Vaccini Herpesvirus. Profilassi delle infezioni da herpesvirus nei grossi ruminanti
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1 Vaccini Herpesvirus Profilassi delle infezioni da herpesvirus nei grossi ruminanti Dip.. Patologia e Sanità animale Facoltà di Medicina Veterinaria Università di Napoli Federico II
2 Profilassi IBR/IPV (BoHV-1) Impatto negativo dell infezione (Bovino /Bufalo?) Economico Sanitario tre scelte 1. Non intervenire 2. Vaccinare 3. Controllare ed eradicare Vaccinando Non vaccinando
3 Profilassi (RPV) centri fecondazione allevamenti riproduttori allevamenti fornitori embrioni DM 28/6/91 n. 323 Dir 88/407/CEE Dir 97/12/CE INDENNI DA IBR
4 Situazione in Europa = BoHV1-free non-eu = BoHV1-free membro-eu = parzialmente free (Bolzano) = eradicazione obbligatoria = eradicazione regionale volontaria o legislazione BHV1 = né piani ufficiali di eradiazione nazionale né regionali
5 Qualifica di indenne OIE Paese o zona indenne da IBR Malattia o sospetto di malattia è denunciabile Nessun animale è stato vaccinato per IBR/IPV negli ultimi 3 anni Almeno il 99.8% degli allevamenti è indenne da IBR Allevamento indenne da IBR (2004/558/EC) animali introdotti in allevamento scortati da certificati seme od embrioni introdotti scortati da certificazioni tutti gli animali sottoposti a indagini diagnostiche per due volte con risultato negativo ad intervalli di mesi negli allevamenti da latte controllo del latte su almeno 5 animali per due volte ad intervalli di mesi e su sangue per quelli non in allattamento e maschi con risultato negativo
6 Qualifica di indenne OIE Mantenimento della qualifica (2004/558/EC) indagini sierologiche (latte/sangue) a cadenza annuale su un campione a random sulla popolazione bovina Controllo drastico dei bovini importati (provenienza, sierologia)
7 Piani di controllo con finalità eradicativa. Il successo di detti piani sia strettamente legato all'adozione di un corretto approccio strategico. imprescindibile l'individuazione degli animali infetti. contemperata la possibilità di residuare sacche d'infezione anche in specie eterologhe,, comunque recettive. l'infezione eterologa risulta spesso asintomatica favorisce ulteriormente la creazione e il persistere di reservoir virali. ( fauna selvatica).
8 PIANI ERADICAZIONE: 1. PIEMONTE 2. VENETO 3. LOMBARDIA 4. FRIULI V. GIULIA 5. PROVINCIA TRENTO PIANI DI CONTROLLO LAZIO (DGR 876 DEL 18/12/2006) LAZIO ( CAMPANIA
9 Piano in Campania
10 IBR in Campania Accertamento sierologico ufficiale obbligatorio trenta giorni prima dello spostamento, per bovini > 12 mesi movimentati verso allevamenti con capi da riproduzione, utilizzando lo stesso campione di sangue prelevato per gli altriaccertamenti obbligatori previsti prima dello spostamento degli animali;
11 riportare sul modello 4 di scorta, la data e l esito degli accertamenti sierologici : Negativo IBR: animale non infetto, risultato negativo alla ricerca di anticorpi totali; Negativo IBR-Vaccinato : animale non infetto vaccinato con vaccino deleto, risultato positivo alla ricerca di anticorpi totali e negativo alla ricerca degli anticorpi anti g. E; Positivo IBR : animale infetto o vaccinato con vaccino tradizionale, non deleto, risultato positivo alla ricerca di anticorpi totali e anticorpi anti ge;
12 i bovini da riproduzione di età superiore ai 12 mesi provenienti da altre Regioni italiane, sottoposti ad esame sierologico per IBR e risultati positivi IBR, non possono essere introdotti in allevamenti situati nel territorio della Regione Campania;
13 COSA FARE NEI CONFRONTI DELL IBR? Conoscere la situazione del proprio allevamento Prevalenza, numero assoluto di soggetti positivi ed incidenza dell infezione Porsi degli obbiettivi Controllo / Eradicazione In quanto tempo Con quali strumenti Decidere le strategie di intervento Misure di biosicurezza Gestione dei capi positivi Piano Aziendale Vaccinazione Risanamento!!!
