Encefalite spongiforme trasmissibile del bovino. Diagnosi di laboratorio

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Rachele Gagliardi
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1 Encefalite spongiforme trasmissibile del bovino Diagnosi di laboratorio Fernando Palmerini IZSLT Laboratorio TSE animali 20 Corso Nazionale per Tecnici di Laboratorio Biomedico Riccione, maggio 2013

2 La legislazione Regolamento (CE) N. 999/2001 del 22 maggio 2001 recante disposizioni per la prevenzione, il controllo e l eradicazione di alcune encefalopatie spongiformi trasmissibili Modificato con Regolamento (CE) N. 1923/2006 del 18 dicembre 2006 Ogni stato membro attua una programma annuale per la sorveglianza delle TSE basato sulla sorveglianza ATTIVA e PASSIVA ( ) tale programma include una procedura di screening che prevede il ricorso a test diagnostici rapidi (.) inseriti nell elenco di cui all allegato X. SUCCESSIVE MODIFICHE FINO A REGOLAMENTO (CE) N. 956/2010 DELLA COMMISSIONE del 22 ottobre 2010

3 MISURE DI SORVEGLIANZA BSE sorveglianza passiva SISTEMI DI SEGNALAZIONE OBBLIGATORIA CASI DI MALATTIA ANIMALI MORTI IN AZIENDA (Test di laboratorio) >24 mesi sorveglianza attiva MONITORAGGIO AL MACELLO (Test di laboratorio) >24 mesi 2001 >30 mesi 2005 >48 mesi 2008 >72 mesi 2011

4 Ultimi sviluppi Dec. UE del (modifica alla Dec ) Deroga gli Stati Membri a modificare il programma annuale di controllo BSE Gli Stati Membri possono decidere di fare sorveglianza solo su animali morti in allevamento

5 POSSIBILITA DIAGNOSTICHE ANIMALI VIVI ANIMALI MORTI Esame clinico Test in vivo non disponibili Istopatologia Immunoistochimica Western blot Microscopia elettronica Prova biologica Test rapidi: indicati da regolamenti comunitari (REGOLAMENTO (CE) N. 956/2010 DELLA COMMISSIONE del 22 ottobre 2010)

6 Rete dei Laboratori competenti LCR WeybridgeThe Veterinary Laboratories Agency- Surrey UK LNR CEA Torino Laboratori della rete nazionale IZS Umbria e Marche Venezie Abruzzo e Molise Puglia e Basilicata Lazio e Toscana Sardegna Sicilia Mezzogiorno Piemonte, Liguria, Valle d Aosta Lombardia ed Emilia Romagna

7 Laboratori nazionale di Riferimento CEA IZS Torino Competenze - Verifica i metodi diagnostici utilizzati nei laboratori regionali - E responsabile del coordinamento delle norme e dei metodi diagnostici nello Stato membro: - controlla qualità di tutti i reagenti diagnostici utilizzati dallo Stato membro - organizza periodicamente prove comparative - garantisce la conferma dei risultati ottenuti dai laboratori diagnostici designati - Collabora con il laboratorio di riferimento comunitario

8 Laboratori diagnostici regionali Istituto Zooprofilattico Sperimentale Procedure validate Abilitazione tramite Ring Test Nazionali Utilizzo di Kit diagnostici validati

9 Prelievo tessuto nervoso su morti o macellati TEST RAPIDO ITER Adempimento piano di sorveglianza Diagnosi di prima istanza Aziende Sanitarie Sanità Animale - Ispezione Laboratori primo livello IZS Centrali e periferici (generalmente a competenza regionale) TEST di CONFERMA Isto, immuno-isto, immunoblotting, genetica Diagnosi di conferma Centro di Referenza per le EST CEA IZS Torino PLVA Approfondimenti diagnostici vari Istituto Superiore di Sanità

10 Test Rapidi Il campione Verbale di accompagnamento campioni: BSE Informazioni presenti: -Anagrafica azienda -Identificazione animale -Età dell animale -Motivo del prelievo

11 Prelievo SNC

13 Dopo aver disarticolato la testa, l'obex può essere individuato ed estratto correttamente.

14 L obex viene posto in un barattolo con chiusura ermetica. Il campione viene identificato e inviato al laboratorio da analizzare.

15 Il campione Circolare del Ministero della Salute n. 3 dell 8 maggio 2003 Raccomandazioni per la sicurezza del trasporto di materiali infettivi e di campioni diagnostici (materiali biologici deperibili) : Inviato in triplo contenitore, sigillato e accompagnato dal verbale

16 Suddivisione del campione in laboratorio TRONCO ENCEFALICO CONGELARE A - 20 C TEST RAPIDO FISSARE IN FORMALINA CONGELARE A 20 C

17 Modalità di prelievo e suddivisione del campione ENCEFALO FISSARE IN FORMALINA 10% CONGELARE A -20 C

18 TEST DIAGNOSTICI

19 REGOLAMENTO (CE) N. 956/2010 DELLA COMMISSIONE del 22 ottobre 2010 ELISA TEST DIAGNOSTICI RAPIDI PER LA SORVEGLIANZA DELLA BSE NEI BOVINI: 1. test ELISA a chemiluminescenza (test Enfer ed Enfer TSE kit, versione 2.0, preparazione automatizzata dei campioni), 2. immunodosaggio su micropiastra (Enfer TSE, versione 3), 3. immunodosaggio a sandwich mediante il kit di individuazione TeSeE SAP, previa denaturazione e concentrazione mediante il kit di purificazione TeSeE (test rapido Bio- Rad TeSeE), 4. immunodosaggio su micropiastra (ELISA) (test Prionics-Check LIA), 5. immunodosaggio a a sandwich ELISA (kit per il test Roboscreen Beta Prion BSE EIA), 6. ELISA a sandwich (Roche Applied Science PrionScreen). 7. Test ELISA che utilizza un polimero chimico per la cattura selettiva della PrPSc (IDEXX BSE HerdChek Antigen Kit, EIA), WB 1. test di immunocolorazione secondo la metodica Western blotting (test Prionics Check Western) Immunocromatografico 1. immunodosaggio a flusso laterale (Prionics Check PrioSTRIP)

