Biologia Molecolare Computazionale

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1 Biologia Molecolare Computazionale Paolo Provero - paolo.provero@unito.it

2 Argomenti Allineamento di sequenze Ricostruzione di alberi filogenetici Gene prediction

3 Allineamento Allineamento di sequenze 1. Scoring 2. Algoritmi esatti (programmazione dinamica) 3. Algoritmi euristici (BLAST) 4. Allineamento multiplo

4 Allineamento di sequenze Problema Date due sequenze (nucleotidiche, aminoacidiche o altro) determinare se sono sufficientemente simili da farci ritenere che siano derivate da un progenitore comune attraverso processi di mutazione.

5 Allineamento Un esempio di allineamento delle sequenze CGGGTATCCAA e CCCTAGGTCCCA è C G G G T A - - T C C A A C C C - T A G G T C C C A Il simbolo - (indel) rappresenta un inserzione o una delezione avvenuta durante la storia evolutiva che ha portato alle due sequenze Una sequenza di L indel consecutivi si dice gap di lunghezza L: questo allineamento ha un gap di lunghezza 1 e uno di lunghezza 2

6 Tipi di allineamento Globale: si allineano le sequenze intere Locale: si allineano sottosequenze delle sequenze di partenza Gapped: sono permessi indels Ungapped: non sono permessi indel Pairwise: di due sequenze Multiple: di più di 2 sequenze

7 Score di un allineamento Due possibili allineamenti di CTGTA e CGTA C T G T A 1. C - G T A 2. C T G T A - - C - G T A Il primo è migliore in quanto richiede un numero minore di cambiamenti (sostituzioni e inserzioni/delezioni) E necessario definire uno score per confrontare quantitativamente gli allineamenti

8 Scoring per allineamenti di sequenze nucleotidiche Per il momento adottiamo uno score semplice: Ogni match conta +1 Ogni mismatch conta -1 Ogni indel conta -2 Esempio 1: C T G T A C - G T A Esempio 2: C T G T A - - C - G T A

9 Algoritmi di allineamento Gli algoritmi di allineamento risolvono il seguente problema: dato un sistema di scoring e due sequenze, trovare l allineamento (gli allineamenti) con lo score più alto tra tutti quelli possibili Gli algoritmi esatti individuano certamente il migliore allineamento, ma richiedono molte risorse di calcolo 1. Needleman-Wunsch: global gapped alignments 2. Smith-Waterman: local gapped alignments Gli algoritmi euristici non garantiscono che l allineamento trovato sia il migliore possibile, ma sono molto più veloci 1. BLAST (gapped or ungapped local alignments)

10 Perché abbiamo bisogno di algoritmi? In linea di principio sarebbe possibile trovare l allineamento ottimale di due sequenze semplicemente: 1. Scrivere tutti gli allineamenti possibili 2. Calcolare il relativo score 3. Scegliere il migliore Tuttavia questo è possibile soltanto per sequenze molto corte, in quanto il numero di allineamenti possibili cresce molto rapidamente al crescere della lunghezza della sequenza

11 Perchè abbiamo bisogno di algoritmi Supponiamo di avere due sequenze di n = 1000 residui Il numero di allineamenti possibili è N = ( ) 2n 22n = n πn 1000π

12 Programmazione dinamica Gli algoritmi di programmazione dinamica suddividono il problema iniziale (trovare l allineamento ottimale di due sequenze) in sottoproblemi più semplici e costruiscono progressivamente la soluzione del problema globale usando le soluzioni dei sottoproblemi L algoritmo di Needleman-Wunsch calcola lo score dell allineamento ottimale di due sequenze in base agli score degli allineamenti ottimali delle loro sottosequenze, progressivamente più lunghe

13 Algoritmo di Needleman-Wunsch Sequenze: x = X 1 X 2... X m y = Y 1 Y 2... Y n L algoritmo costruisce la matrice B tale che B ij è lo score dell allineamento ottimale tra le prime i lettere di x e le prime j lettere di y I valori di B ij vengono calcolati progressivamente fino a ottenere B mn, che è lo score dell allineamento ottimale tra x e y