14 Profilassi sanitaria Prevenzione = Biosicurezza Igiene dei ricoveri Limitare quanto possibile l ingresso l in allevamento di persone estranee e comunque dotarle di indumenti e calzari monouso Dotare di indumenti e calzari (monouso o esclusivi) i tecnici che per lavoro frequentano più allevamenti (veterinari, nutrizionisti,, tecnici APA, rappresentanti, ecc..) evitare che il personale d azienda d frequenti altri allevamenti Limitare al necessario l accesso l di automezzi destinati al trasporto degli animali o di prodotti (autocisterna del latte, camion mangimi, ecc..)
15 Igiene dei ricoveri Profilassi sanitaria individuare una zona separata per tali operazioni Effettuare pulizie e disinfezioni periodiche dei ricoveri Quarantena per i soggetti di nuova introduzione Controllo della movimentazione di animali in occasione di fiere, mercati, alpeggio
16 Corretta gestione aziendale (sovraffollamento- stress) Evitare situazioni stressanti (affollamento, maltrattamenti, manipolazioni superflue) Limitare l uso l di farmaci immunosoppressori (cortisonici), evitandone l impiego l su animali sieropositivi
17 in caso di sospetto clinico di IBR (aborti, malattie respiratorie, e, ecc) ricorrere tempestivamente alla conferma di laboratorio per contenere la diffusione dell infezione Se è praticata la monta naturale utilizzare tori sieronegativi solo su capi sieronegativi Effettuare l E.T. l con embrioni certificati provenienti da allevamenti indenni oppure trattati con chimotripsina. Utilizzo di colostro IBR-free (privo di anticorpi contro BHV1) proveniente da madri sieronegative
18 altre misure Ad esempio e non di meno: Quarantena per animali in introduzione Garantire il benessere animale Evitare la monta naturale fino all eradicazione Evitare contatti con ovini e caprini il loro ruolo nella diffusione è modesto ma da tenere in considerazione Gestione animali per categoria di età
19 Profilassi immunizzante
20 I vaccini sperimentati Vivi attenuati termosensibili TK neg attenuato ge neg attenuato Vaccini vivi a virus intero inattivato ge neg inattivato subunità gd Vaccini inattivati
21 Vaccini inattivati Vantaggi Sicuri Riduce la escrezione virale per titolo e giorni ( volte) Svantaggi ripetute inoculazioni Meno efficaci per forme cliniche non distinguibili dagli stipiti selvaggi efficacia dipende da diversi fattori (dose, protocolli vaccinali, adiuvanti)
22 Vaccini vivi Vantaggi stimolano adeguatamente l l immunità locale, umorale e cellulo- mediata proteggono contro le forme cliniche riducono la escrezione virale per titolo e giorni (2-3 3 giorni volte) Svantaggi inducono una blanda infezione hanno potenzialità abortigene vanno in latenza, si riattivano, vengono escreti e trasmessi alla popolazione recettiva non sono distinguibili dagli stipiti selvaggi
23 Vaccini termosensibili Vantaggi Via inalatoria Somministrabile in gravidanza Immunità mucosale Blocca infezione virus di campo Svantaggi Poco pratico
24 Vaccini a sub-unit unità Singole glicoproteine somministrate ad attività protettiva Ancora allo studio come vaccini a DNA ELISA per Ab Infetti subunità gd vaccinati ge gd
25 Vaccini marker -deleti (MIN (MIN DIVA) Punto di partenza per l ottenimento l di tali vaccini sono stati i vaccini tradizionali attenuati. In uova embrionate) Buk (arest) In CEF Zuffa Buk Z Z-300p Z-300 Z-900 Sk-624 Norden In PK
