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1 Esperto in processi innovativi di sintesi biomolecolare applicata a tecniche di epigenetica Materiale Didattico Metodologie e applicazioni della biologia molecolare e cellulare Dott.ssa Giorgia Borriello immagine

2 METODOLOGIE E APPLICAZIONI DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE E CELLULARE Dr.ssa Giorgia Borriello Napoli, novembre 2012

3 Agenda SCOPO DEL CORSO Principali tecniche di biologia molecolare e cellulare per la diagnosi e la caratterizzazione di agenti responsabili di malattie infettive Visione critica di un progetto sperimentale

4 Agenda 1. DETECTION DI ACIDI NUCLEICI PCR; Real-Time PCR; HRM-PCR DGGE; RFLP; RAPD; SCAR; PFGE Sequenziamento; analisi di frammenti; MLVA Microarray NGS

5 Agenda 2. DETECTION DI PROTEINE ELISA Citometria a flusso Ricerca di anticorpi Proteomica 3. VALIDAZIONE DI UN METODO ANALITICO 4. VALUTAZIONE DI LAVORI SCIENTIFICI PUBBLICATI SU RIVISTE IMPATTATE

6 Applicabilità dei metodi diagnostici Sensibili Specifici Facili Veloci Economici Comunemente accettati Automatizzabili

7 Detection di acidi nucleici TECNICHE DI ESTRAZIONE DNA/RNA 1. Tipo di substrato 2. Metodica utilizzata 3. Downstream application DNA pulito e adatto Feci organi matrici alimentari

8 Detection di acidi nucleici TECNICHE DI ESTRAZIONE DNA/RNA 1. Protocollo classico 2. Kit estrazione 3. Boiling 4. Specifici metodi (PFGE) Contaminazione Inibenti Falsi positivi Falsi negativi

9 Detection di acidi nucleici PROTOCOLLO CLASSICO 1. Lisi cellulare (detergenti, EDTA) 2. Separazione fase organica / fase acquosa (cloroformio:a. isoamilico 24:1) 3. Precipitazione in alcol (etanolo; isopropanolo) 4. II precipitazione in alcol e risolubilizzazione Vantaggi Svantaggi Grandi quantità; applibabile quasi a tutto Rischio contaminanti; lungo e laborioso; influenza operatore

10 Detection di acidi nucleici KIT ESTRAZIONE I 1. Lisi cellulare (detergenti, proteinasi K, omogeneizzazione) 2. Cattura DNA/RNA (colonnine) 3. Lavaggi (washing buffer) 4. Eluizione Vantaggi Svantaggi Discrete quantità; grande pulizia; velocità Costo

11 Detection di acidi nucleici KIT ESTRAZIONE II 1. Lisi cellulare (calore) 2. Cattura inibenti (resina adsorbente) 3. DNA in soluzione Vantaggi Svantaggi Estrema velocità Minore qualità; scarsa conservabilità

12 Detection di acidi nucleici BOILING 1. Lisi cellulare (calore) 2. Precipitazione per centrifugazione 3. Recupero surnatante Vantaggi Svantaggi Estrema velocità Minore qualità; scarsa conservabilità; minore applicabilità (frammentazione)

13 Detection di acidi nucleici ESTRAZIONE PER PFGE 1. Immobilizzazione cellule in blocchetti di agarosio 2. Estrazione di DNA intero Vantaggi Svantaggi DNA integro (frammenti > 30kb) laborioso

14 Detection di acidi nucleici ROBOTIC EXTRACTION Vantaggi Svantaggi Qualità; tempo Costo

15 Produzione in vitro di grandi quantità di un determinato frammento di DNA

16 1955: scoperta della DNA polimerasi

17 Nel 1983 K.B. Mullis utilizzò la DNA polimerasi in una reazione di polimerizzazione ciclica: la PCR

18 Elementi necessari per la reazione di amplificazione

19

20 Il processo si ripete

21 Resa teorica di una reazione PCR a partire da una singola copia di DNA

22 La formula della PCR

23 La reazione di PCR

24 Cause dell effetto plateau: Competizione tra il prodotto dei cicli precedenti e i primers per l ibridazione Inattivazione termica dell enzima Riduzione del rapporto molare tra le concentrazioni DNA-polimerasi/DNA Riduzione progressiva dell efficienza di denaturazione e/o di ibridazione Distruzione degli amplificati per l attività esonucleasica 5 >3 della Taq Accumulo di pirofosfati (inibitori polimerasi) Progressiva diminuzione della concentrazione di 1 o più componenti di reazione