14 Algoritmo di Needleman-Wunsch L algoritmo di Needleman-Wunsch si basa sul fatto seguente: se si conoscono B i 1,j, B i,j 1 e B i 1,j 1 è possibile calcolare B ij Una volta ottenuto lo score dell allineamento ottimale il traceback consente di ottenere l allineamento o gli allineamenti corrispondenti

15 Esercizio Trovare un allineamento globale ottimale tra le sequenze CATT GAATCT Soluzione: score -2 Allineamento (non l unico): C - A T - T G A A T C T

16 Algoritmo di Smith-Waterman L algoritmo di Smith-Waterman trova l allineamento locale ottimale tra due sequenze, ovvero l allineamento di score più alto tra tutti quelli possibili tra una qualsiasi sottosequenza di x e una qualsiasi sottosequenza di y L algoritmo procede in modo simile a Needleman-Wunsch eccetto che: 1. Ogni volta che B ij è negativo, si scrive 0 2. Il traceback non parte da B mn ma dallo score più alto trovato sulla tabella

17 Esercizio Trovare un allineamento locale ottimale tra le sequenze CATT GAATCT Soluzione: score 2 Allineamento: A T A T

18 Gap penalties Il tipo di gap penalty che abbiamo usato si chiama lineare: la penalty (score negativo) associata a un gap è proporzionale alla lunghezza del gap: δ(l) = d L Un altro tipo di gap penalty usato spesso si chiama affine: δ(l) = d (L 1) e con e < d. In questo modo aprire un nuovo gap è più penalizzato che allungarne uno esistente

19 Gap penalty affine: esempio Esempio: d = 2, e = 1 A C C C T A - - C T A C C C T A - C - T

20 Allineamento di sequenze aminoacidiche Nel caso di allineamento di sequenze di aminoacidi, un sistema di scoring come quello usato per le sequenze nucleotidiche non è adeguato, in quanto alcune sostituzioni sono più probabili di altre Quindi i mismatch avranno score diversi a seconda degli aminoacidi coinvolti (matrici di sostituzione) Gli algoritmi di allineamento funzionano nello stesso modo, eccetto che lo score per un match/mismatch varia a seconda degli aminoacidi coinvolti Le matrici di sostituzione più usate sono BLOSUM e PAM

21 Esercizio Usare le matrici di sostituzione BLOSUM62 e una linear gap penalty uguale a -5 per trovare un allineamento ottimale globale tra le sequenze HAG HEAE Soluzione: score 5 Allineamento: H - A G H E A E

22 BLAST Algoritmo euristico per allineare Query sequence vs target sequence Query sequence vs sequence database Versione originale: ungapped alignments. BLAST2: gapped alignments.

23 BLAST steps (simplified) 1. Generare una lista di tutte le parole di k (p.es. k = 3 per proteine) lettere nella query PQGEFG (PQG, QGE, GEF, EFG) 2. Per ognuna di queste generare una lista di tutte le possibili parole di 3 lettere che allineate danno un punteggio maggiore di una soglia T (p.es. T = 13 con BLOSUM62) PQG PQG (18) PEG (15) Cercare nella sequenza target queste parole ed allinearle alla parola della query 4. Estendere in modo massimale gli allineamenti nelle due direzioni (ottenendo gli High Scoring Pairs) 5. Se possibile unire gli HSP per ottenere allineamenti più lunghi.

