EBV VCA-IgG-ELISA PKS medac. Italiano 128-PKS-VPI/010512

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1 EBV VCAIgGELISA PKS medac Italiano 128PKSVPI/010512

2 FABBRICANTE medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg DISTRIBUZIONE medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Telefono: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/ CONTATTI PER LE ORDINAZIONI Telefono: ++49/ 4103/ Fax: ++49/ 4103/ PKSVPI/010512

3 EBV VCAIgGELISA PKS medac Test immunoenzimatico con Sistema di Controllo della Dispensazione per la rilevazione quantitativa di anticorpi di classe IgG diretti verso l antigene capsidico (VCA) specifico del virus EpsteinBarr nel siero Cat. no.: 128PKS PER SOLO USO DIAGNOSTICO IN VITRO INTRODUZIONE Il virus EpsteinBarr (EBV) appartiene alla famiglia degli Herpesviridae. E costituito da DNA a doppia elica, dal capside, dal tegumento e dall involucro. E caratteristico per l EBV persistere in modo latente e per tutta la durata della vita nell organismo dopo l infezione primaria. A livello mondiale il % di tutti gli adulti risultano infettati da EBV. L evoluzione dell infezione primaria da EBV negli individui immunodepressi durante la prima infanzia avviene normalmente senza nessun sintomo. Nei giovani un infezione da EBV si manifesta clinicamente come mononucleosi infettiva (malattia di Pfeiffer). Negli individui con un sistema immunitario lievemente compromesso si può verificare una riattivazione del virus in modo silente. Negli individui con un sistema immunitario gravemente compromesso si possono osservare linfomi delle cellule B policlonali associati all EBV. Nel 60 % di tutti i linfomi di Hodgkin il DNA di EBV è presente. Tumori endemici rilevanti associati all EBV sono il linfoma di Burkitt e il carcinoma nasofaringeo. I complessi antigenici significanti per la rilevazione degli anticorpi sono l antigene nucleare specifico dell EBV (EBNA), l antigene virale capsidico (VCA) e l antigene precoce (EA). Negli individui immunocompromessi la determinazione anticorpale è fondamentale per la diagnosi dell infezione da EBV per distinguere l infezione primaria da un infezione precedente o la sieronegatività. La diagnosi sierologia per l EBV può essere un importante informazione diagnostica addizionale per le linfoadenopatie e per le malattie neurologiche indeterminate. La determinazione degli anticorpi IgG diretti verso EBNA1 è il primo test da seguire nel caso di infezione da EBV siero logicamente rilevante. Un risultato positivo conferma un infezione precedente. In caso di negatività verso EBNA1 IgG, la determinazione degli anticorpi IgG e IgM diretti verso l antigene VCA è essenziale per differenziare lo stato dell infezione. 128PKSVPI/

4 L EBV VCAIgGELISA PKS medac determina gli anticorpi IgG diretti in modo specifico verso la proteina gp125 dell antigene capsidico virale. Il test può essere eseguito velocemente e facilmente. Utilizzando una curva di calibrazione è possibile quantificare la concentrazione degli anticorpi consentendo un affidale follow up. 128PKSVPI/

5 PRINCIPIO DEL TEST La micropiastra è rivestita con l antigene EBV VCA gp 125. Gli anticorpi specifici anti VCA gp 125 del campione sono selettivamente legati all antigene. Perossidasiconiugato anticorpi anti IgG umane lega gli anticorpi IgG specifici antivca gp 125 (P = perossidasi). Incubazione con substrato TMB (*).La reazione è bloccata con l aggiunta dei acido solforico. L assorbanza è letta mediante spettrofotometro. Vantaggi del test Il sistema di controllo di dispensazione permette di monitorare visivamente ciascuna fase di dispensazione attraverso i cambiamenti di colore. Le strisce con micropozzetti separabili consentono un uso efficiente del test. Adatto per l automazione su sistemi ELISA aperti. Singolo punto per la quantificazione, non necessita di una curva standard. 128PKSVPI/

