La sierologia si può usare come screening? Non sul singolo animale: Solo 11,8% (12/102) con PCR ed ELISA pos. Solo 3,92% (4/102) con PCR e FDC pos.

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1 La sierologia si può usare come screening? Non sul singolo animale: Solo 11,8% (12/102) con PCR ed ELISA pos. Solo 3,92% (4/102) con PCR e FDC pos. FDC viene confermata da ELISA FDC è frequentemente associata allo stato di animale eliminatore ELISA va bene come screening di gruppo

2 ELISA valido screening ( anche latte) prova indiretta, Ag in fase I+II FDC specifica ma poco sensibile - soglia 1:10, Ag in fase II PCR: eliminazione intermittente, diagnosi costosa Attribuzione di indennità non del tutto certa

3 Non esiste un metodo ufficiale, anche se tutti sono citati dal Manuale OIE IFAT ed ELISA sono confrontabili FDC poco sensibile perché: Fattori anticomplementari nel siero Sub-classi IgG: nei ruminanti solo IgG1 fissano il complemento IgG2 e IgM possono inibire la FDC da parte di IgG1

4 IFAT: no kit ad uso veterinario, poco standardizzabile ELISA: diversi kit e diverse sensibilità Raccomandato l uso di kit ELISA con Ag isolati da ruminanti Da definire i cut-off Sierologia da sola non è sufficiente

5 Fondamentale perché: I segni clinici non sono specifici C è un alta frequenza di infezioni inapparenti I gruppi con alta prevalenza di infezione sono anche quelli importanti per la salute pubblica Diagnosi differenziali: agenti abortigeni (Brucella, Chlamydophila, Toxoplasma, Salmonella, ecc.)

6 Immunità umorale Ab rilevabili 2-3 sett. PI; prima anti-fase II Eliminatori sieronegativi Immunità cellulo-mediata: cruciale per la protezione skin test, IFN- test Modulazione tra IFN- e IL-10 (dipendente da ospite, ceppo, DI) Risposta a vax anti fase II vs fase I

7 Sieroconversione sul singolo è solo indicativa di circolazione dell agente Sierologia ok se combinata alla PCR Sieri da gruppo di soggetti con problemi rirpoduttivi/aborto: almeno 6 animali, 3 primipare e 3 pluripare, che hanno abortito (tra 15 gg e 4 mesi), o con problemi riproduttivi

8 Animali possono restare sieropositivi per anni dopo infezione acuta Alcuni eliminano Coxiella prima di sieroconvertire Alcuni non sieroconvertono Non distinguibile vaccinazione Skin test per selezionare animali negativi da vaccinare

9 PCR: ad oggi il metodo più rapido e sensibile per identificare gli eliminatori Real-time PCR: quantificazione Specificità comparabile tra diversi laboratori Sensibilità: multiple copy target IS1111 più sensibile Matrici: tampone vaginale, placenta, (alta carica), latte (bassa carica), feci, urine, sperma (sporadici)

10 L eliminazione può persistere per mesi, ma la massima escrezione avviene entro una settimana da parto o aborto Campione: tampone vaginale, placenta, cotiledoni (aree necrotiche), organi fetali (milza, polmone, fegato) o contenuto abomasale del feto Conferimento al laboratorio per estrazione DNA entro ore, campione a +4 C

11 Tampone vaginale/placenta: matrici ideali Feci, latte: eliminazione debole e/o discontinua Latte di massa: eliminazione frequente in vacche asintomatiche, meno in pecore Capre: osservate tutte e tre le vie, ma il latte sembra una via frequente LATTE DI MASSA: buono screening per bovini e capre (ma non per diagnosi di aborto)

12 PCR su placenta o tampone vaginale: 10 4 batteri/g In tessuti fetali o contenuto abomasale del feto: è sufficiente un risultato positivo Per campioni in pool (tamponi): 10 3 batteri/g per pool Alla lettura dell esito: soglia di positivit{ Real-time PCR è Ct<40

