fase solida. I pozzetti vengono quindi accuratamente lavati per rimuovere ogni residuo di sostanze non legate e un anticorpo anti IgG umane purificato per affinità e coniugato con perossidasi di rafano viene aggiunto ai pozzetti. L anticorpo coniugato si lega ai complessi antigene-anticorpo formatisi in precedenza. Viene eseguito un lavaggio per rimuovere l eccesso di reagente coniugato. A ciascun pozzetto viene quindi aggiunta una soluzione di substrato contenente 3,3', 5,5' - tetrametilbenzidina (TMB). La presenza di anticorpi specifici viene indicata da una colorazione blu dopo l aggiunta del substrato. La reazione viene conclusa con l aggiunta di acido cloridrico. L intensità del prodotto di reazione giallo risultante viene misurata spettrofotometricamente a 450 nm ed è proporzionale alla quantità di anticorpi presenti nel campione. 1

2 COMPONENTI DEL KIT Descrizione dei componenti MICROPIASTRA HTLV Dodici strisce a 8 pozzetti per piastra. Ciascuno contiene proteine HTLV-I e HTLV-II ricombinanti adsorbite. Conservare a 2-8 C. Quantità fornita 1 PIASTRA 2 PIASTRE 5 PIASTRE 96 tests 192 tests 480 tests SOLUZIONE DI ARRESTO Soluzione di acido cloridrico di 1N. Conservare al buio, a 2 C - 8 C. Contenuto: 30 ml per flacone COPERCHI PER PIASTRE Coperchi adesivi per micropiastre da applicare durante l incubazione flacone flacone flaconi pezzi pezzi pezzi CONTROLLO NON REATTIVO Siero umano normale, non reattivo per anti HCV, anti HIV- 1/2, anti HTLV-I/II e HBsAg. Contiene sodio azide e thimerosal come conservanti. Contenuto: 280 Øl per provetta Conservare a 2-8 C CONTROLLO REATTIVO Siero umano inattivato contenente un alto titolo di anticorpi specifici per HTLV-I/II e non reattivi per anti HCV, anti HIV-1/2 e HBsAg. Contiene thimerosal e sodio azide come conservanti. Contenuto: 300 Øl per provetta Conservare a 2-8 C. DILUENTE Soluzione salina tris contenente siero di capra normale trattato al calore, albumina di siero bovino e stabilizzanti. Contiene Bronidox TM come conservante. Contenuto: 100 ml per flacone. Conservare a 2-8 C. SOLUZIONE CONCENTRATA LAVAGGIO PIASTRE (20X) Soluzione salina con tampone fosfato e Tween-20. Contiene cloroacetamide come conservante. Contenuto: 120 ml per flacone. Conservare a 2-8 C CONIUGATO Anticorpo di capra anti IgG umane coniugato con perossidasi di rafano. Contenuto: 70 Øl per provetta Conservare a 2-8 C. TAMPONE SUBSTRATO Tampone contenente 3,3', 5,5' - tetrametilbenzidina (TMB). Conservare al buio, a 2 C - 8 C. Contenuto: 120 ml per flacone provetta provette provette provetta provette provette flacone flacone flaconi flacone flacone flaconi provetta provette provette flacone flaconi flaconi MANUALE DI ISTRUZIONI * Bronidox TM è un marchio di Henkel Chemical Co. AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Solo per uso diagnostico in vitro. 2. Solo per uso professionale. 3. Per informazioni sui componenti potenzialmente pericolosi leggere le etichette apposte sui prodotti. NORME DI SICUREZZA copia copia copia ATTENZIONE: Questo kit contiene sostanze di origine umana. Nessun metodo di prova è in grado di garantire con assoluta certezza che i prodotti derivati dal sangue umano non trasmettano infezioni. MANIPOLARE I CAMPIONI PER L ANALISI NONCHÉ I CONTROLLI REATTIVI E NON REATTIVI COME AGENTI POTENZIAMENTE INFETTIVI. Si consiglia di manipolare i componenti e i campioni di analisi nel rispetto delle normali pratiche operative di laboratorio. Lo smaltimento del materiale dovrà essere effettuato in conformità alle procedure di sicurezza stabilite. Il controllo reattivo e il controllo non reattivo contengono thimerosal e sodio azide. Il sodio azide può reagire con il rame o il piombo utilizzati in alcuni impianti idraulici con la conseguente formazione di sali esplosivi. Sebbene le quantità utilizzate in questo kit siano limitate, si raccomanda comunque di smaltire sempre i materiali contenenti azide in abbondante acqua corrente onde evitare l accumulo di metallo-azide nell impianto idraulico. Di seguito sono riportate le frasi relative a rischi (R) e sicurezza (S). R20/21/22 Nocivo per inalazione, contatto con la pelle e ingestione. R32 A contatto con gli acidi sprigiona gas altamente tossico. S7-32 Mantenere il recipiente ermeticamente chiuso. Non respirarne i vapori. S35 Questo materiale e il recipiente che lo contiene devono essere smaltiti in modo sicuro. S36 Indossare abiti protettivi. S46 Se ingerito, richiedere immediatamente assistenza medica e mostrare questo recipiente o l etichetta. 2