6 CONTENUTO DEL KIT Cat. no.: 128PKS 1. MTP Micropiastra: 12 x 8 pozzetti (contrassegnati con VCG, con supporto ed essicante sigillati in una busta di alluminio), separabili, con profilo a U, rivestiti con antigene EBV VCA gp 125 purificato, BSA e ph indicatore, pronta all uso. 2. CONTROL Controllo negativo: 1 fiala da 1,5 ml, siero umano, pronto all uso, contiene BSA, fenolo, ProClin TM 300 e gentamicina solfato. 3. CONTROL + Controllo positivo: 1 fiala da 1,5 ml, siero umano, pronto all uso, contiene FCS, BSA, fenolo, ProClin TM 300 e gentamicina solfato. 4. CAL Calibratore: 1 fiala da 1,5 ml, siero umano, pronto all uso, contiene FCS, BSA, fenolo, ProClin TM 300 e gentamicina solfato. 5. WB Tampone di lavaggio: 1 flacone da 100 ml, PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, contiene ProClin TM VIRDIL Diluente campioni: 1 flacone da 110 ml, PBS/Tween/BSA, ph 7,2 7,4, pronto all uso, contiene ProClin TM CON Coniugato: 3 fiale da 4,5 ml ciascuna, antiigg umane di capra, coniugati HRP, pronto all uso, di colore verde, contiene BSA, fenolo, ProClin TM 300 e gentamicina solfato. 8. TMB TMBsubstrato: 1 fiala da 10 ml, pronto all uso. 9. STOP Soluzione di stop: 2 fiale da 11 ml ciascuna, acido solforico(h 2 SO 4 ) 0,5 M, pronta all uso. 128PKSVPI/

7 1. CONSERVAZIONE E STABILITÀ Materiale/Reagente Stato Conservazione Stabilità Kit integro C fino alla data di scadenza Micropiastra aperta C nella 6 settimane busta con essiccante Controlli/ aperti C 6 settimane Calibratore Tampone di diluito C 6 settimane lavaggio Diluente campioni aperto C 6 settimane Coniugato aperto C 6 settimane TMBsubstrato aperto C 6 settimane Soluzione di stop aperta C fino alla data di scadenza Non utilizzare i reattivi dopo la data di scadenza. 2. REAGENTI E MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI 2.1. Acqua per iniezione (H 2 O bidistillata). L utilizzo di acqua deionizzata può disturbare la procedura del test Micropipette regolabili 2.3. Contenitori puliti in vetro o in plastica per la diluizione del tampone di lavaggio e dei campioni 2.4. Un apparecchio adeguato per il lavaggio di micropiastre (p.es. multistepper o lavatore per micropiastre ELISA) 2.5. Incubatore a 37 C 2.6. Lettore per micropiastre con filtri a 450 nm e nm 3. PREPARAZIONE DEI REAGENTI Prima di iniziare la procedura di test, tutti i componenti del kit devono essere portati a temperatura ambiente. Calcolare il numero di pozzetti richiesti Micropiastra La busta in alluminio deve essere accuratamente risigillata insieme con l essiccante dopo ogni prelievo dei pozzetti. La conservazione e la stabilità dei pozzetti sono indicate al punto PKSVPI/

8 Nota: I pozzetti della micropiastra hanno una leggera colorazione verde. Una possibile colorazione marrone/verde può apparire all interno dei pozzetti, ciò è dovuto al processo di produzione e non influenza le performance del test Tampone di lavaggio Mescolare un volume di tampone di lavaggio (10x) con nove volumi di acqua per iniezione (p.es. 50 ml di tampone di lavaggio (10x) con 450 ml di acqua). Per otto pozzetti sono necessari 10 ml di tampone di lavaggio diluito. I cristalli nel tampone di lavaggio (10x) devono essere disciolti mediante riscaldamento (max. 37 C) e/o agitazione a temperatura ambiente. Non mescolare i reattivi specifici del kit (micropiastra, controlli, coniugati, calibratore) di lotti diversi. Per contro il diluente campioni, il tampone di lavaggio, il TMBsubstrato e la soluzione di stop sono generalmente intercambiabili per tutti i kit ELISA medac della linea virologia. I reagenti di altri produttori non possono essere utilizzati. Risultati validi e riproducibili si ottengono soltanto se viene seguita attentamente la procedura del test. 4. CAMPIONI 4.1. Il test è adatto per campioni di siero. Il campioni dei pazienti possono essere conservati per 7 giorni a 28 C. Per una durata più lunga i campioni possono essere conservati a 20 C. Si consiglia di evitare ripetuti cicli di scongelamento e congelamento dei campioni Il pretrattamento dei sieri, p. es. inattivazione, non è necessario. Comunque non devono essere contaminati con microrganismi né contenere globuli rossi I sieri devono essere diluiti 1:200 con il diluente campioni. Si raccomanda di preparare una diluizione iniziale 1:50 (es. 10 µl di siero µl diluente campioni). Per ulteriori diluzioni 1:4 preparare solamente il volume necessario per l analisi. Campioni con concentrazioni di anticorpi fuori dal range di misura possono essere ulteriormente diluiti. 128PKSVPI/