26 Vaccini marker -deleti (MIN (MIN DIVA) In seguito Bartha selezionò un mutante a piccole placche resistente al calore Tatarov selezionò in colture cellulari mutanti resistenti alla iododeossiuridina Differente pattern alla digestione con enzimi di restrizione Ricostituzione mediante ricombinazione con ceppi virulenti RISULTATI: Bartha è difettivo in 3 regioni Us, frammento BamHI 4 e BamHI 2/9 (ge( ge; ; CP; gc) Tatarov è difettivo per Tk Enzima di restrizione= Kpn I = ampiezza normale della regione Us nei ceppi virulenti I = = le piccole dimensioni del frammento I sono dovute a una delezione di 2,7 milioni di daltons nei ceppi Skoda e nel ceppo Bartha
27 Vaccini marker -deleti (MIN (MIN DIVA) Con le moderne tecniche dell'ingegneria genetica, è oggi possibile produrre dei vaccini, cosiddetti "a delezione genomica : sprovvisti di potere patogeno, in grado di consentire la distinzione fra animali vaccinati e infetti. La scelta della delezione può ricadere su un qualsiasi antigene virale, a condizione che : nell'infezione di campo, sia sempre espresso e in grado di indurre la produzione di anticorpi specifici; non deve però essere un antigene essenziale ne per la replicazione virale, ne per l'induzione dell'immunità.
28 Vaccini marker -deleti (MIN (MIN DIVA) Questi vaccini vengono prodotti introducondo una doppia delezione in siti ben precisi del genoma virale. La prima delezione,, geneticamente stabile, riguarda un gene essenziale per la virulenza (annullata la patogenicità del ceppo vaccinale). La seconda delezione induce un cosiddetto "marker immunologico negativo.
29 Vaccini marker -deleti (MIN (MIN DIVA) Ovviamente, la delezione non può: riguardare gli antigeni considerati indispensabili per la replicazione del virus (gb, gd, gh, gl), né quelli considerati gli immunogeni più importanti (gd( gd, gc). Anche la delezione della gg non sembra praticabile, poiché non tutti i suini infetti producono anticorpi anti-gg gg; ; inoltre, queste immunoglobuline persistono per un arco di tempo limitato (< 6 mesi). La delezione combinata delle glicoproteine gi e ge sembra, dunque, la più vantaggiosa e solitamente viene associata alla delezione della TK.
30 Vaccini marker -deleti (MIN (MIN DIVA) Vaccino marker (BoHV-1, PRV) : deleto del gene ge Principio : Differenziare l animale vaccinato da quello infetto U L Regione Unica Lunga I R Regione ripetitiva T R Regione ripetitiva UL53 gk UL44 gc UL27 gb UL22 gh tk UL10 gm UL1 gl Delezione del gene US4 gg US6 gd US7 gi US8 ge U S Regione Unica Corta
31 Vaccini marker -deleti (MIN (MIN DIVA) gd gb gb gd ELISA per Ab Infetti gb gb ge gb vaccinati Inattivati Attenuati : duplice delezione Fondamentali per piani di eradicazione Necessità di utilizzare il companion test kit ELISA Costosi
32 Vaccini deleti: : possibili rischi (?) l'impiego al lungo frenato dal rischio di una loro ricombinazione ira vivo con ceppi virulenti selvaggi : riacquisizione della struttura virale iniziale e della patogenicità la comparsa di un marker immunologico negativo nel ceppo selvaggio. improbabile, necessita presenza contemporanea, nello stesso animale, del virus deleto e del virus selvaggio: gli animali vaccinati acquisiscono, in alcune settimane, uno stato to di protezione totale. una stessa cellula dovrebbe venire infettata, nello stesso momento, da dosi elevate di entrambi i virus (la concentrazione ambientale del virus selvaggio è molto più bassa rispetto a quella del virus vaccinale).