24 BLAST

25 Grafi Un grafo è un insieme di nodi e di archi Ogni arco unisce due nodi Un cammino tra il nodo n e il nodo m è una successione di archi consecutivi che porta da n a m Un circuito è un cammino tra un nodo e se stesso Un grafo è connesso se per ogni coppia di nodi (n, m) esiste un cammino tra n e m

26 Alberi Un grafo connesso e privo di circuiti si dice albero Dati due nodi di un albero, esiste uno e un solo cammino che li unisce Un albero si dice binario senza radice se ogni nodo è connesso a uno o tre archi Un albero si dice binario con radice se ogni nodo è connesso a uno o tre archi, tranne un unico nodo, la radice, che è connesso a due archi I nodi connessi a un solo arco si dicono foglie

27 Ricostruzione di alberi filogenetici Problema: dato un insieme di specie attualmente esistenti ricostruire l albero filogenetico che riproduce il percorso evolutivo attraverso il quale esse sono derivate da un antenato comune L albero filogenetico è rappresentato da un albero binario, con o senza radice La lunghezza degli archi è proporzionale al tempo trascorso tra gli eventi di speciazione Le specie esistenti sono rappresentate dalle foglie La radice, se specificata, rappresenta l antenato comune Se l albero filogenetico è senza radice, non è specificata la direzione del tempo evolutivo tra nodi interni

28 Ricostruzione di alberi filogenetici Distance methods Parsimony methods Statistical methods

29 Distanze Una distanza è una regola per associare a ogni coppia (x, y) di punti di un insieme S un numero d(x, y) 0 tale che 1. d(x, y) = 0 se e solo se x = y 2. d(x, y) = d(y, x) 3. d(x, y) + d(y, z) d(x, z) Per esempio la distanza geometrica tra punti di un piano soddisfa questi assiomi

30 Distanza evolutiva La distanza evolutiva tra due specie esistenti si può definire come il doppio del tempo trascorso dal loro antenato comune più recente E facile convincersi che questa definizione soddisfa gli assiomi che definiscono una distanza Se si considera un albero filogenetico con radice, la distanza evolutiva tra le specie x e y è proporzionale alla lunghezza del cammino tra x e y

31 Distanza ultrametrica La distanza evolutiva ha la seguente proprietà: dati tre punti x, y, z e le tre distanze tra di essi, due di queste sono uguali tra loro e maggiori della terza Una distanza che soddisfi queste proprietà si dice ultrametrica

32 Metodi basati sulle distanze Vedremo due metodi basati sulle distanze: 1. UPGMA: ricostruisce alberi filogenetici con radice 2. Neighbor joining: ricostruisce alberi filogenetici senza radice L algoritmo UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages) permette di risolvere il problema seguente: dato un insieme di specie esistenti e le loro distanze evolutive, ricostruire l albero filogenetico con radice che ne rappresenta l evoluzione da un antenato comune

33 UPGMA 1. Individuare le due specie più vicine tra le N esistenti 2. Definire un nuovo nodo come loro antenato comune, ponendolo all altezza uguale a metà della distanza tra i due nodi 3. Eliminare le due specie dalla lista e sostituirle con l antenato comune 4. Ripetere con la nuova lista di N 1 specie 5. Ripetere fino a che la lista contiene una sola specie (la radice = antenato comune) 6. Si può dimostrare che il metodo riproduce l unico albero filogenetico con radice che riproduce le distanze evolutive

34 Distanza tra gruppi Per calcolare la distanza tra nodi interni si usa la formula d(a, B) = 1 n A n B x A;y B d(x, y)

35 Esempio Le distanze evolutive tra 4 specie sono date nella tabella seguente (Mya) Human Chimp Bonobo Gorilla Human Chimp Bonobo Gorilla Verificare la proprietà ultrametrica Ricostruire l albero filogenetico con radice usando UPGMA

36 UPGMA in pratica In pratica le distanze evolutive in genere non sono note Si usano allora distanze surrogate, chesi suppone siano approssimativamente proporzionali alle distanze evolutive Le distanze surrogate in genere non sono ultrametriche La conseguenza è che le distanze calcolate sull albero così prodotto non sono uguali alle distanze in input

37 Esempio Considerare la matrice di distanza tra 3 specie: A B C A B C Mostrare che si tratta di una matrice di distanza Mostrare che questa distanza non è ultrametrica Costruire l albero filogenetico con radice usando UPGMA e calcolare le distanze sull albero Mostrare che queste distanze sono ultrametriche e che non coincidono con quelle in input