9 5.A. PROCEDURA DEL TEST 5.1 Tagliare la busta di alluminio al di sopra della chiusura e prelevare il numero richiesto di pozzetti (vedi 3.1.). I pozzetti sono pronti per l uso e non devono essere sottoposti ad un prelavaggio. 5.2 Lasciare il pozzetto A1 vuoto per il bianco (vedi 6.A.). Aggiungere nei pozzetti 50 µl di controllo negativo, di controllo positivo e di campioni diluiti singolarmente, e 50 µl del calibratore in duplicato. Dopo la dispensazione dei campioni (liquidi a ph neutro o basico) il colore dei pozzetti vira al blu/verde. Una mancanza di cambiamento di colore in un pozzetto indica che il campione o il controllo non è stato aggiunto. Se necessario, i pozzetti della micropiastra possono essere tenuti in una camera umida per al massimo 30 minuti a temperatura ambiente prima di procedere con il test. 5.3 Incubare i pozzetti per 60 min (± 5 min) a 37 C (± 1 C) in una camera umida o sigillati con un foglio da incubazione. 5.4 Al termine dell incubazione lavare i pozzetti tre volte con 200 µl di tampone di lavaggio per pozzetto. Porre attenzione affinché tutti i pozzetti siano pieni. Dopo il lavaggio scuotere i pozzetti su carta da filtro. Non lasciare asciugare i pozzetti! Procedere immediatamente! 5.5 Aggiungere il coniugato (di colore verde) a ogni pozzetto (eccetto A1). Se il test viene eseguito manualmente devono essere pipettati 50 µl di coniugato in ogni pozzetto. Attenzione: Se il test viene eseguito con apparecchi automatici devono essere pipettati in ogni pozzetto 60 µl di coniugato, a causa di una maggiore evaporazione nella camera di incubazione degli apparecchi. La convalida del test ha confermato che il kit può essere automatizzato. Si raccomanda tuttavia di verificarne la compatibilità con la strumentazione disponibile in laboratorio. 5.6 Incubare ancora per 60 minuti(± 5 min) a 37 o C (± 1 o C) in una camera umida o coprire con un foglio per l incubazione. 5.7 Dopo l incubazione lavare nuovamente i pozzetti (vedi 5.4.). 128PKSVPI/

10 5.8 Aggiungere 50 µl di TMBsubstrato a ogni pozzetto e incubare al buio per 30 min (± 2 min) a 37 C (± 1 C) in una camera umida o sigillati con un foglio da incubazione. I campioni positivi virano al blu. 5.9 Arrestare la reazione mediante l aggiunta di 100 µl di soluzione di stop a ogni pozzetto (incluso A1). I campioni positivi virano al giallo. Pulire la superficie inferiore dei pozzetti prima della lettura e verificare l assenza di bolle d aria nei pozzetti. La lettura deve essere effettuata entro 15 min dall aggiunta della soluzione di stop. 5. B. TABELLA PER LA PROCEDURA DEL TEST Controllo neg. Controllo pos. Calibratore Campione Bianco (A1) Controllo Negativo 50 µl Controllo Positivo 50 µl Calibratore Campione 50 µl 50 µl Incubare per 60 min a 37 C, lavare 3 volte con 200 µl di tampone di lavaggio Coniugato 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) Incubare per 60 min a 37 C, lavare 3 volte con 200 µl di tampone di lavaggio TMBsubstrato 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Soluzione di stopp Incubare per 30 min a 37 C al buio 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Lettura fotometrica a 450 nm (ref nm) *)procedura manuale/automatica (vedi 5.5.) 6.A. CALCOLO DEI RISULTATI (VALIDITÀ) Leggere i valori di assorbanza a 450 nm (lunghezza d onda di riferimento nm). Sottrarre il valore di assorbanza del bianco (pozzetto A1) da tutti gli altri valori di assorbanza. 128PKSVPI/