33 Vaccini deleti: : possibili rischi (?) Se la penetrazione dei due virus non è contemporanea, il virus selvaggio, penetrato per secondo, non è più in grado di moltiplicarsi, dato che la replicazione del DNA si arresta poche ore dopo l'infezione. Una ricombinazione in vivo potrebbe anche avvenire fra due ceppi vaccinali avirulenti e geneticamente diversi, con loci residui di virulenza non sovrapponibili: il locus difettivo del genoma di un virus potrebbe venire compensato dalla parte omologa del genoma di un altro virus avirulento, deleto in un altro punto.
34 Vaccini deleti Vantaggi dei vaccini deleti: La vaccinazione non preclude all identificazione sierologica degli infetti Di conseguenza la situazione siero-epidmiologica epidmiologica può essere valutata in popolazioni vaccinate L efficacia può essere ben e facilmente valutata in trials di campo Possono essere implementati programmi di vaccinazione- eradicazione
35 Vaccini deleti: : conclusioni Da quanto sopra esposto, emergono due considerazioni: più sono i geni deleti in un vaccino, più questo è attenuato e, di conseguenza innocuo, e minori sono le probabilità che riacquisti la virulenza; è essenziale evitare l'uso, nello stesso allevamento, di vaccini con delezioni diverse nei geni coinvolti nella virulenza, per non correre il rischio di una possibile ricombinazione in campo.
36 Vaccini deleti: : tests Cruciale nei programmi di eradicazione con i vaccini diva (MIN) è la qualità del test diagnostico. Tale test deve essere sufficientemente sensibile e specifico da rilevare gli infetti latenti Gli anticorpi per le proteine delete devono essere rilevabili entro 3 settimane dopo l infezione l e persistere per almeno un anno ma preferibilmente tutta la vita Animali ripetutamente vaccinati con vaccini DIVA devono risultare negativi al test Dovrebbe essere possibile analizzare vari tipi di liquidi organici Il test deve avere una sensibilità e una specificità più elevata dei tests convenzionali
37 Lesioni nasali in gruppi di animali vaccinati e non, infettati al giorno 0 4 lesioni nasali ge-inattivo ge- vivo subunità gd controllo giorni P.I. da J.C. Bosch et al.: 1996
38 Titoli virali medi rilevati in secrezioni nasali in 12 soggetti [6 vaccinati (ge( - inatt.) e 6 controlli] infettati per via nasale 10 TCID50/ml secreto nasale Giorni P.I. vacc cont da J.T. van Oirshot et al.: 1996
39 Vaccinazione L efficacia dei vaccini per essere registrati deve soddisfare i seguenti criteri come previsto dalla Farmacopea Europee diminuire la sintomatologia clinica diminuire di 100 volte la concentrazione massimo di virus escreto
40 Riattivazione dell infezione Latente in un animale sieropositivo non vaccinato R 0 = 7 log10 TCID50/m l giorni P. dexam. treat.
41 Riattivazione dell infezione Latente in un animale sieropositivo vaccinato X + log10 TCID50/ml gevivo gespento R giorni P. dexam. treat. il vaccino attenuato riduce la trasmissione mentre il vaccino inattivato riduce la quantità di virus eliminato dopo la riattivazione
42 Abs modulano l escrezione l virale dopo riattivazione Titolo anticorpi I L R L R L R L R L R L R L Età in anni Infezione primaria: I Latenza: L Riattivazione: R
43 Se usiamo un vaccino vivo Titolo anticorpi V L R L R L R L R L R L R L Età in anni Vaccinazione: V - Latenza: L -Riattivazione: R
44 Vaccinazione Non protegge contro l l infezione Protegge contro la malattia Se l l animale si infetta riduce l escrezione l virale Ad ora, nessuno studio sul vaccino deleto riporta un R0 < di 1 (minimo valore ottenuto 1,2) solo con l applicazione congiunte delle norme di biosicurezza si è scesi sotto R0 < di 1
45 Controllo Allontanamento dei capi sieropositivi Esclusione dalla monta dei soggetti sieropositivi Vaccinazione dei soggetti infetti Vaccinazione dei soggetti negativi (marker)
46 Criteri per un utilizzo razionale dei Alta prevalenza 50% vaccini Sieropositività da pregresse vaccinazioni Uso di vaccini tradizionali Assenza di forme cliniche Sieronegatività negli animali fra 6 e 12 mesi non vaccinati Vaccinazione con marker spento Sieropositività da infezione di stipiti selvaggi Presenza di forme cliniche Incertezza sull uso di vaccini tradizionali Vaccino spento tradizionale su sieropositivi Vaccino marker vivo su sieronegativi
47 Criteri per un utilizzo razionale dei Bassa prevalenza < 3% vaccini Sieropositività da pregresse vaccinazioni Sieropositività da infezione di stipiti selvaggi Vaccinazione con marker spento