3 li Diluente contiene Bronidox e Tris, classificato secondo le direttive della Comunità Economica Europea (CEE) come Irritante (Xi). Di seguito sono riportate le frasi relative a rischi (R) e sicurezza (S). R36/38 Irritante per occhi e pelle. S26/28 In caso di contatto con gli occhi, sciacquare immediatamente con abbondante acqua e richiedere assistenza medica. In caso di contatto con la pelle, lavare immediatamente con abbondante acqua. Il Concentrato per lavaggio della piastra (20X) contiene il 2% di cloroacetammide classificato secondo le direttive della Comunità Economica Europea (CEE) come Irritante (Xi). Di seguito sono riportate le frasi relative a rischi (R) e sicurezza (S). R22-43 Nocivo per ingestione. A contatto con la pelle può causare sensibilizzazione. S22-36/37-45 Non respirare la polvere. Indossare abiti e guanti protettivi. In caso di incidente o di malessere, richiedere immediatamente assistenza medica (se possibile, mostrare l etichetta). 1. Evitare la contaminazione microbica dei reagenti nell aprire le provette o i flaconi originali e prelevare i materiali. 2. Non pipettare con la bocca. 3. Maneggiare i campioni d analisi, le micropiastre, i controlli reattivi e non reattivi come agenti potenzialmente infettivi. 4. Indossare indumenti da laboratorio e guanti monouso durante l esecuzione delle analisi. I guanti devono essere gettati negli appositi contenitori a rischio biologico. Lavarsi accuratamente le mani al termine dell operazione. 5. Si raccomanda di eseguire il test in una struttura apposita per test con rischio di contaminazione biologica. 6. Evitare il contatto dei materiali con cibi e bevande. 7. In caso di contatto con gli occhi sciacquare immediatamente con abbondante acqua e richiedere assistenza medica. 8. In caso in ingestione o di contatto dei materiali contaminati con ferite aperte o altre lacerazioni cutanee, consultare immediatamente il medico. 9. L acido cloridrico può causare bruciature. EVITARE IL CONTATTO. In caso di contatto con la pelle, lavare accuratamente con acqua. 10. Evitare che l acido cloridrico entri in contatto con metalli o agenti ossidanti. 11. Non esporre i tamponi e le compresse di substrato ad eccessiva luminosità. Utilizzare pinze non metalliche per maneggiare le compresse di OPD. 12. Non aggiungere mai acqua alla soluzione di arresto. 13. Asciugare immediatamente ogni versamento di materiale potenzialmente infettivo con carta assorbente e tamponare l area contaminata con una soluzione di ipoclorito di sodio all 1% prima di riprendere il lavoro. In presenza di versamenti di sostanze contaminanti acide, asciugare l area con carta assorbente prima di applicare l ipoclorito di sodio. Tutto il materiale usato (inclusi i guanti monouso) dovrà essere smaltito come materiale a rischio biologico. Non autoclavare il materiale contenente ipoclorito di sodio. 14. Prima dell eliminazione, sterilizzare in autoclave tutto il materiale utilizzato econtaminato a 121 C a 15 p.s.i. per 30 minuti. In alternativa, decontaminare i materiali in una soluzione di ipoclorito di sodio al 5% per minuti prima di gettarli negli appositi contenitori a rischio biologico. 15. Decontaminare tutti i reagenti e le sostanze chimiche impiegate in una soluzione di ipoclorito di sodio con una concentrazione finale pari almeno all 1%. Lasciare agire per 30 minuti per garantire una efficace decontaminazione. PRECAUZIONI DI IMPIEGO 1. È possibile utilizzare campioni di siero o di plasma raccolti in EDTA, eparina o citrato di sodio. Prima della conservazione, accertarsi che i coaguli o le cellule ematiche siano state separate prima della centrifugazione. 