11 Valori lotto specifici Il foglio con i dati lottospecifici forniti con il kit contiene le seguenti informazioni: Curva di calibrazione lotto specifica Parametri a e b della curva Valore nominale dell OD del calibratore OD del limite inferiore del calibratore Range nominale della concentrazione (AU/ml) del controllo positivo Criteri di validità del test Il valore OD del controllo negativo deve essere < 0,150. Il valore unitario del controllo positivo deve essere entro il range nominale indicato nel foglio con i dati lottospecifici. Il valore medio dell OD del calibratore deve essere superiore al valore OD del limite inferiore del range indicato nel foglio con i dati lottospecifici. Ripetere la seduta se i risultati non concordano con le specifiche sopra riportate. Correzione dei risultati I valori di OD misurati per il controllo positivo e per i campioni devono essere corretti con la formula riportata di seguito: Valore nominale OD del calibratore OD corretta = x OD misurata Valore OD misurato del calibratore Quantificazione dei risultati La concentrazione in AU/ml corrispondente ai valori OD possono essere letti con l ausilio della curva di calibrazione lottospecifica (vedere i dati riportati nel foglio lottospecifico) In alternativa, le concentrazioni possono essere calcolate utilizzando la seguente formula: a Concentrazione[AU/ml] = b/ 1 OD corretta La maggior parte dei lettori ELISA permette di programmare la formula, quindi capace di processare in modo automatico i dati. L intervallo di misurazione è compreso tra 9 e 200 AU/ml. Campioni sotto a questo range devono essere interpretati come < 9 AU/ml, quelli sopra come > 200 AU/ml. Questi valori non devono essere estrapolati. Il cutoff è 10 AU/ml. 128PKSVPI/

12 Zona grigia = cutoff ± 10 % (= da 9 a 11 AU/ml) Attenzione! Nota importante! La quantificazione di valori negativi o non definiti attraverso l algoritmo matematico possono verificarsi nei seguenti casi: Campioni altamente positivi con valori di OD corretti a sono calcolati come valori negativi o AU non definiti (non permettendo la divisione con 0). Questi campioni devono essere ritestati a elevate diluzioni o devono essere interpretati come > 200 AU/ml. 6.B. INTERPRETATIONE DEI RISULTATI/LIMITI DEL METODO Campioni con valori in Unità inferiori al limite inferiore della zona grigia sono riportati come NEGATIVI. Campioni con valori in Unità entro la zona grigia sono riportati come EQUIVOCI. Questi campioni dovrebbero essere ritestati assieme ad un campione fresco raccolto dopo 14 giorni dal primo prelievo per verificare un cambio del titolo anticorpale. Campioni con valori in Unità eccedenti il limite superiore della zona grigia sono riportati come POSITIVI. I risultati dovrebbero essere sempre interpretati assieme ai dati clinici del paziente come anche i risultati ottenuti per EBNA1 IgG, VCA IGM e per addizionali parametri diagnostici. Singoli casi di crossreazioni, causati da anticorpi diretti verso gli Herpes Virus, non possono essere esclusi. Un aumento delle concentrazioni di lipidi e di emoglobina nei non influenza i risultati del test. 6.C. INTERPRETATIONE DIAGNOSTICA DELLA SIEROLOGIA EBV CON IL DOSAGGIO MEDAC La seguente interpretazione dei risultati sullo stato dell infezione deve essere solamente considerata per valutare individui immunocompromessi. EBNA1 IgG VCA IgG VCA IgM Interpretazione sieronegativo + +/±/ Infezione passata +/±/ + Infezione primaria 128PKSVPI/

