I crostacei negli alimenti: rilevazione immunodiagnostica

Transcript

1 I crostacei negli alimenti: rilevazione immunodiagnostica Per la rilevazione quantitativa di crostacei negli alimenti, un azienda lombarda, dopo aver sviluppato un test diagnostico di carattere molecolare, basato sul riconoscimento del DNA, mette ora a disposizione un nuovo test di carattere immunoenzimatico di Michela Morelli, Alessandro Mognoni e Monica Gevi IInCura ha ideato CrusAlert ELISA Kit che permette l individuazione e la quantificazione di proteine di crostaceo a partire da qualsiasi matrice alimentare, sia essa un ingrediente o un prodotto finito. Il kit ha dimostrato di essere altamente selettivo nei confronti dei crostacei, eliminando quasi completamente il problema comune ad altri kit sul mercato della cross reattività con i molluschi. Si rivela quindi un utile strumento per l individuazione dei crostacei negli alimenti, così come indicato dalla direttiva europea 2003/89/CE in ambito di regolamentazioni di etichettatura. Le allergie alimentari Molti alimenti possono provocare anche gravi reazioni avverse in individui che soffrono di allergie o intolleranze alimentari. Data l attuale assenza di cure, le persone allergiche devono rigorosamente eliminare dalla dieta i cibi che contengono l allergene. Per fornire ai consumatori una informazione completa riguardo ai potenziali allergeni contenuti in un alimento, sono state imposte restrittive regolamentazioni di etichettatura (Direttiva 2003/89/EC), le quali indicano che i principali allergeni alimentari, siano essi additivi aggiunti per migliorare l aspetto, il gusto o la conservabilità oppure contaminanti, siano chiaramente indicati in etichetta. Gli allergeni più diffusi sono stati raccolti in un elenco (allegato III bis della Direttiva 2003/89/EC), il quale è stato poi aggiornato nel 2006 (2006/142/CE) con l aggiunta di lupino e molluschi. La normativa indica che tutti gli allergeni citati e i loro derivati siano dichiarati in etichetta anche se presenti in minime quantità. Poiché questi alimenti possono essere presenti come contaminanti accidentali, ovvero in tracce, ma possono essere pericolosi anche in quantità minime per i soggetti allergici, è nata la necessità di mettere a punto tecniche di laboratorio sufficientemente sensibili da poterli rilevare fino a circa 1 parte per milione o ppm (mg per chilo di alimento). La necessità di rilevare la presenza anche in tracce di allergeni in ingredienti o prodotti processati ha quindi portato alla messa a punto di due metodi analitici molto sensibili e complementari: le tecniche PCR di analisi del DNA e le tecniche ELISA basate sul riconoscimento delle proteine. Il centro di ricerca InCura di Vicomoscano, in 64

2 di questo test, primo nel suo genere commercializzato e protetto da brevetto, consiste nel fatto che quasi tutte le specie di crostacei commercializzate ai fini alimentari a livello internazionale vengono individuate con un limite di rilevazione inferiore a una coppia di genoma aploide di crostaceo (pari a circa 1,25 picogrammi di DNA di Penaeus monodon). Inoltre CrusKIT PCR e CrusKIT PCR Real Time sono stati ottimizzati affinché nessuna specie di pesce o altro organismo (animali, vegetali, funghi, procarioti) determini una risposta positiva all analisi. Fig. 1-Schema riassuntivo del principio di funzionamento del sistema ELISA di tipo competitivo indiretto. provincia di Cremona, ha sviluppato sistemi diagnostici appartenenti a entrambe le categorie per poter soddisfare al meglio le diverse necessità del mercato riguardanti la maggior parte degli allergeni gia elencati. In particolare, nel giugno 2006, la rivista Biotecnologie 2000 si è già occupata della messa a punto di un sistema di analisi del