2. Per ottenere prestazioni ottimali dal test occorre SEGUIRE RIGOROSAMENTE le procedure illustrate nel presente Manuale di istruzioni. Qualsiasi deviazione dalla procedura può provocare risultati erronei. 3. NON MODIFICARE O SCAMBIARE REAGENTI DI KIT APPARTENENTI A LOTTI DIVERSI. I controlli, il coniugato e le micropiastre sono stati abbinati per ottenere prestazioni ottimali. Utilizzare unicamente i reagenti forniti con il kit. 4. Non utilizzare i componenti del kit dopo la data di scadenza riportata sulla confezione. 5. Evitare la contaminazione microbica dei reagenti nell aprire le provette o i flaconi originali e nel prelevare i materiali poiché ne potrebbero derivare risultati erronei nonché la prematura riduzione della durata di conservazione del prodotto. Utilizzare tecniche asettiche, incluse pipette o puntali di pipette monouso, per l aspirazione dei materiali dai flaconi. 6. Per evitare una contaminazione incrociata, cambiare la punta della pipetta tra un campione e l altro e non toccare le estremità delle strisce, il bordo dei pozzetti o il liquido contenuto nei pozzetti con le dita o con i puntali delle pipette. 7. Tutto il materiale di vetro che sarà utilizzato con i reagenti dovrà essere lavato con acido cloridrico 2M e sciacquato abbondantemente con acqua distillata o deionizzata prima dell uso. 8. Per ottenere risultati ottimali, lasciare che tutti i reagenti e i campioni raggiungano la temperatura ambiente (25 C ± 3 C) prima dell uso. Riportarli ad una temperatura di 2-8 C subito dopo l uso. 9. Per diluire i reagenti utilizzare unicamente acqua deionizzata, distillata o comunque di qualità elevata. 10. Tutti i reagenti dovranno essere miscelati accuratamente prima dell uso. 11. La soluzione di coniugato e il tampone di lavaggio diluito devono essere preparati nuovamente prima dell uso. 12. Evitare di esporre i reagenti o di eseguire i test in un ambiente contenente un grado elevato di vapori di disinfettanti chimici (ad es. vapori di ipoclorito) durante le fasi di conservazione e incubazione. Il contatto inibisce la reazione cromatica. Non esporre i reagenti ad eccessiva luminosità. 3

4 13. Non rimuovere le micropiastre delle apposite confezioni se non immediatamente prima dell uso. Le strisce aperte e non utilizzate devono essere conservate a 2 C - 8 C nel portastrisce dotato di materiale assorbente. 14. I controlli del kit devono essere analizzati contemporaneamente ai campioni dei pazienti per ogni ciclo di analisi. 15. Evitare accuratamente di toccare il bordo del pozzetto o di contaminarlo con goccioline di coniugato. Non soffiare materiale fuori dalle micropipette. Quando sia possibile, si raccomanda di utilizzare il pipettaggio inverso. 16. L utilizzo di campioni altamente emolizzati, di siero non completamente coagulato, di campioni di plasma contenenti fibrina o di campioni con contaminazione microbica può essere causa di risultati erronei. 17. NON UTILIZZARE INCUBATORI AD ACQUA PER INCUBARE LE PIASTRE. 18. Non utilizzare incubatori a CO Durante l incubazione a 37 C, è necessario prevenire l evaporazione. Coprire le piastre con i coperchi adesivi forniti in dotazione. 20. Evitare la ripetuta apertura e chiusura della porta dell incubatore durante le fasi di incubazione. 21. Evitare di conservare la soluzione di arresto in un piatto piano o di versarla in un flacone di scorta dopo l utilizzo. 22. Accertarsi che il fondo della piastra sia pulito e asciutto e che non si siano formate bolle sulla superficie del liquido prima di leggere la piastra. Rimuovere le eventuali bolle presenti nel pozzetto picchiettando delicatamente. 23. In caso di impiego di strumentazione automatica, accertarsi che questa sia validata prima dell uso. 24. Si raccomanda vivamente di condurre la manutenzione ordinaria del sistema di aspirazione / lavaggio per evitare ogni rischio di contaminazione dai campioni altamente reattivi ai campioni non reattivi. ISTRUZIONI PER LA CONSERVAZIONE 1. Conservare il kit HTLV I/II ELISA 3.0 di MPD e i relativi componenti a 2-8 C quando non sono utilizzati. 