20 Scelta del test diagnostico rapido Valutazione del Cea tra i test proposti dal REGOLAMENTO (CE) N. 956/2010 DELLA COMMISSIONE del 22 ottobre 2010 Attivazione di una gara nazionale da parte del Ministero della Salute La scelta viene fatta in base a criteri di: -Economicità -Prestazioni tecniche

21 I Kit diagnostici, prima di essere utilizzati, devono essere sottoposti a collaudo Collaudo del singolo lotto viene eseguito da: Ditta produttrice Laboratorio Comunitario di Riferimento CEA

22 WESTERN BLOT

23 Prionics Check Western SR Il test Prionics prevede l'esecuzione di un Western blot su omogenati di encefalo digeriti con Proteinasi K. Il campione è sottoposto ad una corsa elettroforetica in un gel, che consente la stratificazione della PrPsc in tre bande caratteristiche. Le bande sono trasferite su speciali membrane su cui sono rivelate con anticorpi anti-prpsc. (chemioluminescenza) Le immagini sono evidenziate su lastra autoradiografica La positività è data dalla comparsa di bande proteiche specifiche. Representative Western blot analyses of protease-resistant prion protein (PrPres) in H-type (lanes 2, 3), L-type (lanes 5, 6), and C-type (lanes 1, 4, 7) cases of bovine spongiform encephalopathy (BSE).. Anne-Gaëlle Biacabe,* Eric Morignat,* Johann Vulin,* Didier Calavas,* and Thierry G.M. Baron* *Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments, Lyon, FranceAtypical Bovine Spongiform Encephalopathies, France,

24 IMMUNOCROMATIGRAFIA a flusso laterale

Prionics -Check PrioSTRIP immunodosaggio a flusso laterale che utilizza due anticorpi monoclonali differenti, per individuare le frazioni della PrP resistenti alla

Gli omogenati digeriti vengono incubati con l Anticorpo Coniugato.

25 Prionics -Check PrioSTRIP immunodosaggio a flusso laterale che utilizza due anticorpi monoclonali differenti, per individuare le frazioni della PrP resistenti alla proteinasi K Il trattamento con proteinasi K degrada completamente la PrPC, mentre la PrPSc viene ridotta nel frammento di kd. Gli omogenati digeriti vengono incubati con l Anticorpo Coniugato. La PrPSc presente negli omogenati si lega al coniugato, che è un anticorpo monoclonale legato a micriosfere di lattex. Immergendo il PrioSTRIP nella miscela campione-coniugato, inizia il flusso laterale attraverso la membrana. Il complesso PrPconiugato viene trattenuto sulla linea di test dal secondo anticorpo (cattura)

26 ELISA

27 Le fasi del test 1. Purificazione I reagenti del Kit di Purificazione TeSeE consentono la purificazione, la concentrazione e la solubilizzazione della PrPres dai campioni di tessuto nervoso prelevati da animali infetti. 2. Rivelazione Tecnica immunoenzimatica (formato sandwich) che impiega 2 anticorpi monoclonali per la rivelazione della PrPsc resistente alla proteinasi K, nei tessuti nervosi degli animali infetti. La fase solida si compone di 12 strisce di pozzetti in polistirene rivestiti del primo anticorpo monoclonale. Il secondo anticorpo monoclonale è legato alla perossidasi (substrato).

28 Test Rapido attualmente in uso: ELISA IDEXX HERDCHECK E un Test Elisa di nuova generazione. La principale differenza è che non viene effettuata una digestione con proteinasi K Sulla superficie di una piastra viene adsorbito un polimero chimico per la cattura selettiva di PrPSc che, se presente, sviluppa con esso un legame ad alta affinità, successivamente rivelato utilizzando un anticorpo specifico per PrP (Elisa metodo sandwich)

29 Iter campioni positivi al Test Rapido Caso INDEX Comunicazione dell esito agli Enti interessati: -ASL competente -CEA -MIN SAL -COVEPI -ISS -Regione competente

30 Iter campioni positivi al Test Rapido Invio campione positivo CEA - esegue una prima conferma Invio campione positivo ISS - conferma definitiva - genotipizzazione - caratterizzazione molecolare del ceppo isolato

31 Iter campioni positivi al Test Rapido Campioni positivi secondari, derivati da allevamenti già identificati come focolaio -comunicazione dell esito solo alla ASL competente Invio campione positivo CEA - esegue una prima conferma Invio campione positivo ISS - conferma definitiva - genotipizzazione - caratterizzazione molecolare del ceppo isolato

32 GRAZIE PER L ATTENZIONE

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27.2.2009 Gazzetta ufficiale dell Unione europea L 55/11 REGOLAMENTO (CE) N. 162/2009 DELLA COMMISSIONE del 26 febbraio 2009 che modifica gli allegati III e X del regolamento (CE) n. 999/2001 del Parlamento