DNA per la rilevazione di crostacei. Ora è stato sviluppato anche un sistema di carattere immunoenzimatico per la rilevazione di proteine di crostacei negli alimenti: CrusAlert ELISA Kit. Tecniche biomolecolari per la rilevazione degli allergeni nascosti Le tecniche diagnostico-molecolari basate sull analisi del DNA tramite PCR permettono di rilevare con elevata sensibilità e specificità la presenza di DNA di crostacei nell alimento. I kit PCR sviluppati da Incura forniscono un metodo diagnostico molecolare rapido che consente la rilevazione di DNA di crostacei in vari tipi di matrici, sia materiali grezzi che prodotti finiti, discriminandolo dalla presenza di DNA di altre specie animali. Il vantaggio Tecniche immunodiagnostiche per la rilevazione degli allergeni nascosti Le tecniche immunoenzimatiche si basano sul riconoscimento di una o più proteine tipiche dell alimento da rilevare. La metodica ELISA riproduce ciò che accade in vivo in un individuo allergico. In quest ultimo, alcune proteine (allergeni), naturalmente accettate in individui non allergici, non vengono riconosciute e la loro ingestione, o l ingestione degli alimenti che le contengono, determina una reazione negativa (reazione allergica). Tale reazione allergica comporta la produzione di anticorpi di difesa dell organismo specifici verso tali allergeni, con lo scopo di neutralizzarli. La specificità del meccanismo antigene-anticorpo è riproducibile in vitro, poiché è possibile ottenere dagli animali (per esempio i conigli) degli anticorpi specifici contro uno o più allergeni gia identificati, oppure genericamente contro un gruppo di proteine tipiche dell alimento allergenico. Questi anticorpi possono poi essere utilizzati per la rilevazione delle proteine contro cui sono stati prodotti in un sistema sviluppato appositamente (sistema ELISA). Il principale allergene termostabile presente nei crostacei è stato descritto per la prima volta da Hoffman et al. (1981) e poi identificato come tropomiosina da Shanti et al. (1993). È 65

3 Matrici alimentari verificate nello studio del buffer di estrazione Pasta, pasta all uovo, pane fresco, pane confezionato, biscotti per l infanzia, omogeneizzato di carne e di verdure, condimenti a base di pomodoro, formaggio, verdure, noci e carni, maionese, prosciutto cotto, patate fritte, pesto. una proteina dal peso apparente variabile tra i di 32 e i 38 KDa, a seconda della specie da cui viene isolata. Il centro di ricerca InCura ha sviluppato un sistema diagnostico ELISA di tipo competitivo indiretto per la rilevazione di proteine di crostaceo nei derivati alimentari. Il sistema utilizza anticorpi policlonali diretti contro l allergene principale Pen a 1, ovvero la tropomiosina di gamberetto, isolata e purificata da Penaeus vannamei, fra i più comuni gamberi di allevamento utilizzati Fig. 2- Esempio di interpretazione semi-quantitativa dei risultati. dalle industrie agroalimentari. I laboratori InCura hanno ottimizzato il sistema basato sul riconoscimento della tropomiosina in modo da rilevare la presenza di crostaceo in matrici alimentari differenti, senza evidenziare alcun tipo di cross reagenza nei confronti dei pesci o altri organismi. Il sistema presenta una debolissima cross reagenza con i molluschi e gli artropodi, probabilmente giustificata dalla Allegato III bis Direttiva 2003/89/EC. Ingredienti di cui all articolo 6, paragrafo 3 bis, 10 e Cereali contenti glutine (frumento, segale, orzo, avena, farro, kamut o loro ceppi derivati) e prodotti derivati. - Crostacei e prodotti a base di crostacei. - Uova e prodotti a base di uova. - Pesce e prodotti a base di pesce. - Arachidi e prodotti a base di arachidi. - Soia e prodotti a base di soia. - Latte e prodotti a base di latte. - Frutta a