2. Se conservati a una temperatura compresa tra +2 e +8 C, le strisce e i reagenti, chiusi o non aperti, sono stabili fino alla data di scadenza riportata sul kit. Non congelare i reagenti. 3. Dopo l apertura, la stabilità del kit è garantita per 12 mesi. È da considerarsi valida la data di scadenza più ravvicinata del kit, sia chiuso che aperto. 4. La conservazione del concentrato di lavaggio piastre (20x) a 2-8 C può provocare la formazione di cristalli che dovranno essere sciolti riscaldando il concentrato a 37 C prima dell uso. 5. La conservazione del diluente a 2-8 C può provocare la formazione di precipitato. Questo, tuttavia, non avrà alcuna influenza sulle prestazioni del kit. 6. Le strisce di micropiastre aperte e non utilizzate devono essere conservate a 2-8 C con il materiale assorbente in dotazione in una confezione chiusa. RACCOLTA, TRASPORTO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI È possibile utilizzare campioni di siero o di plasma raccolti in EDTA, eparina o citrato di sodio. Prima della conservazione, accertarsi che i coaguli o le cellule ematiche siano state separate prima della centrifugazione. I campioni devono essere conservati a 2-8 C se il test deve essere eseguito entro 7 giorni dalla raccolta oppure congelati a -20 C o temperature inferiori se il test è previsto per una data successiva. Utilizzare preferibilmente campioni trasparenti e non emolizzati. I campioni lipemici, itterici o contaminati (a causa di particelle) devono essere filtrati (0,45Øm) o centrifugati prima dell analisi. Il siero dei pazienti può essere inattivato, tuttavia ciò non è indispensabile per ottenere risultati ottimali. Per l inattivazione, procedere nel modo seguente: 1. Allentare i cappucci dei contenitori del siero. 2. Riscaldare il siero a 56 C per 30 minuti in un incubatrice ad acqua. 3. Lasciare raffreddare il siero prima di serrare nuovamente i cappucci. 4. Fino al momento dell analisi, il siero può essere conservato congelato. Si raccomanda di non sottoporre il siero dei pazienti a ripetuti cicli di congelamento e scongelamento. MATERIALI OCCORRENTI MA NON PRESENTI NEL KIT 1. Carta assorbente da banco monouso e salviette di carta. 2. Provette o contenitori in polipropilene. 3. Pipette graduate: 5 ml, 10 ml. 4. Pipetta multicanale in grado di erogare 50 Øl, 100 Øl e 200 Øl. 5. Pipetta in grado di erogare Øl. 6. Punte di pipette monouso. 7. Serbatoi di reagente (vaschette) con capacità di 25 ml. 8. Acqua deionizzata o distillata, di grado reagente. 9. Matracci: 500 ml, 1 litro. 10. Lavatore automatico per micropiastra ELISA. In alternativa, il lavaggio può essere eseguito manualmente utilizzando una pipetta multicanale a volume 0,3 ml e un dispositivo aspiratore. 11. Un incubatore da 37 ± 1 C. 12. Lettore di piastre per microanalisi a lunghezza d onda doppia (A 450 -A 620 ) o singola (A 450 ). 13. Soluzione di ipoclorito di sodio (5%) o candeggina liquida per uso domestico. 4

5 PREPARAZIONE DEI REAGENTI 1. SOLUZIONE DI LAVORO DEL CONIUGATO a. La SOLUZIONE DI LAVORO DEL CONIUGATO deve essere preparata subito prima dell uso. b. Per preparare il coniugato diluito, diluire 1:500 con il diluente fornito nel kit, ad esempio 10 Øl di coniugato in 5 ml di diluente. c. Utilizzare unicamente contenitori o provette in polipropilene. d. Una micropiastra richiede 12,0 ml di CONIUGATO ATTIVO. TABELLA DI PREPARAZIONE DEL CONIUGATO Numero di test Vol. di coniugato (Øl) Vol. di diluente (ml) 24 10,0 5, ,0 7, ,0 10, ,0 12,0 2. TAMPONE DI LAVAGGIO DILUITO a. Il TAMPONE DI LAVAGGIO DILUITO deve essere preparato subito prima dell uso. b. Diluire 1 volume di SOLUZIONE CONCENTRATA LAVAGGIO PIASTRE in 19 volumi di acqua distillata (grado reagente). Mescolare accuratamente. Per il lavaggio di 1 piastra sono necessari circa 400 ml di tampone di lavaggio. PROCEDURA DI ANALISI IMPORTANTE: Le analisi immunologiche di questo tipo sono sensibili alla temperatura e soggette a vincoli temporali. La rigorosa osservanza della presente procedura garantisce prestazioni ottimali dell analisi. Qualsiasi deviazione dalla procedura raccomandata può provocare risultati erronei. 