38 Neighbors Dato un albero filogenetico senza radice, due foglie si dicono neighbors se il cammino che le unisce passa per un solo nodo interno Notare che non è necessariamente vero che il neighbor di una specie è la specie più vicina nel senso della distanza calcolata sull albero

39 Tree-derived distances Data una matrice di distanze il metodo del neighbor joining costruisce l albero unrooted che riproduce le distanze date, se questo esiste Una distanza per la quale esista tale albero si dice tree-derived o additive Una distanza ultrametrica è tree-derived, ma l opposto non è necessariamente vero

40 δ(x, y) Supponiamo di avere una matrice di distanze d(x, y) tra specie Definiamo la quantità δ(x, y) = (N 4)d(x, y) (d(x, n) + d(y, n)) n x,y Se x e y sono tali che la δ(x, y) è minima, allora x e y sono neighbors

41 Neighbor joining Calcolare la matrice delle δ Unire la coppia di specie con il delta più piccolo attraverso un nodo interno r 1 con le distanze d(x, r 1 ) = d(x, n) d(y, n) + d(x, y) 2 d(y, n) d(x, n) + d(x, y) d(y, r 1 ) = 2 dove n è un altra foglia qualsiasi Sostituire x e y con r 1. La distanza tra r 1 e le altre foglie è data da d(r 1, n) = d(x, n) + d(y, n) d(x, y) 2 Ripetere fino a che non si ricostruisce l intero albero

42 Esempio x y Calcolare le distanze tra le foglie dell albero rappresentato in figura Applicare l algoritmo "neighbor joining" alle distanze calcolate e mostrare che l albero ottenuto riproduce quello di partenza z 5 4 w

43 Rooting E possibile localizzare la radice di un albero ottenuto con neighbor-joining aggiungendo un outgroup (specie che si sa essere più distante dalle altre di quanto queste siano tra loro) La radice dell albero originario coincide con il punto da cui si diarma l outgroup.

44 Esempio Costruire l albero unrooted di 3 specie dalle seguenti distanze: A B C A B C Localizzare la radice usando l outgroup D, con distanze d(d, A) = 12 d(d, B) = 11 d(d, C) = 14

45 Maximum Parsimony Trovare l albero che spiega la discendenza delle specie esistenti da un antenato comune con il minimo numero di mutazioni. Per semplicità ci limiteremo a considerare sostituzioni Esempio: le specie esistenti sono rappresentate dalle seguenti sequenze: AAG AAA GGA AGA

46 Costo di un albero 1 0 AAA 0 AAA 1 1 Cost = 3 AGA AAA 1 AAA 0 0 Cost = 4 AAA 2 AAG AAA GGA AGA AAG AGA AAA GGA Elencare i possibili alberi Calcolare il costo per ogni albero Scegliere l albero di costo minore

47 Alberi possibili Gli alberi si distinguono per Topologia Assegnazione delle specie esistenti alle foglie Assegnazione di sequenze ai nodi intermedi

48 Topologie per 4 specie

49 Assegnazioni per 4 specie A B C D A C B D A D B C A B C D B A C D B C A D B D A C A C B D C A B D C B A D C D B A D A C B D B A C D C A B A D C D

50 Numero di alberi Il numero di assegnazioni (sommato su tutte le topologie) è Esempio: per N = 4 (2N 3)! 2 N 2 (N 2)! (2N 3)! 2 N 2 (N 2)! = 5! 4 2! = 15 Questo numero diventa rapidamente molto grande: per N = 10: 17! 2 8 8! = Con metodi euristici si può usare parsimony anche per centinaia di specie

51 Allineamenti multipli: SP scores Il modo più comune di assegnare uno score a un allineamento multiplo è un Sum of Pairs (SP) score: Lo score totale è la somma degli score delle singole colonne: S = S i i Lo score di una colonna è la somma degli score di tutte le coppie di simboli (usando una matrice di sostituzione appropriata) S i = s(mi k, mi l ) k<l Gaps (linear gap penalty): s(, a) = d s(, ) = 0