guscio (mandorle, nocciole, noci comuni, noci di acagiù, noci pecan, noci del brasile, noci del Qeensland, pistacchi) e prodotti derivati. - Sedano e prodotti a base di sedano. - Senape e prodotti a base di senape. - Semi di sesamo e prodotti a base di sesamo. - Anidride solforosa e solfiti in concentrazioni superiori a 10mg/Kg o 10mg/L espressi come solfiti. Direttiva 2003/89/EC. Ingredienti di cui all articolo 1: - Lupino e prodotti a base di lupino. - Molluschi e prodotti a base di molluschi. loro vicinanza filogenetica. Il test determina la presenza/assenza di crostacei nell alimento indagato nonché la sua concentrazione fino a una soglia di rilevazione minima di circa 1 ppm di proteine totali di gamberetto. Il sistema è stato tarato contro l estratto proteico totale di Penaeus vannamei ed è quantitativo nell intervallo 2-12,5 ppm. Componenti del kit CrusAlert ELISA Kit fornisce tutti i componenti per compiere analisi su matrici alimentari diverse. Il kit provvede il tampone per l estrazione della frazione proteica potenzialmente contenente l allergene, i reattivi per l allestimento di un esperimento su piastra ELISA, le indicazioni per l interpretazione quantitativa dei risultati. Estrazione frazione proteica L estrazione della frazione proteica da matrice alimentare prevede un protocollo piuttosto semplice, che garantisce la migliore efficienza in termini di quantità di proteine estratte comprendendo il maggior numero di matrici alimentari, con particolare attenzione a quelle presenti sul mercato italiano. Per rispondere alle richieste di garanzia di qualità, le prove 66

4 Molluschi testati Sepiella japonica (seppia); Octopus membranaces (polpo indocinese); Sepia officinalis (seppia); Loligo edulis (totano); Nototodarus sloanii (totano); Mytilus chilensis (cozza); Paphia ondulata (vongola); Argopecton porporatus (capasanta); Murex brandaris (murice); Solen marginatus (cannolicchio). eseguite per verificare la funzionalità del protocollo di estrazione si sono basate sulla tecnica dello spike. Essa prevede l aggiunta di quantità note e variabili (nella fattispecie 5 e 10 ppm) di proteine di crostaceo a matrici diverse, e la verifica della quantità di spike rilevata dal sistema in termini percentuali. Le matrici verificate nello studio del protocollo di estrazione sono riportate nel box. Principio del test CrusAlert ELISA Kit è un sistema di tipo competitivo indiretto. Prevede una prima reazione antigene anticorpo in provetta definita competitiva. La competitiva è una reazione parallela a quella in piastra ELISA basata sul riconoscimento tra una quantità di antigene da definire e una quantità di anticorpo limitante. Nella reazione competitiva una parte della quantità totale di anticorpo si lega all antigene restando quindi non disponibile per l antigene legato alla matrice. Quando la reazione viene trasferita in piastra, solo la frazione di anticorpo ancora libera può riconoscere l antigene bloccato alla piastra. Maggiore è la quantità di antigene nella reazione competitiva, minore è la quantità di anticorpo che può riconoscere l antigene bloccato alla piastra. Un anticorpo secondario coniugato perossidasi riconosce il primario legato alla piastra e in presenza di un substrato specifico sviluppa una reazione colorimetrica inversamente proporzionale alla quantità di antigene nella reazione Fig. 3- Esempio di equazione ottenuta dall interpolazione degli standards da utilizzare nell interpretazione quantitativa dei risultati. competitiva (fig.1). Durante la reazione competitiva, il campione estratto viene fatto reagire con l anticorpo policlonale. Come standard di taratura è utilizzato l estratto totale di gamberetto fornito dal kit e gia opportunamente quantificato a 12,5-2,5-0,5-0 ppm (al netto dei fattori diluitivi). Interpretazione dei risultati Al termine dell esperimento su piastra, si ottiene uno sviluppo di colore che può essere letto con uno spettrofotometro Albicocca, anacardo, arachide, avena, caffè non tostato, carne bovina, carne di maiale, ciliegia, cocco, fagiolo, fagiolo roso, fave, formaggio bovino, formaggio di capra, formaggio di pecora, frumento, latte di capra, latte di pecora, lenticchie, lupino, noce macadamia, mandorla, merluzzo, miglio decorticato, noce, noce brasiliana, nocciola, orzo, pinoli, pisello, pistacchio, pollo, polpa di zucca, prugna, riso, segale, sedano, semi di girasole, semi di zucca, senape, sesamo, soia, tacchino, trota.a seguito della considerazione che i crostacei sono classificati come artropodi, è stata verificata la cross reagenza del kit nei confronti di proteine estratte da alcuni rappresentanti dello stesso gruppo (vespe, alla lunghezza d onda di 450nm. Il sistema sviluppato non necessita di alcun supporto software specifico e permette di ricavare direttamente dalla curva di taratura il contenuto in ppm di proteine di crostaceo nel campione analizzato. In pratica, i valori medi di assorbanza ottenuti per gli standards sono visualizzati in un sistema di coordinate contro la concentrazione di proteine di gamberetto espresse in mg per kg di campione (ppm). La curva di taratura è lineare nell intervallo 0,5-12,5 ppm (figura 2) e da essa si ricava una Alimenti da cui sono state estratte proteine per testare la specificità del kit ragni, blatte e mosche). È stata stabilita una percentuale di riconoscimento scarsamente rilevante dell ordine del 0.125%. Inoltre, dato che in letteratura la tropomiosina risulta il principale allergene riconosciuto dai sieri di pazienti allergici ai crostacei (come gamberi, granchi, astici e aragoste) ma anche allergici ai molluschi (totani, seppie, cozze, vongole, ecc), è stata studiata la cross reattività anche nei confronti di questo ultimo gruppo. Confrontando in ELISA quantità diverse di proteine estratte da molluschi (box in alto) si è arrivati a stabilire una percentuale di cross reagenza compresa tra lo 0.006% e lo 0.05%, dato inaspettatamente basso considerate le premesse. 67

5 western blot in grado di visualizzare le proteine che sono riconosciute da un anticorpo. Come si può osservare in figura 4, l anticorpo policlonale sviluppato in coniglio presenta caratteristiche di riconoscimento nei confronti dell antigene confrontabili con quelle degli anticorpi contenuti nel siero umano. Fig. 4 Confronto tra Western Blot. Gli estratti proteici trasferiti su membrana di nitrocellulosa sono riportati di seguito: 1. Macrobachium rosembergii (gambero blu); 2. Penaeus vannamei (gambero); 3. Squilla mantis (canocchia mediterranea); 4 Nephrops norvegicus (scampo); 5 Pandalus borealis (gamberetto); 6 Crema IKEA al 2% di gamberetto; 10 Gadus morhua (merluzzo). In A: ibridazione con l anticorpo policlonale di coniglio utilizzato in Crus Alert ELISA Kit; in B: ibridazione con il siero di un paziente con allergia ai crostacei. Risulta evidente la corrispondenza di reattività tra i due sieri. indicazione semiquantitativa del contenuto in proteine di gamberetto. È possibile ricavare una esatta quantificazione dell allergene rilevato dal sistema mediante una rielaborazione dei dati su foglio Excel (fig. 3). Specificità Per accertare che non vi fossero fenomeni di cross reagenza, la specificità di CrusAlert ELISA Kit è stato verificata nei confronti di estratti proteici di numerosi ingredienti alimentari (box 2). A seguito della considerazione che i crostacei sono classificati come artropodi, è stata verificata la cross reagenza del kit nei confronti di proteine estratte da alcuni rappresentanti dello stesso