1. Estrarre la micropiastra dalla confezione in alluminio. 2. Agitare il campione e controllare le provette prima dell uso. 3. Riempire con DILUENTE. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 200 Øl di DILUENTE a ciascun pozzetto. 4. I pozzetti A1 e B1 sono per i BIANCHI NON VERSARE CAMPIONI IN QUESTI POZZETTI. Aggiungere altri 20 Øl di diluente in questi pozzetti. 5. Aggiungere 20 Øl di campione al pozzetto assegnato, partendo da H1. In questo modo si ottiene una diluizione finale del campione pari a 1: 11. NON POSIZIONARE CAMPIONI IN POZZETTI VUOTI. 6. Una volta aggiunto il campione di analisi, aggiungere 20 Øl di CONTROLLO NON REATTIVO per pozzetto nei pozzetti C1, D Øl 20 Øl 20 Øl 20 Øl 7. Aggiungere 20 Øl di CONTROLLO REATTIVO per pozzetto ai pozzetti E1, F1 e G1. Mescolare accuratamente picchiettando delicatamente su tutti i lati della micropiastra, prestando attenzione a tenere la piastra in posizione orizzontale sul banco di lavoro. 8. Coprire attentamente la micropiastra con il coperchio in dotazione per impedire l evaporazione durante l incubazione. 9. Incubare per 60 minuti a 37 C (non utilizzare incubatori ad acqua a 37 C per l incubazione). 10. Preparare LA SOLUZIONE DI LAVORO DEL CONIUGATO secondo quanto illustrato nella PREPARAZIONE DEI REAGENTI prima di lavare la micropiastra. 11. Rimuovere e gettare il coperchio, quindi lavare la micropiastra con il TAMPONE DI LAVAGGIO DILUITO adottando l uno o l altro metodo raccomandato: A. Lavatore automatico o semiautomatico per micropiastre - Lavare per sei (6) volte con almeno 300 Øl per pozzetto ad ogni lavaggio. B. Lavatore manuale per micropiastre - Aspirare completamente il contenuto di tutti i pozzetti abbassando lentamente la punta dell aspiratore fino al fondo di ciascun pozzetto. FARE ATTENZIONE A NON GRAFFIARE LA SUPERFICIE DEI POZZETTI. Riempire l intera piastra con almeno 300 Øl per ciascun pozzetto, quindi aspirare immediatamente nello stesso ordine. Eseguire questo ciclo per sei (6) volte. 12. Asciugare a fondo capovolgendo la micropiastra e picchiettando energicamente sulla carta assorbente. Tutti i residui di tampone di lavaggio della piastra dovranno essere asciugati. La permanenza di residui di tampone di lavaggio delle piastre potrebbe impedire la formazione del colore durante l incubazione del substrato. 13. Riempire una vaschetta con SOLUZIONE DI LAVORO DEL CONIUGATO. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 Øl di SOLUZIONE DI LAVORO DEL CONIUGATO in ciascun pozzetto. Applicare un nuovo coperchio sulla piastra. 14. Incubare la micropiastra per 30 minuti a 37 C (non utilizzare incubatori ad acqua a 37 C per l incubazione). 20 Øl 60 minuti 300 Øl per pozzetto per lavaggio. 100 Øl 30 minuti 5

6 15. Togliere il coperchio dalla piastra e gettarlo via. Ripetere la procedura di lavaggio indicata ai punti 11 e Riempire un serbatoio di reagente con SUBSTRATO. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 Øl di SOLUZIONE DI LAVORO DEL SUBSTRATO in ciascun pozzetto. Applicare un coperchio sulla piastra. 17. Incubare per 15 minuti, al buio, a 37 C (non utilizzare incubatori ad acqua a 37 C per l incubazione). 18. Togliere il coperchio dalla piastra e gettarlo via. 19. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 Øl di SOLUZIONE DI ARRESTO in ciascun pozzetto. Mescolare delicatamente picchiettando sulla piastra. 