25 Principali fattori che influenzano la resa della PCR

26 MIX DI REAZIONE: DNA TARGET Quantità ottimale: 0.1 a 1-2 mg DNA genomico/reazione INIBITORI: troppo DNA/RNA; emoglobina; eparina; ioni metallici; SDS; composti aromatici; etanolo; urea; detergenti

27 MIX DI REAZIONE: PRIMERS SPECIFICI UNIVERSALI DEGENERATI FATTORI CRITICI: Scelta regione da amplificare Purezza Lunghezza (>16 bp: 20-30) Equilibrato rapporto AT/GC 45<Tm<68 C Tm simili (± 2 C)

28 DISEGNO DEI PRIMERS Evitare sequenze inusuali Evitare sequenze palindromiche (loop) Evitare estremità 3 tra loro complementari (primer dimeri)

29 Primers-dimeri Inibizione della reazione di PCR

30 MIX DI REAZIONE: TAMPONE DI REAZIONE

31 Concentrazione di MgCl 2 Mg ++ [mm] La concentrazione utilizzata è: mm (generalmente 1.5 mm)

32 MIX DI REAZIONE: deossinucleotidi TRIFOSFATI dntps

33 MIX DI REAZIONE: DNA polimerasi Gold Platinum Long range Resistenti agli inibenti

34 CONDIZIONI DI REAZIONE ANNEALING Fase più delicata t-t dipendente da: DENATURAZIONE C x Attivazione Taq Hot-start Amplicone; Tm primer Specificità Touch-down ARMS PCR EXTENSION T ottimale Taq extension finale PCR allele-specifica N.B. Oltre un certo numero di cicli non si ottiene più un aumento del numero di amplificati, per ottenere una sensibilità maggiore ricorrere ad altri sistemi (nested-pcr)

35 ARMS PCR (Amplification Refractory Mutation System)

36 TIPI DI PCR: Nested PCR Multiplex PCR In situ PCR Ligase Chain Reaction (LCR) Transcription Mediated Amplification (TMA)

37 NESTED PCR and SEMI-NESTED PCR

38 PCR detection of Neospora caninum in water buffalo fetuses The seroprevalence of Neospora caninum was surveyed by an ELISA kit on two water buffaloes herds of Southern Italy. Positive samples were detected in 47% and 59% of cases, respectively, thus indicating high level of exposure to the parasite. Tissue samples collected from three aborted fetuses from the same herds were investigated for N. caninum presence by PCR assays targeting the 18S and the Nc5 genes, respectively. Both methods displayed the presence of N. caninum DNA in both heart and brain tissue samples. Sequencing of the Nc5 gene PCR products confirmed the presence of N. caninum in the samples; phylogenetic analysis on the obtained sequences showed high homology among the Neospora recovered from different samples. The present study suggests an important role of N. caninum as a possible abortive agent for water buffalo species.

39 NESTED PCR

40 ANALISI FILOGENETICA

41 MULTIPLEX PCR eae VT2 VT1

42 In situ PCR

43 In situ PCR protocollo 1. Fissare il tessuto, sezionarlo e fissare su vetrino; 2. Digestione enzimatica con pepsina/tripsina; 3. (Digestione enzimatica con Dnase) per RT-PCR; 4. Mix di reazione per PCR (o RT-PCR); 5. Amplificazione; 6. Detection (colorimetrica mediante ibridizzazione con sonde)

44 In situ PCR protocollo

45 LIGASE CHAIN REACTION (LCR) > Specificità in caso di mutazioni puntiformi

46 LIGASE DETECTION REACTION (LDR) > Specificità in caso di mutazioni multiple

47 p-ligase CHAIN REACTION (p-lcr)

48 TRANSCRIPTION MEDIATED AMPLIFICATION (TMA)

49 CONFERMA DELLA SPECIFICITÀ DI REAZIONE: Amplicone (bp) Digestione con enzimi di restrizione Sequenziamento CONTROLLO INTERNO SPECIFICITÀ: o Controlli positivi o Controlli negativi

50 VANTAGGI: Specifica e sensibile; Rapida; Target integrato o no nel genoma Utile in infezioni croniche e persistenti

51 APPLICAZIONI I: Primer in regioni altamente conservate Identificazione di classi di patogeni Primer per regioni ipervariabili Identificazione di biotipi Primer degenerati Identificazione di nuove specie

52 APPLICAZIONI II: Primer per geni specifici Caratterizzazione di ceppi e applicazioni per studi epidemiologici (epidemiologia e diffusione di ceppi; identificazione fonti di contaminazione)

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