13 Tutte le altre combinazioni di risultati devono essere interpretate come incerte. Per l interpretazione di un risultato incerto potrebbe essere necessario eseguire un ulteriore test con un metodo diagnostico diverso. Per ridurre il numero di combinazioni di risultati ambigui si raccomanda l utilizzo dell intero panello EBV ELISA medac. 7. CARATTERISTICHE PERFORMANCE Le performance caratteristiche del kit sono state valutate nel corso della valutazione diagnostica 7.A. SENSIBILITÀ E SPECIFICITÀ 352 sieri sono stati misurati durante una valutazione diagnostica. I risultati sono stati correlati con i valori diagnostici del laboratorio del Prof. Dr. Enders e colleghi, Stuttgart e dell istituto di virologia dell Università Homburg/Saar. I risultati sono descritti nella tabella sottostante: Predefinizione (IFA) negativo cutoff positivo EBV VCAIgGELISA negativo PKS medac cutoff positivo Sensibilità = 96,3 % Specificità = 97,9 % Concordanza: 97,2 % 7.B. PRECISIONE Campione Variazione Intradosaggio Campione Variazione interdosaggio media AU SD CV (%) n media AU SD CV (%) n PC 36,1 1, PC 36,0 1, N 1 8,0 0, N 6 7,9 0, N 2 28,1 1, N 7 16,5 0, N 3 28,9 2, N 8 25,4 4,72 19*) 13 N 4 69,1 3, N 9 26,7 1, N 5 112,1 8, N ,1 5, N ,8 9, PC = controllo positivo; *)siero di paziente in fase acuta(vca IgM positivo) 128PKSVPI/

14 AVVERTENZE E PRECAUZIONI GENERALI Al fine di evitare la contaminazione crociata non scambiare i flaconi e i loro tappi. I reattivi devono essere richiusi immediatamente dopo l uso al fine di evitare l evaporazione e la contaminazione microbica. Dopo l uso i reattivi devono essere conservati come indicato, al fine di garantire la loro durata. Dopo l uso, riporre tutti i componenti del kit nell imballo originale per evitare che vengano confusi con componenti di altri kit o appartenenti ad altri lotti (vedi anche 3.). REGOLE DI SICUREZZA Devono essere rispettate le norme locali di sicurezza. I reattivi di origine umana sono stati analizzati e sono risultati negativi per HBsAg, per anticorpi antihiv1/2 e antihcv. Comunque, si raccomanda vivamente che tali materiali, così come quelli di origine animale (vedi contenuto del kit), vengano considerati come potenzialmente infettivi e pertanto manipolati con tutte le necessarie precauzioni. CONSIDERAZIONI SULLO SMALTIMENTO I rifiuti di sostanze chimiche e di preparati devono essere generalmente considerati come rifiuti pericolosi. L eliminazione di questo tipo di rifiuti è regolata dalle leggi e dalle norme nazionali e regionali. Contattare le proprie autorità locali o le ditte di smaltimento rifiuti al fine di ottenere informazioni relative al loro smaltimento. Data di revisione: PKSVPI/

15 REFERENZE Bauer, G.: EpsteinBarrVirus Bedeutung und Möglichkeiten der Labordiagnostik. Therapeutische Umschau 51(8), (1994). Bauer, G.: The rational basis for efficient EpsteinBarr Virus (EBV) serology. Clin. Lab. 41(9), (1995). Hille, A., Klein, K., Baumler, S., Grasser, F.A., MuellerLantzsch, N.: Expression of EpsteinBarr virus nuclear antigen 1, 2A and 2B in the baculovirus expression system: serogical evaluation of human antibodies to these proteins. J. Med. Virol. 39 (3), (1993). Linde, A.: Diagnosis of EpsteinBarr Virus related diseases. Scand. J. Infect. Dis. Suppl. 100, 8388 (1996). Mertens, T., Haller, O., Klenk, H.D. (Hrsg.): Diagnostik und Therapie von Viruskrankheiten. 6570, Urban & Fischer Verlag (2004). Modrow, S., Falke, D. (Hrsg.): Molekulare Virologie , Spektrum Akademischer Verlag (1997). Prang, N.S., Schwarzmann, F.: Aktuelle Perspektiven in der Diagnostik EpsteinBarrVirus assoziierter Erkrankungen. Immun. Infekt. 4, (1997). 128PKSVPI/