100 Øl 15 minuti 100 Øl RISULTATI Ai fini del calcolo e dell interpretazione dei risultati, ciascuna micropiastra dovrà essere considerata singolarmente, a prescindere dal numero di piastre analizzate contemporaneamente. PRIMA DELL INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI, DAI VALORI DI ASSORBANZA DEI CONTROLLI E DEI CAMPIONI OCCORRE SOTTRARRE I VALORI DELL ASSORBANZA MEDIA DEL BIANCO. La presenza o l assenza di anticorpi specifici per HTLV I/II viene stabilita mettendo a confronto l assorbanza dei campioni con il VALORE DI CUT-OFF (COV) della piastra. Il valore di CUT-OFF viene calcolato come (0,45 unità di assorbanza + assorbanza media NRC):- VALORE DI CUT-OFF = 0,45 + NRC x CALCOLO DEI RISULTATI 20. Determinare l assorbanza per ciascun pozzetto a 450 nm. Se si utilizza una strumentazione a doppio filtro, la lunghezza d onda di riferimento sarà 620 nm. NOTA: L assorbimento andrebbe letto entro 10 minuti dall aggiunta della SOLUZIONE DI ARRESTO. CONTROLLO QUALITÀ 1. Su ogni piastra, per ciascuna esecuzione del campione, il BIANCO e il CONTROLLO NON REATTIVO devono essere analizzati in duplicato, il CONTROLLO REATTIVO in triplicato. 2. I valori di bianco devono avere un assorbimento 0, I valori del controllo non reattivo devono avere un assorbanza 0,000 e 0,100 dopo la sottrazione del bianco. 4. Almeno 2 dei 3 valori del controllo reattivo devono presentare un assorbimento 0,800 dopo la sottrazione del valore di bianco. Qualsiasi valore esterno a questo range non deve essere utilizzato per il calcolo della media del controllo reattivo (RC x ). 5. Se 2 o più valori del controllo reattivo si discostano dalla MEDIA di oltre il 30%, l analisi non è valida e occorre ripeterla. 6. Perché l analisi sia considerata valida, la differenza tra l assorbanza media del controllo reattivo e del controllo non reattivo (RC x-nrc x) deve essere 0,700. In caso contrario, la tecnica può essere considerata sospetta e l analisi dovrà essere ripetuta. Se la differenza fra le assorbanze medie (RC x - NRC x ) risulta sempre inferiore, è possibile che i reagenti siano deteriorati. 1. Calcolo dell assorbanza media dei controlli non reattivi (NRC x ) Esempio: Pozzetto n. Assorbanza C1 0,020 D1 0,022 Totale 0,042 Media 0,042 / 2 = 0,021 ( NRC x ) I valori individuali del controllo non reattivo dovrebbero essere 0,100 unità. Se uno dei valori del controllo non reattivo non rispetta i criteri precedenti, l analisi non è valida e deve essere ripetuta. 2. Calcolo dell assorbanza media dei controlli reattivi ( RC x ) Esempio: Pozzetto n. Assorbanza E1 1,221 F1 1,144 G1 1,298 Totale 3,663 Media 3,663 / 3 = 1,221 ( RC x ) I valori individuali del controllo reattivo dovrebbero essere 0,800 unità. Se un valore del controllo reattivo non corrisponde a uno del criteri sopra riportati, deve essere escluso in quanto aberrante. Sarà quindi necessario ripetere il calcolo della media dei controlli reattivi (RC x ) utilizzando i singoli valori rimanenti di controllo reattivo. Tali valori devono soddisfare i criteri di cui sopra. Diversamente l analisi è considerata nulla e deve essere ripetuta. 6

7 3. Calcolo della differenza fra RC x e NRCx Esempio: NRC x = 0,021 RC x = 1,221 RC x - NRC x = 1,221-0,021 = 1,200 Perché l analisi sia considerata valida, il valore RC x - NRC x deve essere 0,700. In caso contrario, si può sospettare che sia stata utilizzata una tecnica impropria o che i reagenti si siano deteriorati e l analisi dovrà essere ripetuta. 4. Calcolo del valore di CUT - OFF Valore di CUT - OFF = 0,450 + NRCx Esempio: NRC x = 0,021 Valore di CUT - OFF = 0, ,021 = 0,471 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI 1. I campioni con valori di assorbanza < al valore di CUT - OFF vengono considerati Non-Reattivi da HTLV I/II ELISA 3.0 di MPD. 2. I campioni con valori di assorbimento superiori o pari al valore di CUT - OFF vengono inizialmente considerati reattivi in base ai criteri HTLV I/II ELISA 3.0 di MPD e dovrebbero venire sottoposti a un secondo test prima dell interpretazione. 