13 Soggetti N. campioni Analisi Numero Feti/vacche Aborto<8gg Tampone vag. placenta organi fetali Real-time PCR Fino a 3 vacche Aborti tra i 15 gg e 4 mesi prec. Siero ELISA Almeno 6 (3 primipare e 3 pluripare) Vacche con problemi riproduttivi Solo se il primo gruppo è <6 (Vacche di controllo)

14 Es. 2 aborti analizzati: a) Entrambi PCR+: diagnosi confermata b) 1 PCR+ e sierologia con meno di 50% di positività: ritestare dopo 3 settimane a) >50% positivi: confermata b) <50% positivi: improbabile c) Entrambe PCR -: diagnosi esclusa

15 Es. 1 aborto analizzato + 6 sieri: a) PCR+ e sierologia >50%: confermata b) PCR+ e sierologia <50%: ritestare dopo 3 settimane, come sopra c) PCR- e sierologia >50%: testare altri aborti d) PCR- e sierologia <50%: esclusa

16 Se PCR è negativa, la sierologia: a) >50% positivi: sospetto monitorare aborti con PCR b) <50% positivi: esclusa

17 Soggetti N. campioni Analisi Numero Feti/capi Aborto<8gg Tampone vag. placenta organi fetali Real-time PCR + d.d. Se c è solo 1 campione per PCR o se 1 è negativa 2 PCR individ. 2 pool di 3 capi Aborti tra i 15 gg e 3 sett. prec. Capi con problemi riproduttivi Siero ELISA Almeno 10 capi, privilegiando quelli con problemi (Capi di controllo)

18 Es. 2 aborti analizzati a) Entrambi PCR+: diagnosi confermata b) 1 PCR+: testare nuovi soggetti con PCR, se almeno un altro è +: conferma c) Entrambe PCR-: diagnosi esclusa

19 Es. 1 aborto analizzato + 10 sieri: a) PCR+ e sierologia >50%: confermata b) PCR+ e sierologia <50%: caso isolato? Monitorare nuovi casi c) PCR- e sierologia >50%: monitorare nuovi casi d) PCR- e sierologia <50%: esclusa

20 Es. disponibili solo sieri (10 o più) Se 50% o più positivi, diagnosi confermata Se meno di 50%, continuare monitoraggio sui nuovi casi

21 Protocollo diagnostico (Rodolakis 2006) PCR su latte di massa Sierologia su 10 vacche problema PCR +, sierologia > 50%: sì FQ PCR +, sierologia < 30%: FQ recente PCR -, sierologia > 60%: sospetto moderato PCR -, sierologia < 30%: sospetto debole PCR -, sierologia 0: no FQ

22 Aborti tardivi, natimortalità, nascita di soggetti deboli (fino al 90% delle femmine gravide può essere infetta) PCR o isolamento positivo (tampone vaginale, placenta o feto) Sierologia positiva (>50%)

23 Stalle < 100 capi: 2 aborti/mese o 3/anno Stalle > 100 capi: >4% di aborti/anno Metriti, infertilità, aborti, vitelli con scarso peso alla nascita Altri sintomi: polmoniti, aborti, parti prematuri, nati deboli, metriti, infertilità PCR o isolamento positivo (tampone vaginale, placenta o feto) Sierologia positiva >50%

24 Aborto / parto Una settimana dopo il parto / aborto nello scolo vaginale Fino a 2 anni nel latte Discontinua nelle feci Urine? Migliori matrici per PCR sono: placenta, latte, tampone vaginale nei primi giorni dall'aborto

25 Treviso 2007: problemi diffusi di infertilità in allevamento di bovine da latte. Esclusi BVDV, Neospora caninum, Brucella abortus, IBRV, Chlamydophila spp. e Leptospira spp. Sieropositivi per Febbre Q 4/6 animali. Monitorate le diverse vie di eliminazione e la persistenza dell infezione

26 Campioni individuali di siero, tamponi vaginali, feci e latte sulle 77 vacche (42 in lattazione) Selezionati 20 animali (10 positivi + 10 negativi) per follow-up study. Positive se positivi almeno a 2 test; negativi se negativi a tutti i tests. Ogni 3 mesi: Real-time PCR su latte, feci e tamponi vaginali sui 20 soggetti, sierologia su tutte le vacche in lattazione.