gruppo (vespe, ragni, blatte e mosche). È stata stabilita una percentuale di riconoscimento scarsamente rilevante dell ordine del 0,125%. Inoltre, dato che in letteratura la tropomiosina risulta il principale allergene riconosciuto dai sieri di pazienti allergici ai crostacei (come gamberi, granchi, astici e aragoste) ma anche allergici ai molluschi (totani, seppie, cozze, vongole, ecc), è stata studiata la cross reattività anche nei confronti di questo ultimo gruppo. Confrontando in ELISA quantità diverse di proteine estratte da molluschi (box a pag. 67) si è arrivati a stabilire una percentuale di cross reagenza compresa tra lo 0,006% e lo 0,05%, dato inaspettatamente basso considerate le premesse. Per confermare la validità scientifica del sistema ELISA sviluppato, è stato confrontato il siero utilizzato per il kit con quello di un paziente allergico ai crostacei mediante la tecnica immunoenzimatica di bibliografia Crowter J.R. «The ELISA Guidebook». Methods in molecular biology, Vol 149. Humana Press, Totowa, New Jersey (2001) Harlow E., Lane D. «Antibodies. A laboratory manual». Cold Spring Harbor Laboratory 1998 Lu Y., Ohshima T., Ushio H., Hamada Y., Shiomi K. «Immunological characteristics of monoclonal antibodies against shellfish major allergen tropomiosin». Food Chemistry 100, (2007). Jeoung B.J., Reese G., Hauck P., Oliver J.B., Daul C.B., Lehrer S.B. «Quantification of the major brown shrimp allergen Pen a 1 (tropomyosin) by a monoclonal antidody-based sandwich ELISA». J. Allergy Clin Immunology «Opinion of the scientific panel on dietetic product, nutritious and allergic on a request from the commission related to the evolution of mollusc for labelling purpose». The EFSA Journal 327, 1-25 (2006). Auckland Allergy Clinic Seafood Allergy (2003) DeWitt A.M., Mattsson L., Lauer I., Reese G., Lidholm J. ELISA CrusAlert I vantaggi offerti da CrusAlert ELISA Kit consistono in una elevata specificità verso i crostacei e una bassissima cross reagenza nei confronti di molluschi e artropodi. Molto approfondita è la conoscenza delle matrici alimentari verificate e tipiche del mercato italiano. Altrettanto rilevante è la possibilità di eseguire una interpretazione dei dati quantitativi senza necessità di un software dedicato. Altri kit InCura disponibili per la rilevazione ELISA di allergeni alimentari: MilkAlert ELISA Kit, per la determinazione quantitativa di proteine di latte in alimenti; PeanutAlert ELISA Kit, per la determinazione quantitativa di proteine di arachide ed EggAlert ELISA Kit, in grado di rilevare proteine di albume d uovo in prodotti destinati all alimentazione umana e animale. «Recombinant tropomyosin from Penaeus aztecus (rpen a 1) for measurement of specific immunoglobulin E antibodies relevant in food allergy to crustaceans and other invertebrates». Mol Nutr Food Res. 48(5):370-9 (2004). Ayuso R, Lehrer S.B., Reese G. «Identification of continuous, allergenic regions of the major shrimp allergen Pen a 1 (tropomyosin)». Int Arch Allergy Immunol. 127(1):27-37 (2002). Reese G., Ayuso R., Carle T., Lehrer S.B. «IgE-binding epitopes of shrimp tropomyosin, the major allergen Pen a 1». Int Arch Allergy Immunol. 118(2-4):300-1 (1999). Leung P.S., Chow W.K., Duffey S., Kwan H.S., Gershwin M.E:, Chu K.H. «IgE reactivity against a cross-reactive allergen in crustacean and mollusca: evidence for tropomyosin as the common allergen.» J. Allergy Clin. Immunol. 98: (1996). Pastorello E.A., Trambaioli C. «Isolation of food allergens». Review. Journal of Chromatography B, (2001) Fuller H.R., Goodwin P.R., Morris G.E., «An Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for the major crustacean allergen, tropomyosin, in food». Food and agricultural immunology.17 (11):43-52 (2006) 68