3. I campioni risultati reattivi con il nuovo test dovranno essere interpretati come ripetutamente reattivi per gli anticorpi anti HTLV-I/II in base ai criteri di HTLV I/II ELISA 3.0 di MPD. 4. I campioni inizialmente reattivi che risultano Non-Reattivi al nuovo test vengono considerati negativi in base ai criteri di HTLV I/II ELISA 3.0 di MPD. 5. I campioni ripetutamente reattivi al test HTLV I/II ELISA 3.0 di MPD devono essere sottoposti ad analisi più specifiche, come HTLV BLOT 2.4 di MPD. CARATTERISTICHE ANALITICHE SPECIFICHE Il test HTLV I/II ELISA 3.0 di MPD, versione TMB, di MPD (MP Diagnostics) è equivalente al test HTLV I/II ELISA 3.0 di MPD, versione OPD. Da un punto di vista tecnico e biologico, sono simili per quanto riguarda: condizioni d uso; specifiche / proprietà; finalità; metodi di applicazione; principi di funzionamento; uso degli stessi materiali a contatto con gli stessi liquidi corporei. I test presentano alcune differenze riguardo a: substrato utilizzato (OPD invece di TMB); tipo e volume della soluzione di arresto necessaria (acido solforico invece di acido cloridrico); lunghezza d onda alla quale viene letto il test (492 invece di 450 nm). Di conseguenza, la prestazione del test HTLV I/II ELISA 3.0 di MPD per la rilevazione di anticorpi anti-htlv-i e anti-htlv-ii è stata valutata utilizzando la versione OPD. Le caratteristiche di prestazione, ottenute come di seguito indicato, sono state estrapolate nella versione TMB. NOTA: Lo studio condotto in Australia è stato realizzato con i sistemi di substrato OPD e TMB ed è risultato conforme [155/155] ad entrambi i tipi di substrato ( 99,9%). Sensibilità Sono stati studiati 420 campioni reattivi (ELISA e/o Western Blot positivi) nel corso di tre valutazioni separate condotte in tre località: in azienda, in Svezia e in Australia. Lo studio condotto in Svezia (n=163) evidenzia una sensibilità paragonabile a quella espressa dai più moderni sistemi di test di confronto. Invece, la valutazione condotta in Australia (n=155) mostra una sensibilità del 100% e la valutazione intra-aziendale del 99% (105/106) sulla base di campioni commerciali e del Mixed Titre Performance Panel PRP206. Il campione risultato negativo con HTLV I/II ELISA 3.0 di MPD nella valutazione intra-aziendale è risultato negativo anche con un concorrente ELISA, rimanendo invece indeterminato per il Western Blot, con una presenza di GD21 debole e una banda p19. Tutte e tre le valutazioni indicano una sensibilità complessiva superiore al 99,7%. Specificità In totale, sono stati testati campioni comprendenti campioni provenienti da donatori di sangue scelti a caso (5.000), campioni clinici (200) e campioni potenzialmente interferenti (100). La specificità diagnostica riscontrata nei gruppi di campioni provenienti da donatori di sangue scelti a caso, campioni clinici e campioni potenzialmente interferenti è stata, rispettivamente, del 99,8%, del 98% e del 97%. HTLV I/II ELISA 3.0 di MPD ha evidenziato una specificità superiore al 99% per tutti e tre i set di campioni testati. Riproducibilità La riproducibilità interlotto e intralotto di HTLV I/II ELISA 3.0 di MPD all interno dell azienda è stata valutata in base ai controlli del kit, a un campione HTLV-I positivo, a un campione HTLV I/II negativo e ad ACCURUN 24, un controllo di conferma multimarker di BBI. Interlotto : due lotti di micropiastre sono stati analizzati in quattro diverse occasioni con 3 repliche di ciascun controllo del kit e 8 repliche dei campioni rimanenti in ciascuna occasione. Intralotto : un lotto di micropiastre è stato analizzato due volte in un solo giorno con 8 repliche di ciascun campione compresi i controlli del kit per ciascun dosaggio eseguiti in un intervallo di tempo di quattro giorni. I risultati indicavano che il coefficiente di variazione (CV) era compreso tra il 3 e l 8% per i campioni testati. LIMITI DELLA METODICA I risultati ripetutamente reattivi ottenuti con il test HTLV I/II ELISA 3.0 di MPD costituiscono la prova presuntiva della presenza di anticorpi anti HTLV-I/II nel campione. Un risultato NON- REATTIVO del test HTLV I/II ELISA 3.0 di MPD indica la probabile assenza di anticorpi anti HTLV-I/II rilevabili nel campione. Tuttavia non è un dato sufficiente per escludere la trasmissione di HTLV- I/II in campioni di sangue non reattivi al test HTLV I/II ELISA 3.0 di MPD. Un risultato NEGATIVO quindi non esclude la possibilità di esposizione o infezione da HTLV-I/II. Con un kit di analisi di questo genere è possibile sospettare risultati falsamente reattivi. La proporzione di falsi reattivi dipende dalla sensibilità e dalla specificità del kit. Nella maggior parte dei test di screening, maggiore è la prevalenza di anticorpi anti HTLV- I/II in una popolazione, minore è la proporzione di campioni falsamente reattivi. 7