52 Esempio match = 1, mismatch = -1, d = -2 A A C G A A C T A - C T A G C T =5

53 SP scores: problema A A C T G G A A C T G G A A C A G G A A C T G G A A C T G G =52 Per N sequenze una colonna di T vale N(N 1) 2 Un singolo mismatch costa N 1 Costo relativo di un singolo mismatch: 2/N: decresce all aumentare di N Over-counting of evolutionary events

54 Algoritmi per l allineamento multiplo Esistono algoritmi di programmazione dinamica per l allineamento multiplo, ma sono utilizzabili solo per N piccolo Tra gli algoritmi euristici i più comuni sono gli algoritmi di allineamento progressivo: Allineare due sequenze Allineare una terza sequenza all allineamento ottenuto Continuare ad aggiungere una sequenza alla volta all allineamento

55 Algoritmo di Feng-Doolitle 1. Trovare tutti gli N(N 1)/2 pairwise alignments delle N sequenze 2. Costruire un albero filogenetico usando come distanza una funzione dello score dei pairwise alignments 3. Allineare le due sequenze evolutivamente più vicine 4. Allineare gli altri nodi dell albero nell ordine i cui sono stati aggiunti all albero Per allineare due insiemi di sequenze, calcolare tutti i pairwise alignments e usare il migliore

56 Esempio Usando lo scoring: match = 1; mismatch = -1; gap=-2 allineare AAG, ATG, AA : A A G A T G A A =-1

57 Applicazione: Positional Weight Matrices Siti di legame di TF: Brevi sequenze di DNA ( 6 15 bps) Non completamente conservate Una descrizione possibile è la sequenza consensus, ricavabile da un allineamento multiplo di siti di legame noti: IUPAC codes: Y = pyrimidine (C or T) W = T or A A C C G G T A C T G G T - C T G G A A C C G G T A C Y G G W

58 Positional Weight Matrices Una descrizione più accurata è data dalla PWM: A C C G G T A C T G G T - C T G G A A C C G G T A C Y G G W n A C G T

59 Ricerca di TFBS con PWM Le PWM possono essere usate per identificare potenziali binding sites di TFs: Considerare le sequenze regolatrici dei geni di interesse (promotore, primi introni,...) Fare scorrere la PWM sulla sequenza calcolando uno score a ogni posizione Lo score esprime la somiglianza tra la sequenza e la matrice

60 Log-likelihood ratio Un sistema di scoring usato in pratica è il seguente: data una PWM M e una sequnenza S: dove S = log 2 P(S M) P(S B) P(S M) è la probabilità di generare S a partire da M P(S B) è la probabilità di generare S a partire dalle (appropriate) frequenze nucleotidiche di background

61 Esempio S = ACTGGA n A C G T P(S M) = = 1 8 ( ) 6 1 P(S B) = = 2 12 = P(S M) P(S B) = = 2 9 score = 9 (N.B. per evitare problemi con log(0) si aggiungono pseudocounts per le basi che non compaiono mai in ciascuna posizione)

62 Ricerca di TFBS Ogni volta che la sequenza supera un certo score minimo deciso a priori, la si identifica come un candidato TFBS Problema: in genere si trovano troppi candidati: PWM di lunghezza 6 Accettiamo solo il massimo score possibile (1 sola sequenza) Su sequenze casuali, otteniamo un candidato ogni 4 6 = 4, 000 basi Sul genoma umano, ci aspettiamo candidati semplicemente per caso

63 Soluzioni 1. Spesso i TFBS funzionali sono ripetuti nella regione regolatrice Selezionare soltanto le regioni regolatrici in cui il numero di candidati è significativamente più alto di quanto ci si aspetta per caso 2. Spesso i TFBS funzionali sono evolutivamente conservati Selezionare soltanto i candidati TFBS che si ritrovano in altre specie