48 E io????????
49 Infezioni da alfaherpesvirus nel bufalo Due virus: BoHV-1: El-Kholy AA ; Peshev R, Christova L Peshev R, Christensen L, L Christova L Renukaradhya GJ, Rajasekhar M, Raghavan R BuHV-1 El-Kholy AA ; De Carlo E et al St George TD, Philpott M
50 Situazione epidemiologica dell infezione da herpesvirus nel bufalo: Bovine Herpesvirus 1 (BoHV-1)???? o Bubalunie Herpesvirus 1 (BuHV-1)????
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53 De Carlo E. et al., 2004
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55 Wellenberg et al., Veterinary Microbiology 78 (2001) 79±84 VN gb ELISA ge ELISA BHV BHV Indenne Vaccinato IBR ge marker + + -
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57 Scicluna M.T. et al., 2007 Ital.J Anim. Sci. Vol 6, (Suppl.2), , 849, VIII Buffalo Congress allevamenti Frosione -Latina VN gb ELISA ge ELISA BuHV BoHV Indenne Vaccinato IBR ge marker + + -
58 Scicluna M.T. et al., 2007 Ital.J Anim. Sci. Vol 6, (Suppl.2), , 849, VIII Buffalo Congress allevamenti Frosione -Latina
59 Indispensabile quindi: Conoscere : la prevalenza HV nella popolazione bufalina in Campania ( in progress) Immunogenicità ed effeicacia dei vaccini deleti nel bufalo d acqua (primi dati)
60 Disegno sperimentale 30 bufali HV negatrivi (3 gruppi di 10 capi ciascuno: gruppo A, B, C) di età compresa tra i mesi di età,, maschi e femmine, sieronegativi per VN ed ELISA gb e ge per BoHV-1. A) Controlli: 10 animali sani sieronegativi che riceveranno 2 ml di soluzione fisiologica ad ogni trattamento; B) ge inattivato: 10 animali sani sieronegativi, vaccinati con vaccino ge marker inattivato secondo lo schema descritto per il bovino (due somministrazioni per via IM a distanza si settimane); C) ge attenuato: 10 animali sani sieronegativi, con vaccino ge marker attenuato secondo lo schema descritto per il bovino (due somministrazioni la prima per via intranasale e la seconda per via IM a distanza si settimane);
61 Disegno sperimentale Challenge: : BoHV-1 1 (5)e BuHV-1 1 (5) ceppo Metzler per via intra-nasale nasale alla dose di 107TCID50 /narice monitorando l effetto l clinico e l escrezione l virale. Riattivazione dell infezione latente : desametazone per via i.m.... VN ELISA gb/ge Isolamento virologico e titolo PCR Test gamma interferon
62 Risultati preliminari Scarsa sintomatologia clinica Lieve ipertermia (>39,5) esclusivamente in due animali del gruppo controllo infettati con BuHV-1 1 ed 1 infettato con BoHV-1 1 (gg( 1-22 pi ) di breve durata (24h) Lieve rinite Sierologia : ge sino a challenge (eccetto infetti BuHV-1) gb sieroconversione lenta post vaccinale 15 gg cut-off 45%? VN indaginoso ma molto sensibile Gamma interferon: reattività elevata nei controlli Stimulation index non elevato Escrezione nasale: considerevolmente ridotta rispetto a bovini (1-3 3 log) per entrambe HV
63 Grazie per l attenzionel
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