8 ESCLUSIONE DI GARANZIA E GARANZIA LIMITATA ESPRESSA Il produttore non fornisce altra garanzia per il kit, tranne l uso come dosaggio diagnostico in vitro nel quadro delle specifiche e delle limitazioni indicate nel Manuale di istruzioni del prodotto, sempre se viene usato seguendo le istruzioni ivi fornite. Il produttore non fornisce alcuna garanzia, espressa o implicita, compresa qualsiasi garanzia espressa o implicita di commerciabilità, adeguatezza all uso o utilità implicita ad altri scopi. Il produttore riconosce solo la sostituzione del prodotto o il rimborso del prezzo di acquisto del prodotto stesso. Il produttore non potrà essere ritenuto responsabile nei confronti dell acquirente o di terzi per danni, lesioni o danni economici di qualsiasi entità comunque causati dal prodotto nell uso o nell applicazione sopra indicati. PROBLEMI TECNICI/RECLAMI In caso di problemi tecnici o di reclami, attenersi alla seguente procedura: 1. Prendere nota del numero di lotto e della data di scadenza dei kit. 2. Conservare i kit e risultati ottenuti. 3. Contattare il più vicino centro MP Biomedicals o il proprio distributore locale. BIBLIOGRAFIA 1. Poisez B.J. et al., Detection and isolation of type C retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T-cell lymphoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980, 77: Kalyanaraman V.S., et al., A new subtype of human T-cell leukemia virus (HTLV-II) associated with a T-cell variant of hairy cell leukemia. Science 1982; 218: , Sedi regionali: MP Biomedicals Asia Pacific Pte Ltd. 85 Science Park Drive #04-01, The Cavendish Singapore Science Park Singapore N. tel. : N. fax : enquiry_ap@mpbio.com Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St.Ingbert Germania N. tel. : N. fax : info@mt-procons.com MP Biomedicals Suisse S.A. Halle de Fret/Aeroport P.O. Box Ginevra 5 Svizzera N. tel. : (4122) N. fax : (4122) mpbiosuisse@mpbio.com 3. Williams A.E. et al., Seroprevalence and epidemiological correlates of HTLV-I infection in U.S. blood donors. Science 1988; 240: , 4. Lipka J.J., et. al., Enhancing the sensitivity of HTLV- I immunoassays in Human Retrovirology : HTLV, Edt W.A. Blattner, Raven Press (NY). pp , 5. Lee H. et. al., High rate of HTLV-II infection in seropositive IV drug abusers in New Orleans. Science 1989; 244: , 6. Lipka J.J. et. al., Modified Western Blot Assay for confirmation and differentiation of Human T-cell Lymphotropic Virus Type-I and II. J. Infect Dis. 1991; 164: , 7. Lipka J.J. et. al., Segregation of Human T-Cell Lymphotropic Virus Type I and II infections by Antibody Reactivity to Unique Viral Epitopes.J. Infect. Dis. 1992; 165: , * Brevetto australiano , , * Brevetto Stati Uniti 5,066,579, 5,614,366 5,763,572, 5,814,441 5,871,933, 5,643,714 * Brevetto canadese * Brevetto europeo * Brevetto giapponese Hadlock K.G., Goh C.J., Bradshaw P.A.,Perkins S., Lo J., Habbas R.K., Kaplan L., and Foung S.K.H. Delineation of an Immunodominant and highly HTLV specific epitope within the HTLV-I transmembrane glycoprotein. Blood 1995; 68 (4): Varma M., Rudolph D., Knuchel M., Switzer W., Hadlock K.G., Velligan M., Chan L., Foung S.K.H., and Lal R.B., Enhanced specificity of truncated transmembrane protein for serologic confirmation of HTLV-I and HTLV-II infection by Western Blot assay containing recombinant envelope glycoproteins.j.clin.micro,1995; 33(12): * Il nome e il logo Genelabs sono concessi in licenza da Genelabs Technologies, Inc. 8

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