27 Table 1: sampling timetable and results of the different assays used for C. burnetii No. positives/total examined (%) Sampling PCR CFT ELISA date Milk Faeces Vaginal swab 28/05/07 2/6 (33.3) 01/08/07** 4/77 4/ (66.6) 19/06/07 1/6 (16.6) 4/6 (66.6) 2/6 (33.3) /77 6/43 9/77 1/54 (5.2) (79.2) (13.9) (11.7) (1.85) 22/08/07 3/9 8/9 6/ /10/07 3/50 (6) 23/11/07 1/51 (2.0) 07/02/07 2/46 (4.3) ** first screening on the whole herd 27/50 (54) 7/22 (31.81) 2/20 (10) 4/20 (20) 27/ (53.9) 23/46 8/21 0/20 1/20 (50) (38,1) (0) (5)

28 Table 2: results of the tests conducted on 20 cows (10 positives and 10 negatives) selected after the first screening No. positives/total examined Sampling date CFT ELISA Milk PCR Faeces Vaginal swabs positives negatives positives negatives positives negatives positives negatives positives negatives 01/08/07 4/10 0/10 10/10 0/10 4/10 0/10 1/10 0/10 0/10 0/10 22/08/07 3/8 -- 7/8 -- 6/ /10/07 3/10 0/10 10/10 0/10 5/10 1/10 1/10 1/10 3/10 2/10 23/11/07 1/10 0/10 10/10 1/ /02/08 2/10 0/10 9/10 1/10 4/10 0/10 0/10 0/10 1/10 0/10

29 Sierologia: FDC conferma bassa sensibilità ma anche alta specificità e riproducibilità nel tempo (variazione titoli da 1:64 a 1:128). Gli animali FDC positivi sono stati ripetutamente classificati come escretori. ELISA più sensibile, la positività si mantiene nel tempo (tranne 1 caso), e si rilevano 4 sieroconversioni. Manca una relazione con escrezione. Presenza sporadica di escretori sieronegativi. Real-time PCR: ha permesso di identificare i nuovi escretori. Prevalenza di eliminazione con il latte, ma osservata anche in muco vaginale e feci. Nessun animale elimina nelle 3 vie in contemporanea.

30 Azienda di vacche da latte con casi di aborto e disordini riproduttivi Capi esaminati per Coxiella burnetii mediante 2 test sierologici: ELISA indiretta e FDC. Il latte individuale di ogni vacca in lattazione testato in Real-time PCR; sulla base dei valori Ct, gli animali sono stati classificati in forti (Ct 31) e deboli (Ct>31) eliminatori

31 Esito sierologico Classi di età ELISA* < 3 anni 3-5 anni > 5 anni Totale Negativi Positivi Totale complessivo Mandria suddivisa in 3 classi d età (<3 anni, 3-5 anni, >5 anni), e le vacche in lattazione in 2 classi (<5 anni e 5 anni). Ct Classi di età < 5 anni 5 anni Totale 31 (forti eliminatori) > 31 (deboli eliminatori) Totale complessivo

32 Correlazione significativa tra età e prevalenza sierologica, e tra età e status di forte eliminatore. Risultati biomolecolari e sierologici a confronto: la condizione di forte eliminatore è correlata ad una sierologia positiva. PCR + PCR PCR + / Totale Ct 31 Ct > 31 su latte su latte totale (%) L utilizzogruppo combinato 1: sierologicamente di ELISA ed FDC è d aiuto , negativi nell identificazione dei forti eliminatori, riducendo il Gruppo 2: sierologicamente , positivi numero di PCR necessarie allo stesso scopo e quindi i costi di gestione

33 Sieroprevalenza Piano Aborti ELISA: positivi 18, 5% (65/351) FDC: 1,4% (5/353) Totale Triveneto ELISA: positivi 15,6% (994/6384) FDC: 0,7% (44/6384) Positivi a entrambi: 0,6% (39/6384)

34 PCR Piano Aborti: positivi 2,9% (10/344) Probabilmente sottostimata (poche placente) Totale Triveneto: Campioni positivi 12.3% (102/829) Gruppi di animali con almeno una positività 31,6% (102/323) Sovrastimato (esami ad hoc)

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